亞砷酸鈉對(duì)PC12細(xì)胞增殖、凋亡及Hippo-YAP通路的影響

朱 衛(wèi)，李 成，劉 宇，吳 松，彭 博，劉曉紅，王宏健，王東艷，楊 莉，潘艷伶，潘際剛

(貴州醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室、2.臨床醫(yī)學(xué)院中醫(yī)學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

砷是一種廣泛分布于地殼中的非金屬元素，人群常通過(guò)飲用地下水、進(jìn)食含有砷的食物、燃燒含有砷的燃煤等途徑被暴露于高砷環(huán)境中，砷污染是一個(gè)嚴(yán)重且普遍的全球公共衛(wèi)生問(wèn)題[1-2]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，砷可造成皮膚、肝、腎、神經(jīng)等多種臟器毒性損傷，我國(guó)是世界上砷污染最為嚴(yán)重的國(guó)家之一[3-4]。因此，開(kāi)展有關(guān)砷的毒性損傷機(jī)理的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。砷可以誘導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)氧化應(yīng)激、引起線粒體功能紊亂、影響神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)從而造成神經(jīng)系統(tǒng)的損傷[4]。但其具體的分子機(jī)制未被闡明。Hippo-YAP信號(hào)通路的核心是由哺乳動(dòng)物STE20樣蛋白激酶1/2(mammalian STE20-like protein kinase 1/2，MST1/2)，大腫瘤抑制因子1/2(large tumor suppressor 1/2，LATS1/2)和Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein,YAP)所構(gòu)成的激酶級(jí)聯(lián)，該通路在調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、控制組織器官大小等方面具有重要作用，Hippo-YAP通路的異常則會(huì)引起細(xì)胞增殖和凋亡間的平衡失調(diào)，從而造成組織器官的過(guò)度生長(zhǎng)及腫瘤的發(fā)生[5-6]。目前未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道Hippo-YAP信號(hào)通路在砷誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡方面的作用機(jī)制研究。因此，本研究以PC12細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)觀察周期、凋亡相關(guān)指標(biāo)的變化以及Hippo-YAP信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)一步探討亞砷酸鈉(NaAsO2)誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞毒性損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞系 PC12細(xì)胞株(中科院昆明細(xì)胞庫(kù))。

1.1.2試劑 胎牛血清，購(gòu)自以色列BioInd公司(批號(hào)：10099141C)；青霉素-鏈霉素，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司(批號(hào)：15140163)；胰蛋白酶，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司(批號(hào)：25200056)；高糖DMEM培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司(批號(hào)：8120293)；NaAsO2，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(批號(hào)：S7400)；MST1多克隆抗體，購(gòu)自ProteintechGroup(批號(hào)：22245-1-AP)；LATS1多克隆抗體，購(gòu)自ProteintechGroup(批號(hào)：17049-1-AP)；YAP1多克隆抗體，購(gòu)自ProteintechGroup(批號(hào)：13584-1-AP)；Tubulin多克隆抗體，購(gòu)自Bioworld(批號(hào)：BS1699)；BAX多克隆抗體，購(gòu)自ProteintechGroup(批號(hào)：50599-2-1g)；BCL-2多克隆抗體，購(gòu)自ProteintechGroup(批號(hào)：12789-1-AP)；p53多克隆抗體，購(gòu)自ProteintechGroup(批號(hào)：10442-1-AP)；Phospho-MST1單克隆抗體，購(gòu)自Cell Signaling Technology(批號(hào)：49332S)；Phospho-LATS1單克隆抗體，購(gòu)自Cell Signaling Technology(批號(hào)：9157S)；Phospho-YAP1單克隆抗體，購(gòu)自Abcam(批號(hào)：ab76252)；抗兔IgG-HRP二抗，購(gòu)自北京中衫金橋(批號(hào)：ZB-2305)；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒，凱基生物(批號(hào)：KGA512)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，凱基生物(批號(hào)：KGA1012)。

1.1.3儀器 Model 310細(xì)胞恒溫CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo 公司)；細(xì)胞培養(yǎng)超凈臺(tái)(蘇州凈化)；全波段多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)；FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；全自動(dòng)凝膠成像儀(美國(guó)SynGene)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) PC12細(xì)胞培養(yǎng)在高糖DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS和1%青霉素-鏈霉素)中，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合度時(shí)進(jìn)行傳代或凍存。

1.1.2細(xì)胞周期檢測(cè) 取對(duì)數(shù)期的細(xì)胞鋪于6孔板中(5×108L-1)，培養(yǎng)過(guò)夜，以含20、40、60 μmol·L-1NaAsO2的高糖DMEM培養(yǎng)基分別處理細(xì)胞，同時(shí)以無(wú)NaAsO2的高糖DMEM培養(yǎng)細(xì)胞作為空白對(duì)照，24 h后以不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，1 528g離心5 min，PBS洗2次，置于4 ℃冰箱用70%乙醇固定30 min，1 528g離心5 min，PBS洗2 次，1 528g離心5 min，棄PBS，加入300 μL PI/RNase染色工作液，室溫避光60 min，加入樣品管中，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)PC12細(xì)胞凋亡 本實(shí)驗(yàn)分組及部分收集處理細(xì)胞步驟同“1.2.2”，最后再加入500 μL PBS緩沖液得到細(xì)胞懸液，用移液槍輕輕的吹打混勻，再依次加入5 μL的Annexin V-FITC工作液，并輕輕振蕩混勻后再加入10 μL的PI工作液，混勻后避光靜置于冰上，反應(yīng)20 min后，置于流式細(xì)胞儀中檢測(cè)。

1.2.4蛋白印跡檢測(cè) 藥物處理細(xì)胞后，以RIPA細(xì)胞裂解液(含1 mmol·L-1PMSF)裂解細(xì)胞，冰上裂解10 min，2×104g離心15 min，取上清進(jìn)行BCA蛋白定量，計(jì)算并配制上樣緩沖液，100 ℃變性5 min，10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%的脫脂牛奶封閉2 h，一抗(1 ∶1 000)或內(nèi)參抗體Tubulin(1 ∶50 000)于4 ℃搖床孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，抗兔IgG-HRP(1 ∶20 000)二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，以化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，凝膠成像儀成像，用ImageJ對(duì)蛋白印跡條帶進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果

2.1 NaAsO2對(duì)PC12細(xì)胞周期的影響通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度NaAsO2(20、40、60 μmol·L-1)處理24 h對(duì)PC12細(xì)胞周期的影響。如Tab 1、Fig 1所示，與對(duì)照組相比，20 μmol·L-1NaAsO2處理24 h后，PC12細(xì)胞中各期比例無(wú)明顯改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，40 μmol·L-1NaAsO2處理24 h后，PC12細(xì)胞中G0/G1期比例明顯降低(P<0.01)，而S期比例明顯增加(P<0.05)，60 μmol·L-1NaAsO2明顯降低G0/G1(P<0.01)和G2/M期比例(P<0.05)，而升高S期比例(P<0.01)，而且，與20 μmol·L-1NaAsO2處理組相比，NaAsO2在40、60 μmol·L-1呈劑量依賴性的誘導(dǎo)G0/G1比例降低(P<0.05)、S期比例增加(P<0.01)。

Tab 1 Effect of NaAsO2 on cell cycle of PC12 cells n=3)

2.2 NaAsO2促進(jìn)PC12細(xì)胞凋亡通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度NaAsO2(20、40、60 μmol·L-1)分別處理PC12細(xì)胞24 h后對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響，結(jié)果如Fig 2所示。與對(duì)照組相比，20 μmol·L-1NaAsO2處理24 h后，PC12細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，40、60 μmol·L-1的NaAsO2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡率由3.58%分別上升至11.06%、18.20%(P<0.05)，與20 μmol·L-1NaAsO2處理組相比，40、60 μmol·L-1的NaAsO2以劑量依賴性誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05)。

為了進(jìn)一步證實(shí)NaAsO2的促PC12細(xì)胞凋亡作用，我們通過(guò)蛋白印跡法檢測(cè)不同濃度NaAsO2(20、30、40、50、60 μmol·L-1)處理24 h后，對(duì)PC12細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。如Fig 3所示，與對(duì)照組相比，NaAsO2處理后，20、30 μmol·L-1NaAsO2處理后BCL-2蛋白的表達(dá)水平無(wú)明顯變化，當(dāng)濃度增加到40、50、60 μmol·L-1時(shí)BCL-2蛋白的表達(dá)水平明顯下降(P<0.01)，20、30、40 μmol·L-1NaAsO2處理后BAX的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，不同濃度(20、30、40、50 μmol·L-1)的NaAsO2處理后均可使p53蛋白的表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.01)。

Fig 1 Effect of NaAsO2 on cell cycle of PC12 cells n=3)

Fig 2 Effect of NaAsO2 on apoptotic rates of PC12 cells n=3)

Fig 3 Effect of NaAsO2 on expression of apoptosis-related proteins in PC12 n=3)

2.3 NaAsO2對(duì)PC12細(xì)胞Hippo-YAP通路的影響為了探究NaAsO2對(duì)PC12細(xì)胞Hippo-YAP通路的影響，我們使用蛋白印跡檢測(cè)經(jīng)過(guò)不同濃度NaAsO2(20、30、40、50、60 μmol·L-1)處理24 h后Hippo-YAP通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化。如Fig 4所示，與對(duì)照組比較，60 μmol·L-1NaAsO2處理后，MST1蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05)，40、50、60 μmol·L-1NaAsO2處理后LATS1蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.01)、50、60 μmol·L-1NaAsO2處理后YAP蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.01)，而p-MST1、p-LATS1、p-YAP蛋白表達(dá)水平在經(jīng)不同濃度(20、30、40、50、60 μmol·L-1)的NaAsO2處理后均發(fā)生明顯上調(diào)(P<0.05)。

3 討論

越來(lái)越多的流行病學(xué)調(diào)查和臨床病例報(bào)告顯示，砷暴露會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，包括神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育異常、學(xué)習(xí)記憶以及認(rèn)知能力的損傷等[1-2]。本課題組的前期研究結(jié)果顯示，NaAsO2暴露后PC12細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制，可能與3MST蛋白表達(dá)下降有關(guān)[7]。在本研究中，以PC12細(xì)胞染砷，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示，NaAsO2可使PC12細(xì)胞發(fā)生S期阻滯，明顯誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡。細(xì)胞周期是細(xì)胞的基本生命活動(dòng)，細(xì)胞的生長(zhǎng)和復(fù)制依賴于完整的細(xì)胞周期進(jìn)程，當(dāng)細(xì)胞受到不良刺激時(shí)，會(huì)引起周期檢查點(diǎn)的異常進(jìn)而使細(xì)胞周期滯留在周期檢查點(diǎn)上稱之為細(xì)胞周期阻滯。Zhao等[8]用二硫化二砷處理MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)現(xiàn)S期細(xì)胞明顯增加。柳香香等[9]用NaAsO2處理SH-SY5Y細(xì)胞后也發(fā)現(xiàn)S期細(xì)胞比例增加。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)NaAsO2處理后可使PC12細(xì)胞發(fā)生明顯的S期阻滯。

Fig 4 Effect of NaAsO2 on expression of proteins associated with Hippo-YAP signaling pathway in PC12 cells n=3)

BCL-2家族是凋亡通路中研究最為廣泛的，其中BCL-2是目前已知抗凋亡作用最強(qiáng)的因子之一，而以BAX為代表的一類分子則促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，BAX/BCL-2比例增加時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，當(dāng)二者比列下降時(shí)則抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生[10]。p53基因是一種腫瘤抑制基因，其編碼的蛋白稱為p53蛋白，Kircelli等[11]發(fā)現(xiàn)，As2O3以p53依賴方式誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。Yang[12]在NaAsO2暴露處理的大鼠模型中研究發(fā)現(xiàn)，大鼠肝組織內(nèi)p53蛋白的表達(dá)、BAX/BCL-2比例均升高。Sun等[13]研究發(fā)現(xiàn)，As2O3可明顯抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞抗凋亡基因BCL-2的表達(dá)，并以時(shí)間依賴性方式上調(diào)凋亡基因BAX的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)研究中對(duì)上述BCL-2家族以及p53蛋白的檢測(cè)結(jié)果表明，經(jīng)NaAsO2處理24 h后，出現(xiàn)了明顯的BCL-2下調(diào)，BAX和p53的表達(dá)上調(diào)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，提示NaAsO2誘導(dǎo)PC12凋亡可能是通過(guò)BCL-2家族蛋白實(shí)現(xiàn)的。

Hippo-YAP信號(hào)通路在各物種之間高度保守，其通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖-凋亡平衡在維持組織穩(wěn)態(tài)和器官形態(tài)上具有重要作用[5]。Wei等[14]的研究表明，維替泊芬通過(guò)抑制YAP蛋白的表達(dá)水平，引起B(yǎng)CL-2表達(dá)下調(diào)，從而誘導(dǎo)胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞PANC-1和SW1990凋亡。Song等[15]研究表明，子宮內(nèi)膜異位癥的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(endometrial stromal cell,ESC)中的YAP敲低降低了細(xì)胞增殖并增強(qiáng)了細(xì)胞凋亡，同時(shí)降低了BCL-2的表達(dá)；而YAP的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致正常ESC的增殖增加和凋亡減少，誘導(dǎo)BCL-2的表達(dá)增加，并證實(shí)BCL-2為YAP的直接下游靶基因，用維替泊芬(YAP抑制劑)處理子宮內(nèi)膜異位癥的ESC顯示增殖減少和凋亡增強(qiáng)，并且在維替泊芬處理的裸鼠子宮內(nèi)膜異位癥動(dòng)物模型中，子宮內(nèi)膜異位病變的大小明顯減小，提示Hippo-YAP信號(hào)通路參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制。Li等[16]研究表明,丙泊酚可以抑制YAP磷酸化和促進(jìn)其核易位來(lái)激活YAP，激活的YAP增加了Bcl-2基因的轉(zhuǎn)錄并增加BCL-2蛋白表達(dá)，促進(jìn)HT-22細(xì)胞存活。Li等[17]研究表明，阿霉素處理明顯下調(diào)H9c2細(xì)胞YAP的表達(dá)，引起B(yǎng)CL-2下調(diào)，以及BAX的表達(dá)上調(diào)，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，褪黑激素可以使YAP水平在阿霉素的處理下保持不變，并逆轉(zhuǎn)阿霉素誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡，而通過(guò)siRNA抑制YAP的表達(dá)時(shí)，褪黑激素失去了對(duì)阿霉素處理的心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，提示YAP在其中起到至關(guān)重要的作用。Niu等[18]的研究指出，化合物9i通過(guò)激活p-LATS抑制YAP的活性下調(diào)BCL-2的表達(dá)，促進(jìn)胃癌MGC-803和SGC-7901細(xì)胞凋亡，提示化合物9i可能通過(guò)激活Hippo-YAP信號(hào)通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。這些研究提示Hippo-YAP信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞凋亡中扮演了至關(guān)重要的角色。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)NaAsO2能夠上調(diào)PC12細(xì)胞內(nèi)的p-MST1、p-LATS1、p-YAP蛋白表達(dá)水平從而激活Hippo-YAP信號(hào)通路，并且證實(shí)了NaAsO2可以誘導(dǎo)PC12細(xì)胞S期阻滯，通過(guò)上調(diào)p53、BAX的表達(dá)，抑制BCL-2的表達(dá)最終誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果提示，NaAsO2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的凋亡作用可能是與Hippo-YAP信號(hào)的激活有關(guān)，Hippo-YAP通路激活從而抑制YAP的活性，導(dǎo)致抗凋亡蛋白BCL-2的表達(dá)下調(diào)，促凋亡蛋白BAX的表達(dá)上調(diào)，從而引起PC12細(xì)胞凋亡。然而，這些可能機(jī)制仍然有待進(jìn)一步加以證實(shí)，從而有助于闡明砷中毒的分子機(jī)制，為臨床防治砷中毒提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。