外源水楊酸對棉花相關(guān)抗蟲酶活性誘導的時間和濃度效應(yīng)

王燕芳+吳瑛

摘要：采用噴霧方法，初步探討外源水楊酸對棉葉總酚和抗蟲酶活性的誘導作用，結(jié)果表明，在適度濃度和時間范圍內(nèi)，水楊酸（SA）能明顯誘導棉葉中總酚含量、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）活性和胰蛋白酶抑制力（TI） 活性的增加;5 mmol/L 水楊酸處理后4 d對棉葉總酚含量、PAL活性和胰蛋白酶抑制力的誘導作用最為顯著，水楊酸5 mmol/L處理后2 d和0.5 mmol/L 處理后4 d對棉葉PPO活性的誘導效果最優(yōu);隨著水楊酸處理時間的延長，水楊酸誘導棉葉總酚含量和抗蟲酶（PAL、PPO、TI）活性具有先升高后降低隨后又升高的特點。這說明外源水楊酸能在一定程度上提高棉花抗蟲相關(guān)的物質(zhì)和酶活性以達到抗蟲目的。

關(guān)鍵詞：水楊酸;棉花;總酚;抗蟲酶;總酚含量;苯丙氨酸解氨酶;多酚氧化酶

中圖分類號： S562.01 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0138-03

收稿日期：2014-09-25

基金項目：國家自然科學基金（編號：20867005）。

作者簡介：王燕芳（1989—），女，山西忻州人，碩士，從事外源激素對棉花病蟲害防治研究。E-mail：819710681@qq.com。

通信作者：吳 瑛，教授，從事化學教學與研究。E-mail：wuyingjuyuan@163.com。

水楊酸（SA）作為植物的一種重要信號分子，能激活植物超敏反應(yīng)，誘導病程相關(guān)蛋白基因（PR）的表達，使植物產(chǎn)生系統(tǒng)性防御，增強其抗病能力。有研究表明，水楊酸在誘導抗蟲方面也有重要作用[1-2]，如楊扇舟蛾取食受水楊酸甲酯（MeSA）熏蒸后的黑楊葉片后，成蟲對食物的消化吸收降低、發(fā)育歷程延長、死亡率增加[3];利馬豆遭二斑葉螨取食后，會釋放一種含有MeSA的揮發(fā)物以吸引二斑葉螨的天敵智利捕食螨，從而起到間接抗蟲作用[4]。 植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物含量和防御酶活性的變化是植物抗蟲過程中的重要表現(xiàn)，具有重要的防衛(wèi)功能[5]。目前，關(guān)于棉花在外源水楊酸誘導作用下的相關(guān)抗蟲生理生化防御研究比較少，本試驗從植物生理生化防御角度出發(fā)，探討外源水楊酸不同濃度和作用時間下棉花體內(nèi)相關(guān)抗蟲酚類次生代謝產(chǎn)物和蛋白酶活性的變化，以明確外源水楊酸對棉花的抗蟲誘導作用機制，為水楊酸在棉花生產(chǎn)上的科學利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

試供棉花種子中棉40，由新疆維吾爾自治區(qū)阿拉爾市農(nóng)業(yè)科學研究所提供。將大小均勻且飽滿的種子撒播于10 cm×15 cm的塑料花盆中，每盆播種10粒，放置于重點實驗室組培室中培養(yǎng)，試驗用土為黃壤、蛭石、草木灰，按照 2 ∶ 2 ∶ 1 配比，經(jīng)高溫滅菌、晾曬。棉花生育期確保有適宜的濕度和溫度、無病蟲害，光照時間為18 h/d。棉花1～2片真葉期間苗，留苗4株/盆;待長至4～5片真葉期，葉面噴施含有1% Tween20和6%乙醇的不同濃度水楊酸，分別為0.05、0.5、5 mmol/L，以含1%Tween20、6%乙醇的水溶液為對照（CK），直至水珠落下為準，透明塑料袋套袋，12 h后摘除;在噴施后0、2、4、6、8 d分別剪取真葉葉片，液氮封存，待測。每處理重復(fù)3次。

1.2 測定方法

酚酸含量的測定[6]：稱取0.1 g鮮葉，加入3 mL 95%乙醇研磨成勻漿;加入5 mL乙醇潤洗，定容至10 mL，2 500 r/min 離心5 min，取上清液得粗提液;移取1.25 mL粗提液到10 mL具塞試管中，加1 mL福爾馬林試劑搖勻，靜置4～5 min;加2 mL 10%Na2CO3，置75 ℃水浴鍋中保溫 10 min，分光光度計于765 nm處比色。

多酚氧化酶（PPO）活性的測定[7]：稱取鮮葉0.1 g，加入含7% PVP、濃度為0.1 mmol/L、pH值為7.4的磷酸緩沖液2.5 mL，于冰浴中研磨成勻漿;4 ℃下 5 500 r/min離心10 min，上清液即為酶液;移取0.1 mmol/L鄰苯二酚1.5 mL、酶液05 mL和磷酸緩沖液1 mL，420 nm處比色，測定2 min內(nèi)吸光度的變化。

苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的測定[8]：稱取0.1 g鮮葉，加2.5 mL預(yù)冷的0.05 mmol/L、pH值為7.8的 Tris-HCl緩沖液和0.02 g PVP，于冰浴中研磨;4 ℃下 5 500 r/min離心 10 min;取0.2 mL上清液于5 mL試管中，加入3.8 mL Tris-HCl緩沖液和1 mL 0.6 mmol/L苯丙氨酸，40 ℃水浴1 h;加 0.2 mL 6 mmol/L HCl終止反應(yīng)，290 nm處測吸光度。

胰蛋白酶抑制力（TI）活性的測定[9]：稱取0.1 g鮮葉，加2 mL Tris-HCl緩沖液，冰浴研磨成勻漿;4 ℃ 下5 000 r/min離心10 min;取0.1 mL上清液和0.02 mL胰蛋白酶抑制液混合，25 ℃水浴30 min;取0.1 mL水浴后的混合液與2.9 mL BAEE進行反應(yīng)，256 nm處測定吸光度的變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20軟件單因素多重比較法，分析水楊酸對棉葉相關(guān)抗蟲酶活性誘導效應(yīng)的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 水楊酸對棉葉總酚含量的誘導效應(yīng)

由圖1可見，隨著處理后時間的延長，棉葉總酚含量呈現(xiàn)上升趨勢，處理后4 d時棉葉總酚含量達到最大值，顯著高于對照，其中，5 mmol/L 水楊酸處理的棉葉總酚含量均顯著高于其他濃度處理（P<0.05），是CK的1.55倍;處理后6 d，總酚含量降到最低，除5 mmol/L 水楊酸外，各濃度處理均低于對照;處理后8 d，棉葉總酚含量迅速回升，0.5 mmol/L和 5 mmol/L 水楊酸處理的棉葉總酚含量均顯著高于CK。經(jīng)單因素多重比較分析可得，除處理后0 d和2 d之間無顯著性差異（P=0.087）外，處理后其他時間的總酚含量均差異顯著;0.05 mmol/L 水楊酸與CK處理后的總酚含量無顯著性差異（P=0763）。水楊酸能明顯誘導棉葉總酚物質(zhì)的產(chǎn)生，處理后4 d，5 mmol/L 水楊酸處理對棉葉總酚含量的誘導作用最大。endprint

2.2 水楊酸對棉葉PAL活性的誘導效應(yīng)

由圖2可見，水楊酸處理后的棉葉，體內(nèi)PAL活性在 0～4 d 內(nèi)迅速增大，4～6 d驟降，6～8 d PAL活性又大幅回升;處理后4 d，隨著水楊酸處理濃度的升高，棉葉PAL活性不斷增大，且均顯著高于CK（P<0.05），其中，5 mmol/L 水楊酸處理的棉葉PAL活性最大，是CK的2倍;水楊酸處理后6～8 d，0.5 mmol/L 處理的棉葉PAL活性迅速升高，8 d 時PAL活性最大，與其他處理均有顯著性差異，較CK增加40.65%。經(jīng)單因素多重比較分析可得，棉葉PAL活性的時序變化差異顯著（P<005），各處理濃度間棉葉PAL活性差異顯著，均高于CK。

2.3 水楊酸對棉葉PPO活性的誘導效應(yīng)

由圖3可見，不同濃度水楊酸處理的棉葉，體內(nèi)PPO活性在0～4 d迅速升高，4～6 d活性驟降，而后稍有回升;處理后2 d，除0.05 mmol/L 水楊酸處理外，其他濃度處理均顯著高于CK，其中5 mmol/L 水楊酸處理的棉葉PPO活性最大，是CK的1.63倍;處理后4 d，各處理棉葉PPO活性均顯著高于CK，0.5 mmol/L 水楊酸處理的棉葉，其PPO活性顯著高于其他濃度，0.05 mmol/L與5 mmol/L 水楊酸處理的棉葉PPO活性無顯著差異（P>0.05）;處理后6 d，棉葉體內(nèi)PPO活性均明顯低于CK;處理后8 d，0.5 mmol/L和5 mmol/L 水楊酸處理的棉葉體內(nèi)PPO活性均顯著高于CK。經(jīng)單因素多重比較可得，水楊酸處理后2～4 d，棉葉PPO活性無顯著性差異（P=0.087），處理后0 d和6 d，棉葉內(nèi)PPO活性也無明顯差異（P=0.163）;0.05 mmol/L 水楊酸與CK處理對棉花PPO活性的誘導作用無明顯差異（P=0.838）。5 mmol/L 水楊酸處理后2 d和0.5 mmol/L 水楊酸處理后4 d對棉葉PPO活性的誘導效果最為明顯。

2.4 水楊酸對棉葉TI的誘導效應(yīng)

由圖4可見，不同濃度水楊酸處理后，棉葉中TI活性在 0～2 d 緩慢增加，均顯著高于CK，但各濃度間對棉葉TI的誘導效果無明顯差異;處理后4 d，各濃度處理對棉葉體內(nèi)TI活性的誘導效應(yīng)最為明顯，其中，5 mmol/L 水楊酸處理對棉葉TI活性的誘導效果優(yōu)于CK和其他濃度處理，但0.05 mmol/L和 0.5 mmol/L 水楊酸處理間無明顯差異（P>0.05）;處理后4～6 d，水楊酸對棉葉TI活性的誘導效應(yīng)降低，除 0.05 mmol/L 外，其他濃度處理的棉葉TI濃度均顯著高于CK;處理后8 d，水楊酸對棉葉TI活性的誘導效應(yīng)有所回升，0.05、0.5 mmol/L 水楊酸處理對TI活性的誘導效果最為明顯，5 mmol/L 水楊酸處理的棉葉體內(nèi)TI活性與CK無顯著差異。經(jīng)單因素多重比較分析可得，處理后不同時間對棉葉體內(nèi)TI活性的誘導效應(yīng)差異顯著，處理后4 d對TI的誘導效應(yīng)最為明顯;不同濃度的水楊酸處理，對棉葉TI活性的誘導效應(yīng)明顯高于CK，5、0.5 mmol/L 水楊酸處理對棉葉TI活性的誘導效果最為明顯，且兩者無顯著差異（P=0.405）。

3 結(jié)論與討論

Thulke等報道認為，水楊酸能激活植物局部幾種防御反應(yīng)，誘導植物體內(nèi)苯酚類有毒物質(zhì)的積累，而且還會誘導植物體內(nèi)POD和甘露醇脫氫酶基因的表達[10]。周瑩等研究結(jié)果表明，水楊酸在抵御生物脅迫過程中，會激發(fā)植物體內(nèi)細胞壁的交聯(lián)和木質(zhì)化，PPO、PAL、POD等酶活性的表達[11]。另有研究表明，外源水楊酸會明顯提高擬南芥葉片POD和PAL活性，同時也能誘導番茄幼苗葉片中PPO活性的升高[12-13]。本試驗結(jié)果表明，棉花經(jīng)水楊酸處理后，在一定作用時間和濃度范圍內(nèi)，會明顯誘導棉葉中總酚含量、PAL活性、PPO活性和TI活性的增加，這與前人研究結(jié)論[10-13]吻合。

隨著水楊酸處理時間的延長，棉葉中總酚含量、防御酶活性（PAL、PPO）和TI活性具有先升高后降低隨后又有所回升的特點;高濃度水楊酸處理對棉葉防御功能的誘導效果優(yōu)于低濃度，總體表現(xiàn)為5 mmol/L水楊酸處理的棉葉，4 d后對棉葉次生代謝、防御酶活性和蛋白酶抑制劑活性的誘導效果最好，這與張永軍等的研究結(jié)果[14]類似，這可能與植物在防御過程中的“閾值”有關(guān)?？梢?，外源水楊酸適宜的濃度和處理時間，能明顯提高棉葉防御物質(zhì)的含量和防御酶活性。

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