人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體增強(qiáng)心臟肌成纖維細(xì)胞血管形成作用

趙媛媛，李潔潔，費(fèi)蘇燕，陳 忱，徐 鑫，王 韌，朱 偉

(江蘇大學(xué) 1.醫(yī)學(xué)院、2.附屬醫(yī)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

近年來(lái)，外泌體(exosomes)作為一種新型生物材料或藥物載體在腫瘤和組織損傷修復(fù)等領(lǐng)域應(yīng)用前景令人期待[1]。心肌缺氧損傷后增強(qiáng)血管形成，恢復(fù)血供對(duì)于炎癥清除及損傷修復(fù)至關(guān)重要，研究表明，干細(xì)胞及其exosomes可通過(guò)促進(jìn)血管形成發(fā)揮心肌保護(hù)作用[2 -3]。心臟成纖維細(xì)胞在非心肌細(xì)胞中占比最大，在心肌損傷后各個(gè)階段均發(fā)揮重要作用，近年來(lái)有研究者關(guān)注到心臟成纖維細(xì)胞的血管形成作用。心肌梗死后修復(fù)階段，成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為高表達(dá)α-SMA的肌成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生抗炎和促血管生成因子，研究者發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后d3心臟成纖維細(xì)胞能夠促紅細(xì)胞生成和促血管生成[4 -5]。此外，還有研究者從小鼠心臟中分離出兩種成纖維細(xì)胞亞型，并證實(shí)FSP1陽(yáng)性成纖維細(xì)胞亞群具有突出的促血管生成作用[6]。成纖維細(xì)胞去分化為中間型CD34+祖細(xì)胞，可以產(chǎn)生內(nèi)皮細(xì)胞和成紅細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生功能性血管或紅細(xì)胞，并挽救缺血組織[7]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hucMSC)來(lái)源exosomes利于組織損傷修復(fù)，促進(jìn)炎癥條件下成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化[8-9]。HucMSC-exosomes能否通過(guò)增加心臟肌成纖維細(xì)胞分泌血管形成相關(guān)因子從而促進(jìn)血管形成還未可知。本研究采用一系列實(shí)驗(yàn)檢測(cè)exosomes作用后心臟肌成纖維細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和小管形成能力的影響及可能機(jī)制。這將為探索心肌損傷修復(fù)相關(guān)機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為干細(xì)胞或生物材料治療心肌損傷相關(guān)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料臍帶組織標(biāo)本取自江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，標(biāo)本收集及使用遵循知情同意原則，并通過(guò)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。SD大鼠(1～3日齡)取自江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(蘇)2018-0053。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC來(lái)源于ATCC細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要儀器流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter公司，美國(guó))；高速冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó))；透射電子顯微鏡(日本電子)；Nanosight納米顆粒分析儀(Malvern Panalytical公司，英國(guó))；紫外/核酸蛋白檢測(cè)儀(Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó))；Western blot垂直電泳儀(Bio-Rad公司，美國(guó))；ImageQuant LAS 4000 mini 化學(xué)發(fā)光成像儀(GE公司，美國(guó))；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司，美國(guó))；熒光顯微鏡(Olympus Corporation公司，日本)；光學(xué)顯微鏡(Nikon公司，日本)；酶標(biāo)儀(BioTek 公司，美國(guó))。

1.3 主要試劑L-DMEM (Gibco公司，美國(guó)，01-051-1A)；H-DMEM(Gibco公司，美國(guó)，06-1055-57-1A)；α-MEM培養(yǎng)基(Gibco公司，美國(guó)，01-042-1)；胎牛血清FBS(Biological Industries公司，以色列，04-001-1A)；HBSS平衡鹽溶液(Gibco公司，美國(guó)，14170112)；胰酶(Worthington公司，美國(guó)，LS003708)；胰酶抑制劑(Worthington公司，美國(guó)，LS003570)；Ⅱ型膠原酶(Worthington公司，美國(guó)，LS004174)；CCK8試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國(guó)，C0039)；基質(zhì)膠(Corning公司，美國(guó)，356234)；BCA蛋白定量試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司，中國(guó)，CW0014S)；RNA提取試劑盒(Invitrogen公司，美國(guó)，15596018)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司，中國(guó)，CW2569M)；Transwell培養(yǎng)板(Corning 公司，美國(guó)，3422)；α-SMA(Cell Signaling Technology 公司，美國(guó)，19245T)；CD81(Cell Signaling Technology公司，美國(guó)，52892S)；calnexin(Cell Signaling Technology公司，美國(guó)，2679T)；GAPDH(Cell Signaling Technology公司，美國(guó)，51332S)；VEGF-A(武漢博士德生物工程有限公司，中國(guó)，A00045)；ICG-001(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國(guó)，SF6827)；β-actin(Cell Signaling Technology 公司，美國(guó)，4970S)；熒光二抗(Cell Signaling Technology 公司，美國(guó)，4412S)。

1.4 方法

1.4.1HucMSC及其來(lái)源exosomes分離及鑒定 依據(jù)先前實(shí)驗(yàn)方法[8-9]，培養(yǎng)hucMSC，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其相關(guān)表面標(biāo)記 CD19、CD34、CD45、CD29、CD105 和CD90。收集hucMSC無(wú)exosomes血清培養(yǎng)基，分別經(jīng)4 ℃，300g離心20 min，800g離心20 min，2 000g離心20 min，1×104g離心30 min以去掉細(xì)胞及細(xì)胞碎片，使用超速離心法提取exosomes。Exosomes經(jīng)透射電子顯微鏡記錄其形態(tài)，使用Nanosight納米顆粒分析儀檢測(cè)exosomes粒徑分布情況。

向hucMSC或exosomes中加入蛋白裂解液，低溫裂解提取相應(yīng)蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度后加入5×loading buffer充分混勻，沸水浴10 min備用。制備聚丙烯酰胺凝膠，以每孔150 μg蛋白量上樣，60 V恒壓進(jìn)行電泳，當(dāng)樣品到達(dá)分離膠時(shí)行100 V恒壓電泳，電泳結(jié)束后，以350 mA恒流冰上轉(zhuǎn)膜120 min，隨后將PVDF膜置于脫脂牛奶中封閉1 h，4 ℃過(guò)夜孵育相應(yīng)一抗CD81、calnexin和GAPDH，1× TBST洗滌，37 ℃孵育辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記相應(yīng)二抗1 h，1× TBST洗滌，最后加入適量顯色底物，采用ImageQuant LAS 4000 mini化學(xué)發(fā)光成像儀成像。

1.4.2心臟肌成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定

1.4.2.1 分離培養(yǎng)心臟肌成纖維細(xì)胞 選取1～3日齡SD大鼠，麻醉后無(wú)菌環(huán)境下取出心臟，HBSS平衡鹽溶液洗滌3遍，將心肌組織剪碎至1 mm3大小，加入胰酶輕柔吹打混勻，4 ℃過(guò)夜。次日，加入胰酶抑制劑及II型膠原酶，37 ℃恒溫消化，當(dāng)大部分組織塊消失時(shí)用H-DMEM培養(yǎng)液(含10% FBS)終止消化，40 μm濾網(wǎng)過(guò)濾后將濾過(guò)液轉(zhuǎn)移至新離心管中，800g離心5 min，棄上清，H-DMEM培養(yǎng)液(含10% FBS)重懸細(xì)胞并接種于細(xì)胞培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)90 min后棄掉未貼壁細(xì)胞，更換α-MEM培養(yǎng)基(含10% FBS)，繼續(xù)于37 ℃，5 % CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。

1.4.2.2 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色 預(yù)先將細(xì)胞爬片置于培養(yǎng)皿中，接種生長(zhǎng)狀態(tài)良好原代肌成纖維細(xì)胞，37 ℃，5 % CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞達(dá)到合適密度時(shí)，行4%多聚甲醛固定，PBS洗滌，0.1% Triton X-100作用，5% BSA封閉，4 ℃過(guò)夜孵育一抗α-SMA，37 ℃孵育相應(yīng)熒光二抗，Hoechst染色等步驟，最后使用熒光顯微鏡拍照。

1.4.3收集對(duì)照組和exosomes作用組心臟肌成纖維細(xì)胞及其培養(yǎng)基 當(dāng)接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中的原代肌成纖維細(xì)胞密度達(dá)到60%～70%時(shí)，對(duì)照組加入α-MEM培養(yǎng)基(含10% FBS)，exosomes作用組加入α-MEM培養(yǎng)基(含10% FBS)和hucMSC來(lái)源exosomes(200 mg·L-1)，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)基。收集細(xì)胞用于檢測(cè)心臟肌成纖維細(xì)胞VEGF-A水平，此外β-catenin信號(hào)通路與促進(jìn)血管形成密切相關(guān)，然而此實(shí)驗(yàn)條件下VEGF-A表達(dá)是否與β-catenin信號(hào)相關(guān)還不清楚，因此，在加入exosomes同時(shí)使用β-catenin/TCF 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制劑ICG101(10 μmol·L-1)后，采用Western blot檢測(cè)VEGF-A表達(dá)水平。用對(duì)照組和exosomes作用組心臟肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞24 h，檢測(cè)細(xì)胞增殖、遷移及小管形成能力。

1.4.4CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將預(yù)處理后的內(nèi)皮細(xì)胞接種于96孔板，到達(dá)24、48和72 h時(shí)，加入CCK-8試劑，2 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)吸光度值。

1.4.5Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 當(dāng)預(yù)處理后的血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞密度達(dá)到約80%時(shí)，用無(wú)血清 α-MEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，取200 μL細(xì)胞懸液加入上室，下室加入α-MEM培養(yǎng)基(含10 % FBS)，37 ℃，5 % CO2培養(yǎng)8 h，取出Transwell小室，PBS輕柔清洗兩遍，用棉簽輕輕擦去未遷移細(xì)胞，4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3次，0.1%結(jié)晶紫染色液染色5 min，PBS清洗3次，干燥后于顯微鏡下拍照。

1.4.6細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 預(yù)先在6孔板外底部畫3條標(biāo)記線，接種預(yù)處理的血管內(nèi)皮細(xì)胞，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)，待細(xì)胞幾乎鋪滿板底時(shí)，用10 μL無(wú)菌吸頭在培養(yǎng)板內(nèi)底部垂直于預(yù)畫標(biāo)記線劃3條痕跡，PBS清洗2遍，分別加入α-MEM培養(yǎng)基(含10% FBS)，使用倒置顯微鏡拍照起始劃痕間隙(記為0 h)，隨后分別在6 h和12 h再進(jìn)行拍照記錄。

1.4.7小管形成實(shí)驗(yàn) 預(yù)先加入50 μL基質(zhì)膠于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(冰上操作)，37 ℃靜置使基質(zhì)膠凝固，接種預(yù)處理后的血管內(nèi)皮細(xì)胞，分別加入α-MEM培養(yǎng)基(含10% FBS)，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)12 h，使用倒置顯微鏡對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞成管情況拍照記錄。

1.4.8細(xì)胞總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 收集對(duì)照組及exosomes作用組心臟肌成纖維細(xì)胞，RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度法測(cè)定RNA濃度，依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟逆轉(zhuǎn)錄。以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)VEGF-A相對(duì)表達(dá)量，其中β-actin作為內(nèi)參，引物序列見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Primer sequences

1.4.9細(xì)胞總蛋白提取及Western blot 參照上述hucMSC來(lái)源exosomes鑒定方法學(xué)中細(xì)胞總蛋白提取及Western blot方法，加入適量細(xì)胞裂解液至對(duì)照組及exosomes作用組心臟肌成纖維細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞裂解、離心、BCA法檢測(cè)蛋白濃度以及加入5×loading buffer沸水浴等步驟后，制備聚丙烯酰胺凝膠，按照每孔蛋白量150 μg上樣，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，4 ℃過(guò)夜孵育相應(yīng)一抗VEGF-A和β-actin，洗膜后37 ℃孵育辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記相應(yīng)二抗，加入相應(yīng)顯色液，采用ImageQuant LAS 4000 mini化學(xué)發(fā)光成像儀成像。

2 結(jié)果

2.1 HucMSC形態(tài)及exosomes鑒定顯微鏡下可見(jiàn)hucMSC呈長(zhǎng)梭形，漩渦樣生長(zhǎng)，具有典型的間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)(Fig 1A)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hucMSC相關(guān)表面標(biāo)記，結(jié)果顯示其不表達(dá)CD19、CD34和CD45，而高表達(dá)CD29、CD105和CD90，與間充質(zhì)干細(xì)胞特性相符(Fig 1B)。經(jīng)透射電子顯微鏡和Nanosight納米顆粒分析儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，hucMSC來(lái)源exosomes粒徑約100～200 nm(Fig 1C，D)。Western blot結(jié)果顯示，相較于hucMSC，其exosomes高表達(dá)跨膜蛋白CD81，不表達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的特異性分子Calnexin，這些均與exosomes特征相符(Fig 1E)。

2.2 大鼠心臟肌成纖維細(xì)胞鑒定分離培養(yǎng)大鼠心臟成纖維細(xì)胞，由Fig 2免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞高表達(dá)α-SMA，提示細(xì)胞已被激活處于轉(zhuǎn)分化階段，為心臟肌成纖維細(xì)胞。

2.3 Exosomes作用后心臟肌成纖維細(xì)胞促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力與對(duì)照組相比，采用hucMSC來(lái)源exosomes作用心臟肌成纖維細(xì)胞后培養(yǎng)基預(yù)先處理內(nèi)皮細(xì)胞，CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在72 h時(shí)間點(diǎn)，exosomes作用組與對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞450 nm吸光度值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig 3)，表明exosomes作用后心臟肌成纖維細(xì)胞可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖。

2.4 Exosomes作用后心臟肌成纖維細(xì)胞促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，exosomes作用組遷移至小室另一側(cè)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量明顯多于對(duì)照組(Fig 4A)。此外，在12 h記錄點(diǎn)，exosomes作用組內(nèi)皮細(xì)胞中間劃痕區(qū)已被填滿，而對(duì)照組仍留有一定距離，提示與對(duì)照組相比，exosomes 作用組的HUVEC遷移能力明顯增加(Fig 4B)。

2.5 Exosomes作用后心臟肌成纖維細(xì)胞使內(nèi)皮細(xì)胞成管能力增強(qiáng)如Fig 5所示，exosomes作用組內(nèi)皮細(xì)胞形成小管管腔數(shù)量以及節(jié)點(diǎn)數(shù)量均比對(duì)照組明顯增加。提示exosomes作用后心臟肌成纖維細(xì)胞能夠增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞成管能力。

Fig 1 Characterization of hucMSC and hucMSC-exosomes

Fig 2 Expression of α-SMA in cardiac myofibroblasts detected

Fig 3 The proliferation ability of HUVECs enhanced by cardiac

The proliferation ability of HUVECs was detected by CCK-8 assay.*P<0.05vscontrol group.

2.6 HucMSC來(lái)源exosomes通過(guò)β-catenin信號(hào)促進(jìn)心臟肌成纖維細(xì)胞表達(dá)VEGF-AVEGF-A是血管形成所需重要細(xì)胞因子，hucMSC來(lái)源exosomes作用心臟肌成纖維細(xì)胞后收集細(xì)胞，熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)(Fig 6A)與Western blot檢測(cè)結(jié)果(Fig 6B)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，exosomes作用組VEGF-A表達(dá)水平升高。加入β-catenin/TCF 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制劑后，VEGF-A表達(dá)水平降低(Fig 6C)。

3 討論

Exosomes是細(xì)胞內(nèi)多囊泡體外膜與細(xì)胞膜融合后釋放到細(xì)胞外，內(nèi)含蛋白質(zhì)或RNA等多種生物大分子的一種納米顆粒，既含有來(lái)源細(xì)胞的生物分子，還具有來(lái)源廣泛、安全性高和易于保存運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，在藥物遞送、組織損傷修復(fù)等方面有很好的應(yīng)用前景。其中在心肌組織損傷修復(fù)相關(guān)研究中，心臟成纖維細(xì)胞作為心臟組織中重要的細(xì)胞類型，近年來(lái)主要關(guān)注點(diǎn)在心肌纖維化及心臟重塑方面[10 -11]，間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源exosomes能夠抑制心肌纖維化的研究也有報(bào)道[12]。然而，有研究表明在心肌損傷后增殖階段，心臟成纖維細(xì)胞可釋放促血管形成相關(guān)因子[4]。成纖維細(xì)胞的促血管形成作用在心肌損傷修復(fù)過(guò)程中值得關(guān)注，本研究通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞管形成等一系列實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)hucMSC來(lái)源exosomes作用后的心臟肌成纖維細(xì)胞，可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和小管形成。VEGF-A是促進(jìn)血管形成的重要因子，一方面exosomes能夠富集VEGF-A進(jìn)而促進(jìn)血管形成[13]，另一方面主要是exosomes通過(guò)作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞增加VEGF-A的表達(dá)，促進(jìn)血管形成，進(jìn)而促進(jìn)損傷修復(fù)[14]。此外β-catenin信號(hào)通路與促進(jìn)血管形成密切相關(guān)，進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)exosomes作用后的心臟肌成纖維細(xì)胞VEGF-A表達(dá)增加，并與β-catenin信號(hào)相關(guān)。

據(jù)研究報(bào)道成纖維細(xì)胞促進(jìn)血管形成相關(guān)機(jī)制可能涉及成纖維細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化，成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞進(jìn)而分泌促血管形成因子。Ke等[15]報(bào)道人內(nèi)皮源性exosomes通過(guò)促進(jìn)間質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化和降低高遷移率族蛋白HMGB1表達(dá)，增加心臟成纖維細(xì)胞的增殖和血管生成。另有研究發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞GATA-4和GATA-6促進(jìn)了壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚的適應(yīng)性重塑。心源性轉(zhuǎn)錄因子GATA-4和GATA-6在心臟成纖維細(xì)胞中發(fā)揮了新的作用，這兩種蛋白質(zhì)通過(guò)細(xì)胞間的協(xié)同作用，促進(jìn)心肌血管形成和心臟功能[16]。Li等[17]證明了干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外囊泡攜帶miR-486-5p 通過(guò)成纖維細(xì)胞 MMP19-VEGF-A信號(hào)促進(jìn)心臟血管新生的關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果顯示，hucMSC來(lái)源exosomes增加心臟肌成纖維細(xì)胞促血管形成能力，心臟肌成纖維細(xì)胞VEGF-A表達(dá)增加。然而更深入的細(xì)胞分子機(jī)制還需進(jìn)一步探究，例如exosomes內(nèi)哪種分子起關(guān)鍵作用、下游關(guān)鍵信號(hào)軸研究、成纖維細(xì)胞是否涉及間質(zhì)內(nèi)皮轉(zhuǎn)化機(jī)制，這項(xiàng)研究可能為工程化exosomes應(yīng)用提供有力的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

Fig 4 The migration ability of HUVECs enhanced by cardiac myofibroblasts pre-treated by hucMSC-exosomes

Fig 5 The tube forming ability of HUVECs enhanced by cardiac myofibroblasts pre-treated by n=3 )

Fig 6 Expression of VEGF-A in cardiac myofibroblasts enhanced by HucMSC-exosomes via β-catenin n=3 )