石榴蜜中多酚類成分測定及其抗氧化活性的研究

譚洪波+王麗華++張紅城++吳黎明

摘要：利用固相萃取-高效液相色譜研究了6個石榴蜜樣品中多酚類成分含量，以及石榴蜜對DPPH 自由基的清除作用，通過ORAC法測定其抗氧化能力，并對其還原力進行測定。結果表明，石榴蜜的總酚含量在 29.28～37.25 mg/100 g 之間，總黃酮含量在 2.31～2.47 mg/100g，其中酚酸含量較高的樣品1和樣品2抗氧化能力較強。石榴蜜各樣本中均含脫落酸、木樨草素及芹菜素3種酚類化合物。同時，所有石榴蜜樣品均具有一定的抗氧化活性，與總酚含量呈現(xiàn)量效關系，呈正相關。

關鍵詞：石榴蜜；總酚；總黃酮；抗氧化活性

中圖分類號： S896.1；R284.1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）08-0179-04

蜂蜜是指蜜蜂采集蜜源植物的花蜜、分泌物或蜜露，并與自身分泌物混合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質[1]，是公認的具有多種生物學活性的天然食品[2]。近年來對蜂蜜的研究主要集中在各種活性成分及抗氧化等活性能力方面。多酚類成分是蜂蜜中的重要活性物質之一，包括黃酮、單寧、酚酸及其衍生物等[3]。酚酸是蜂蜜中的主要多酚類化合物，具有抗氧化等多種保健功能[4]。黃酮類化合物具有抗氧化、抗癌、抗菌、抗炎[5]等生物學活性。由于蜂蜜蜜源植物的不同，蜂蜜中的酚酸和黃酮類化合物的含量和種類也有很大差異。

石榴樹（Punica granatum L.）為石榴蜜蜜源，是桃金娘目石榴科石榴屬多年生落葉喬木或灌木。石榴在全國部分地區(qū)有分布，可食用的名品有安徽淮北百子糖石榴、山東棗莊軟子石榴、陜西臨潼石榴、廣西胭脂紅石榴、四川青皮石榴以及云南蒙自青殼石榴等。云南省地理氣候特征獨特又復雜，區(qū)域差異非常明顯，在此條件下孕育出了極其豐富的蜜源植物。云南省一年四季如春，花開不斷，養(yǎng)蜂條件優(yōu)越，出產(chǎn)的蜂蜜品種較多，但關于該地區(qū)石榴蜜中酚酸、黃酮類化合物含量的報道較少。本研究測定 6 個云南石榴蜜樣品中多酚類成分的含量，并對其抗氧化活性進行研究，旨在發(fā)現(xiàn)石榴蜜的保健功能，以期為開發(fā)云南的特色蜂蜜提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料與試劑

1.1.1樣品6個石榴蜜樣品均為2015年產(chǎn)自云南省，1、2號蜜樣采自蒙自縣；3、4號蜜樣采自巧家縣；5、6號蜜樣采自建水。樣品采集后均置于4 ℃冰箱保存。

1.1.2試劑三氯化鐵、三氯乙酸、鐵氰化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、亞硝酸鈉、鄰苯三酚、碳酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁、魯米諾等均為分析純，均購自北京化學試劑公司；1，1-二苯基-2-苦基苯肼DPPH，熒光素鈉（sodium fluorescein），6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchr- oman-2-carboxylic acid trolox，2，2，-azobis（2-methylpropionamidine） dihydrochloride ABAP均購自美國Sigma公司；甲醇購自美國Fisher公司；沒食子酸（98%）、脫落酸、蕓香苷對照品購自上海佳和生物科技有限公司；木樨草素、芹菜素購自四川成都生物技術有限公司；乙酸購自J.T Baker公司；Strata-X-A固相萃取柱（60 mg/3 mL）購自廣州菲羅門科學儀器有限公司。

1.1.3主要儀器與設備微量移液器，購自德國Eppendorf公司；AL204型分析天平，購自梅特勒-托利多儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵，購自長城科工貿(mào)有限公司；DZF-6090型真空干燥箱，購自科學儀器有限公司；超純水系統(tǒng)，購自Merk Millipore公司；KQ-50DB型數(shù)控超聲波清洗器，購自超聲儀器有限公司；HZS-H型水浴搖床，購自東明醫(yī)療儀器廠；24孔固相萃取裝置，購自美國Supelco公司；恒溫水浴氮吹儀，購自北京科林工貿(mào)有限公司；SY21-K型電熱恒溫水浴鍋，購自北京長風儀器儀表公司；Synergy TM HT型多功能酶標儀，購自美國Bio-tek公司；LC-6AD高效液相色譜儀，購自日本島津公司。

1.2方法

1.2.1蜂蜜提取液的制備在Dimitrova和孫春麗研究[6-7]的基礎上進行了改進，具體步驟如下：（1） 對固相萃取柱預處理，用3 mL甲醇進行活化，用3 mL pH值=7的超純水進行平衡；（2） 稱取蜂蜜樣品30 g，用120 mL超純水稀釋，玻璃棒攪拌至蜂蜜完全溶解。然后用氨水調節(jié)至pH值=7，8 000 g離心除去固體不溶物，取上清液倒入處理好的固相萃取柱中。上樣結束后，用3 mL的超純水 （pH值=7） 清洗，然后用 5 mL 甲酸甲醇 （5 ∶95，V/V） 溶液進行洗脫。將洗脫液在 45 ℃ 恒溫水浴中用氮吹至干燥，然后用2 mL色譜級甲醇溶液復溶，最后用0.22 μm濾膜過濾后放于上樣瓶中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2蜂蜜提取物中總酚含量的測定[8]采用Folin-Ciocalteu法，以沒食子酸作為對照建立總酚含量標準曲線，吸取30 μL蜂蜜提取液，以沒食子酸相對含量表示，每1個品牌的蜂蜜樣品做3次平行試驗。

1.2.3蜂蜜提取物中總黃酮含量的測定[8]采用AICI3 法，以蕓香苷作為對照建立總黃酮標準曲線，吸取1 mL蜂蜜提取物溶液，用蕓香苷的相對含量表示樣品中黃酮含量，每1個品牌的蜂蜜樣品做3次平行試驗。

1.2.4DPPH自由基清除能力測定將蜂蜜樣品用超純水分別稀釋成2.5、2.0、1.5、1.0、0.5 g/mL，吸取1 mL稀釋后的蜂蜜樣品，并加入0.2 mmol/L 的4 mL DPPH溶液（2 mmol/L）以及5 mL對應的溶劑，混勻，于室溫下避光靜置30 min。然后，在波長517 nm處測定石榴蜂蜜樣品的吸光度，計算石榴蜜樣品對DPPH自由基的清除率[9]。

DPPH自由基清除率=（D0-D）/D0×100%；

式中，D0表示空白試劑的吸光度，D表示石榴蜜樣品溶液吸光度。

1.2.5蜂蜜還原力的測定蜂蜜中的多酚類化合物能夠將[Fe（CN）6]3- 還原成為[Fe（CN）6]4-，3分子的[Fe（CN）6]4- 和FeCl3又能轉化為Fe4[Fe（CN）6]3-，這種物質稱為普魯士藍，是1種深藍色的復合物，在700 nm處有強吸度[10]。

在10 mL的試管中分別加入200 μL稀釋成不同濃度的蜂蜜水溶液，然后依次加入0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH值= 6.6）2.5 mL、鐵氰化鉀（2.5 mL，1%），水浴20 min （50 ℃），冷卻至室溫后加入1 mL 三氯乙酸（10%），取上清液2.5 mL，加入蒸餾水2.5 mL，三氯化鐵0.5 mL （0.1%），700 nm下測定石榴蜜樣品的吸光度。以不同濃度Trolox對比溶液吸光度作標準曲線（y=0.001 62x+0.153 17，r2=0990 54），不同濃度蜂蜜樣品根據(jù)吸光度變化對照標準曲線，計算其Trolox當量，結果用mg Trolox/100 g表示。

1.2.6過氧陰離子清除能力（ORAC法）的測定在Zulueta等研究[11]的基礎上進行了改進，具體步驟如下：吸取20 μL的稀釋后的蜂蜜樣品液至96孔板中，然后在每個加樣孔中加入150 μL 熒光素溶液 （8.16×10-2 μmol/L ），覆膜后預熱（37 ℃）10 min。加入30 μL的ABAP （153 mmol/L），使用熒光酶標儀進行測定。酶標儀測定條件：發(fā)射波長是528 nm、激發(fā)波長是485 nm、振蕩5 s后測定1次/min，總測定時間為50 min。ORAC值為μmol Trolox/100 g。

抗氧化能力=AUC（抗氧化劑）-AUC（空白）。

樣品得出的面積差代入Trolox標準曲線即可得出該樣品相應的Trolox當量，換算成美國農(nóng)業(yè)部的單位即為該樣品的ORAC值（IC50），ORAC值越大代表抗氧化能力越弱。

1.2.7HPLC色譜條件色譜柱：150×4.6 mm，5μm （Phenomenex Gemini C18），具體參數(shù)設置：檢測波長280 nm、柱溫箱溫度35 ℃、進樣量為20 μL。流動相：B相是甲醇 （含有2%乙酸），A相是水 （含有2%乙酸）。梯度洗脫程序如下：0～8 min，0%～3% B；8～10 min，3%～9% B；10～12 min，9～33；12～16 min，33% B；16～21 min，33%～34% B；21～31 min，34%～36% B；31～41 min，36%～40% B；41～51 min，40%～45% B；51～61 min，45%～52% B；61～71 min，52%～57% B；71～81 min，57%～65% B；81～86 min，65%～99% B；86～110 min，99%～100% B；總流速為0.7 mL/min。

1.3數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 13.0軟件，采用鄧肯法對數(shù)據(jù)進行方差分析[12]。

2結果與分析

2.1石榴蜜中總酚和總黃酮含量

由表1可知，不同的石榴蜜樣品的總酚和總黃酮含量具有一定的差異。4號蜜的總酚含量最低，僅為29.28 mg/100 g；1號蜜和2號蜜的總酚含量較高，分別為37.25、35.18 mg/100 g。其中，樣品1、2、6總酚含量之間差異不顯著，樣品1、3、4之間呈顯著差異。

此外，不同石榴蜜樣品的黃酮含量相差不大，在 2.31～2.47 mg/100 g 之間，各樣本之間差異不顯著。同時，各樣品的黃酮含量和總酚含量并無明顯的相關性。

2.2石榴蜜的抗氧化能力

總酚和總黃酮含量較高的1號蜜樣和2號蜜樣具有較高的清除DPPH·自由基的能力，IC50值分別為（45.54±9.73）、（47.98±7.83） mg/mL；4號蜜的IC50值為（78.54±11.01） mg/mL，是6個樣品中清除DPPH·自由基能力最弱的。6個樣品清除DPPH·自由基能力由大到小依次為2>1>5>6>3>4（表2）。

由表2可知，6個石榴蜜樣品均具有一定強度的還原力，在157.64～179.67 mg Trolox/100 g蜂蜜之間，并差異不顯著。這表明采自不同地區(qū)的同一品種石榴蜜，還原能力并無明顯差異，即石榴蜜的還原能力可能與蜜源植物的地域并無線性關系。

氧化自由基吸收能力測定法（ORAC方法），已成為衡量食品抗氧化能力的標準方法，美國農(nóng)業(yè)部2007、2010年公布的一系列食品的抗氧化能力都是采用ORAC法測定的[13-14]。各樣本石榴蜜都有明顯的抗氧化性，其中2號蜜的抗氧化能力最強，ORAC值為（210.73±10.98） μmol Trolox/100 g，與3、5、6號蜜之間呈顯著差異（P<0.05）；5號蜜樣的抗氧化能力最弱，ORAC值為182.67±8.21 μmol Trolox/100 g。同時，對其顯著性分析可知，5號蜜與1、2號蜜之間也呈顯著性差異（P<0.05） （表2）。石榴蜜樣品分別采自不同的地區(qū)，這可能是導致其抗氧化性差異的1個因素，由2號蜜（采自云南蒙自）抗氧化能力最強，或許可以推斷這一地區(qū)的蜜源植物（石榴）比較優(yōu)質。

2.3石榴蜜中多酚類成分測定

按相同的色譜條件檢測6個石榴蜜樣品中的3種酚類化合物含量，每個樣品重復測定3次，數(shù)據(jù)處理采用SPSS 13.0，結果見表3，樣品色譜圖見圖1（其中1、2、3號峰分別代表脫落酸、木樨草素和芹菜素）。

2.4石榴蜜中3種酚類化合物含量

由表3可知，6個石榴蜜樣品的酚類化合物含量差異顯著，脫落酸含量2號蜜最高（144.12 μg/100 g），4號蜜最低（65.02 μg/100 g）；木樨草素含量同樣是2號蜜中最高

3討論

試驗結果表明，不同石榴蜜的總酚含量、清除 DPPH 自由基能力、清除過氧陰離子能力及還原能力各不相同?？偡雍颗c還原能力、抗氧化能力呈正相關，而總黃酮含量與總酚含量、還原能力及清除DPPH 自由基能力無明顯的相關性。與其他研究的比較，所有石榴蜜樣品均具有一定的抗氧化活性，抗氧化能力與還原能力及總酚酸含量正相關。石榴蜜具有一定的抗氧化活性，其抗氧化能力因樣品產(chǎn)地的不同而有所差異。不同產(chǎn)地的石榴蜜樣品所含的酚類化合物的含量不同，導致其抗氧化能力不盡相同。同種蜂蜜所具有的化學成分的種類和結構與不同種蜂蜜相差較小，因而總黃酮含量與還原能力能夠表現(xiàn)出高度的相關性。石榴蜜來源復雜，并且環(huán)境條件對蜜源也有一定的影響，因而導致不同樣本的石榴蜜在酚類成分的含量及抗氧化活性方面表現(xiàn)出一定的差異性。

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