基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接研究紫藤瘤對(duì)胃癌的作用機(jī)制及初步驗(yàn)證

楊 輝，王文君，徐澤榮，黃宇飛，程 卉，劉勁松，4，5，王國(guó)凱，4，5

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研技術(shù)中心，安徽 合肥 230038；4.中藥研究與開發(fā)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，5.藥物制劑技術(shù)與應(yīng)用安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012)

近年來，我國(guó)胃癌總體發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，在我國(guó)，胃癌是僅次于肺癌的第二大高發(fā)癌癥，且胃癌患病率以及死亡率均超過世界平均水平的2倍[1]。紫藤瘤(Wisteriasinensistumor)是由細(xì)菌侵染紫藤莖，植物應(yīng)激反應(yīng)后，在莖體上寄生的病變組織。當(dāng)前西醫(yī)治療胃癌的手段仍為手術(shù)、放療以及化療，易損傷機(jī)體正常組織細(xì)胞，若胃癌手術(shù)未能完全切除腫瘤容易復(fù)發(fā)，具有一定的弊端和局限性。中醫(yī)藥治療胃癌已成為目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[2]。紫藤瘤具有止痛、解毒、殺蟲以及抗腫瘤作用，在日本民間一直被用作抗胃癌的藥物使用。課題組前期對(duì)紫藤瘤的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究[3-11]，在此基礎(chǔ)上，本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討紫藤瘤抗胃癌潛在的有效成分和作用機(jī)制并通過體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為后續(xù)研究及臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 紫藤瘤藥物靶點(diǎn)篩選使用化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫以及查找文獻(xiàn)收集紫藤瘤的所有化學(xué)成分；利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine System Pharmacological，TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)計(jì)算這些化學(xué)成分的ADME值并對(duì)口服生物利用度(OB)、類藥指數(shù)(DL)值進(jìn)行評(píng)估，選取OB≥30%，DL≥0.18的活性較高的化合物作為紫藤瘤候選活性成分，在有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫PubChem (https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中檢索經(jīng)過篩選的活性較高的化合物，保存化合物的Canonical SMILES號(hào)，然后使用在線靶標(biāo)預(yù)測(cè)網(wǎng)站SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(http：//www.swisstargetprediction.ch/)，檢索保存的Canonical SMILES號(hào)得到化合物的潛在靶點(diǎn)。

1.2 胃癌疾病靶點(diǎn)篩選通過人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫 (online mendelian inheritance in man，OMIM)(http：//www.omim.org)以及DrugBank數(shù)據(jù)庫(https：//go.drugbank.com/)對(duì)胃癌潛在靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，搜索已報(bào)道的與胃癌相關(guān)的基因，并搜索文獻(xiàn)驗(yàn)證。

1.3 藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化以及共有靶點(diǎn)的映射將得到的紫藤瘤靶點(diǎn)和胃癌疾病靶點(diǎn)分別導(dǎo)入到UniProt數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org/)中得到UniProt數(shù)據(jù)庫識(shí)別碼格式，篩選得到物種種屬為“Homo sapiens(Human)”相應(yīng)的靶點(diǎn)，得到紫藤瘤藥物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集和胃癌疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。將上述已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的紫藤瘤藥物靶點(diǎn)和胃癌疾病靶點(diǎn)上傳至Venny2.1.0平臺(tái)(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)，得到紫藤瘤靶點(diǎn)與胃癌靶點(diǎn)的映射，篩選紫藤瘤靶點(diǎn)與胃癌靶點(diǎn)的共有靶點(diǎn)，獲得紫藤瘤治療胃癌的潛在靶點(diǎn)的Venny圖。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析為進(jìn)一步明確紫藤瘤潛在靶點(diǎn)與胃癌疾病靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，將篩選得到的共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)，在“Multiple proteins”條件下將種類定義為Homo sapiens進(jìn)行分析，建立藥物靶蛋白-疾病靶蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，且最低相互作用閾值取中等“medium confidence”(≥0.4)獲得靶蛋白相互作用核心網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件制作藥物靶蛋白-疾病靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖并進(jìn)行可視化分析。

1.5 GO富集分析與KEGG通路注釋分析為說明藥物的靶點(diǎn)在基因功能中的作用，將上述篩選出的紫藤瘤與胃癌的共有靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(https：//metascape.org/)中，將種屬選為人(“H.sapiens”)，選擇自定義分析(Custom Analysis)，設(shè)定P值為0.01，最小計(jì)數(shù)為3，富集因子>1.5(富集因子是觀察到的計(jì)數(shù)與偶然期望的計(jì)數(shù)之比的術(shù)語)，得到富集分析結(jié)果，分別從功能、參與的生物途徑及細(xì)胞中的定位對(duì)基因產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化描述，并得到GO富集分析柱狀圖和KEGG通路注釋分析柱狀圖。

1.6 靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建為進(jìn)一步明確紫藤瘤活性成分、共有靶點(diǎn)與信號(hào)通路之間相互作用關(guān)系，將上述KEGG通路注釋分析所得到的通路與紫藤瘤活性成分以及共有靶點(diǎn)之間相互匹配，制作紫藤瘤候選活性成分-胃癌靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)表，將紫藤瘤候選活性成分-胃癌靶點(diǎn)-通路信息導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建紫藤瘤候選活性成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖，以實(shí)現(xiàn)紫藤瘤治療胃癌作用機(jī)制的可視化。

1.7 成分與治療胃癌關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接選擇紫藤瘤治療胃癌的蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)中度值較高的5個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)與其對(duì)應(yīng)的潛在活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，查找相關(guān)文獻(xiàn)或者檢索pubchem數(shù)據(jù)庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得活性成分的2D結(jié)構(gòu)式，利用ChemBio3D Ultra 14.0繪制其3D結(jié)構(gòu)，進(jìn)行能量最小化處理后保存為mol 2格式。在PDB數(shù)據(jù)庫(https：//www.rcsb.org/structure)中下載關(guān)鍵靶點(diǎn)pdb格式，利用Pymol Win軟件進(jìn)行去水去配體處理后保存。利用Autodock Vina軟件將治療胃癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)與相應(yīng)的活性化合物進(jìn)行分子對(duì)接。分子對(duì)接成功后，其結(jié)果用Pymol Win軟件進(jìn)行可視化處理。

1.8 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.8.1細(xì)胞株 人胃癌細(xì)胞SGC-7901購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院(上海細(xì)胞生物學(xué)研究所)培養(yǎng)庫。

1.8.2試劑 MTT(1212U054)、PBS (726P022) 購(gòu)自北京索萊寶公司；青霉素-鏈霉素溶液( 080421211018)、0.25%胰酶細(xì)胞消化液( L112421211204)購(gòu)自上海碧云天公司；胎牛血清(FBS,RB39736)購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；RPMI-1640(WH0021F141)購(gòu)自武漢普諾賽公司；DMSO(EZ7890A253)購(gòu)自德國(guó)BioFroxx公司；化合物由課題組從紫藤瘤中分得，經(jīng)質(zhì)譜及核磁確定其純度和結(jié)構(gòu)。

1.8.3儀器 CO2培養(yǎng)箱、-80 ℃冰箱購(gòu)自日本Sanyo公司；CK2型倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；生物安全柜購(gòu)自浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司；低速離心機(jī)購(gòu)自安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；恒溫水浴鍋購(gòu)自常州國(guó)華電器有限公司；多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)MD公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司；液氮罐購(gòu)自成都金鳳液氮容器公司。

1.8.4細(xì)胞培養(yǎng) 快速?gòu)囊旱拗腥〕鰞龃娴募?xì)胞置于37 ℃恒溫水浴鍋中解凍，融化后迅速進(jìn)入生物安全柜中無菌操作，將凍存管中的細(xì)胞懸液吸入裝有5 mL完全培養(yǎng)基的15 mL的離心管內(nèi)，1 000r·min-1，5 min，離心后棄去上清，加入6 mL完全培養(yǎng)基，吹打混勻后，將細(xì)胞懸液接種培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.8.5MTT比色法 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的人胃癌細(xì)胞SGC-7901，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×108個(gè)·L-1，接種于96孔板中，每孔細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，設(shè)空白組(只加完全培養(yǎng)基100 μL，不加細(xì)胞懸液)、對(duì)照組(細(xì)胞懸液只加完全培養(yǎng)基，即藥物濃度為0)和不同濃度藥物組(10、20、40、80、160、320、640 μmol·L-1)，細(xì)胞培養(yǎng)過夜，待貼壁后吸去對(duì)照組和藥物組培養(yǎng)基。加入不同濃度的藥物培養(yǎng)基100 μL，培養(yǎng)24 h，吸去舊培養(yǎng)基，每孔加入10 μL MTT，操作過程避光，并用錫紙將96孔板包裹避光繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，操作過程避光，并用錫紙將96孔板包裹避光置于搖床上緩慢振搖15 min后。在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光值。計(jì)算細(xì)胞存活率公式如下：

細(xì)胞存活率/%=(藥物組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%

1.8.6AV-PI 染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)芒柄花素誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡的作用 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔接種于96孔板中，每孔含完全培養(yǎng)基2 mL，孵育過夜后棄去原培養(yǎng)基，換成含不同濃度的芒柄花素培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用不含 EDTA-Na2的胰酶消化液消化離心并收集細(xì)胞。4 ℃預(yù)冷的PBS緩沖液清洗細(xì)胞2遍，1 800 r·min-1離心5 min。加入500 μL預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，加入Annexin V-FITC 5 μL，用移液器吹打均勻，避光15 min，吸取5 μL PI加入繼續(xù)吹打使之充分混合，于室溫下避光孵育約5 min。流式細(xì)胞儀上FL1和FL3通道進(jìn)行檢測(cè)。

1.8.7鈣離子水平檢測(cè) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔接種于96孔板中，每孔加入完全培養(yǎng)基 2 mL，37度培養(yǎng)箱孵育過夜后棄去原培養(yǎng)基，換成含不同濃度的芒柄花素完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用胰酶消化液消化離心并收集細(xì)胞。4 ℃預(yù)冷的PBS緩沖液清洗細(xì)胞2遍，1 800 r·min-1離心5 min。加入100 μL預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，加入FIuo-3AM染料避光染色15 min，于倒置熒光顯微鏡下拍照。

1.8.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用Graph Pad Prism 6等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，組間差異均使用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 紫藤瘤候選活性成分的獲取使用化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫以及查找文獻(xiàn)收集紫藤瘤的所有化學(xué)成分；在TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩選所有化學(xué)成分，經(jīng)篩選符合要求的成分共有8個(gè)，分別是異豆素、美迪紫檀素、芒柄花素、豆甾醇、α-菠甾醇、蒲公英賽醇、β-谷甾醇棕櫚酸酯、(22E，24R)-5α，8α-過氧麥角甾-6，22-二烯-3β-醇，見Tab 1。

2.2 紫藤瘤藥物靶點(diǎn)及胃癌疾病靶點(diǎn)的獲取從PubChem中檢索上述成分Canonical SMILES號(hào)，通過SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫檢索得到上述成分的潛在靶點(diǎn)，去掉重復(fù)，最終得到308個(gè)靶點(diǎn)；通過OMIM數(shù)據(jù)庫和DrugBank數(shù)據(jù)庫篩選胃癌疾病的相關(guān)靶點(diǎn)，最終得到269個(gè)胃癌疾病靶點(diǎn)。

Tab 1 Screening results of active ingredients from

2.3 紫藤瘤治療胃癌的潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)通過UniProt數(shù)據(jù)庫將上述靶點(diǎn)和胃癌疾病靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化為UniProt數(shù)據(jù)庫識(shí)別碼格式。使用Venny2.1.0在線平臺(tái)，將紫藤瘤藥物靶點(diǎn)與胃癌疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射取交集，見Fig 1。預(yù)測(cè)到紫藤瘤候選活性成分的胃癌潛在靶點(diǎn)即紫藤瘤藥物靶點(diǎn)與胃癌疾病靶點(diǎn)的交集，共19個(gè)，分別為MET、EGFR、PIK3CA、CCND1、BRAF、KIT、MTOR、CHEK2、RET、ESR1、FGFR1、RAF1、MDM2、PTGS2、MAP2K1、CBR1、AKR1C3、PTPRF以及NOS2。

Fig 1 Venn diagram of Wisteria sinensis tumor targets

2.4 紫藤瘤治療胃癌的蛋白相互作用(PPI)將共有靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，得到靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖?？芍戎递^高的靶點(diǎn)是蘇氨酸蛋白激酶(MTOR)、磷脂酰肌醇4，5-二磷酸-3-激酶催化亞單位α異構(gòu)體(PIK3CA)、雌激素受體(ESR1)、S-特異性細(xì)胞周期蛋白-D1(CCND1)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)。

Fig 2 PPI protein interaction network diagram

2.5 KEGG和GO分析篩選出19個(gè)直接作用靶點(diǎn)作為本次KEGG通路注釋分析的參與靶點(diǎn)。將符合篩選條件的直接作用靶點(diǎn)呈遞到Metascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG通路注釋分析和GO功能分析。KEGG分析結(jié)果表明，紫藤瘤治療胃癌的相關(guān)信號(hào)通路主要有7條：惡性腫瘤通路、甲狀腺激素信號(hào)通路、甲狀腺癌通路、黏著小帶通路、小細(xì)胞肺癌通路、花生四烯酸代謝通路以及p53信號(hào)通路，見Fig 3。另外，惡性腫瘤通路是KEGG通路富集分析中與胃癌相關(guān)靶點(diǎn)最多的通路，以紫藤瘤活性成分參與惡性腫瘤通路為例，利用R語言clusterProfiler程序包繪制靶點(diǎn)在關(guān)鍵通路中發(fā)揮作用過程可視化圖，見Fig 4，紅色靶點(diǎn)代表紫藤瘤中活性成分的關(guān)鍵靶點(diǎn)在該信號(hào)通路中所參與的過程，這些靶點(diǎn)在該信號(hào)通路中起著關(guān)鍵作用。這表明紫藤瘤活性成分可以通過參與多種通路協(xié)調(diào)發(fā)揮治療胃癌的作用。

GO富集分析包括GO生物過程(biological process，BP)分析、分子功能(molecular function，MF)分析和細(xì)胞組分(cellular component，CC)分析。GO-BP分析結(jié)果見Fig 5，共得到18條結(jié)果，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并按照相關(guān)度排列，主要通過調(diào)節(jié)3個(gè)生物過程進(jìn)而發(fā)揮對(duì)胃癌的治療作用，包括蛋白激酶B信號(hào)通路的正向調(diào)節(jié)、激酶活性的正向調(diào)節(jié)、肽酰絲氨酸磷酸化；GO-MF分析結(jié)果見Fig 6，發(fā)現(xiàn)紫藤瘤活性成分主要通過蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、激酶結(jié)合等分子功能發(fā)揮治療胃癌的作用；GO-CC分析結(jié)果見Fig 7，發(fā)現(xiàn)紫藤瘤活性成分主要通過受體復(fù)合物、核膜、細(xì)胞器外膜等細(xì)胞組分發(fā)揮治療胃癌的作用。

2.6 成分-胃癌靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)將KEGG通路注釋分析的結(jié)果與成分和共有靶點(diǎn)之間相互匹配，得成分-胃癌靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)表，將信息導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，見Fig 8。

Fig 3 KEGG pathway barplot diagram

Fig 4 Process of target playing a role in critical pathway

Fig 5 Functional analysis of GO biological process

Fig 6 GO molecular function analysis

Fig 7 GO cell component analysis

Fig 8 Medicinal-disease-component-target-pathway

圖中藍(lán)色圓形節(jié)點(diǎn)代表8個(gè)成分，紅色菱形節(jié)點(diǎn)代表19個(gè)潛在靶點(diǎn)，綠色正六邊形節(jié)點(diǎn)代表可能涉及的7條信號(hào)通路，邊代表它們之間的相互關(guān)聯(lián)，節(jié)點(diǎn)的大小和顏色的深淺代表度值的大小，節(jié)點(diǎn)越大，顏色越深代表相關(guān)性越大。從圖中可以看出，美迪紫檀素(medicarpin)和異豆素(isoduartin)治療胃癌的潛在靶點(diǎn)最多，一氧化氮合酶(NOS2)、雌激素受體(ESR1)、S-特異性細(xì)胞周期蛋白-D1(CCND1等靶點(diǎn))參與紫藤瘤治療胃癌的關(guān)聯(lián)度最大，發(fā)揮作用最大的通路是惡性腫瘤通路。從圖中可看出同一活性成分可對(duì)應(yīng)于不同的靶點(diǎn)，同一靶點(diǎn)也可對(duì)應(yīng)于不同的活性成分，充分體現(xiàn)了紫藤瘤治療胃癌多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。

2.7 成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果篩選度值較高的5個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)和其對(duì)應(yīng)的潛在活性化合物進(jìn)行了分子對(duì)接驗(yàn)證，見Tab 2。結(jié)合能小于0，說明受體分子與配體分子能自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能絕對(duì)值越高，對(duì)接能力越強(qiáng)，對(duì)接后分子的穩(wěn)定性越高。對(duì)接結(jié)果顯示化合物與治療胃癌的受體蛋白的結(jié)合能均小于-7 kcal·mol-1，說明成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子均能較穩(wěn)定的結(jié)合。分子對(duì)接的可視化結(jié)果見Fig 9。

Tab 2 Binding energy of compounds and top

Fig 9 Visual results of molecular docking of compounds

2.8 化合物抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的作用利用MTT法檢測(cè)不同濃度的化合物抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖的影響，見Fig 10。與空白對(duì)照組相比，芒柄花素能顯著抑制人胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖。

Fig 10 Effect of formononetin on viability of SGC-7901

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.9 AV-PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)芒柄花素誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡的作用芒柄花素作用于SGC-7901細(xì)胞4 h后，F(xiàn)ig 11結(jié)果顯示，正常對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為(3.47±0.92)%，隨著芒柄花素濃度的增加細(xì)胞凋亡率明顯增加，對(duì)SGC-7901的細(xì)胞凋亡率分別為(7.12±1.36)%、(27.65±4.12)%，與空白組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.10 芒柄花素對(duì)SGC-7901細(xì)胞鈣離子水平的影響通過FIuo-3AM檢測(cè)芒柄花素作用SGC-7901細(xì)胞前后鈣離子水平的變化，F(xiàn)ig 12可見，空白組細(xì)胞呈現(xiàn)均一暗淡的綠色熒光，而隨著芒柄花素藥物濃度的增加，綠色熒光水平呈濃度依賴性增加，在芒柄花素80 μmol·L-1濃度組中可見明亮的綠色熒光。表明芒柄花素可以濃度依賴性增加細(xì)胞鈣離子的水平。

3 討論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對(duì)接探討紫藤瘤治療胃癌的可能有效成分及潛在作用機(jī)制，并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果挖掘了紫藤瘤治療胃癌的8個(gè)候選活性成分和相應(yīng)的19個(gè)靶點(diǎn)及7條信號(hào)通路，證明紫藤瘤確實(shí)具有一定的抗胃癌潛力。

在8個(gè)活性成分當(dāng)中，美迪紫檀素、異豆素以及芒柄花素治療胃癌的潛在靶點(diǎn)最多，提示其在紫藤瘤治療胃癌中可能會(huì)發(fā)揮重要作用。在此基礎(chǔ)上，選取了這3個(gè)成分與MTOR、PIK3CA、CCND1等關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，結(jié)果表明，其結(jié)合能均小于-7.0 kcal·mol-1，提示有較好的結(jié)合活性。利用體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明芒柄花素能顯著抑制人胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖。董陳誠(chéng)等[12]研究表明，芒柄花素可能會(huì)通過激活NF-κB信號(hào)通路抑制人胃癌MKN-45細(xì)胞株的增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。李偉東等[13]研究美迪紫檀素對(duì)人肝癌細(xì)胞Hep2有抑制和殺滅的作用，本研究結(jié)果也為后續(xù)研究提供了思路。

成分-靶點(diǎn)-通路圖中表明了紫藤瘤通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療胃癌。通過圖中關(guān)聯(lián)度比較可以看出，NOS2、ESR1、CCND1、EGFR等靶點(diǎn)可能是紫藤瘤抗胃癌的核心靶點(diǎn)。NOS2一氧化氮合酶，其在胃癌組織中的表達(dá)水平高于正常胃旁組織。梁春艷[14]研究表明通過誘導(dǎo)AGS細(xì)胞凋亡，可以抑制NOS2的表達(dá)，從而提高胃癌患者的總生存率。ESR1為雌激素受體，它可以通過多種途徑與其他信號(hào)分子相互作用，在胃癌中，其與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)[15]。CCND1是S-特異性細(xì)胞周期蛋白-D1，劉久鵬等[16]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)通過降低胃癌MGC-803細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，下調(diào)CCND1的表達(dá)可以將人胃癌MGC-803細(xì)胞阻滯于G0/G1期。EGFR是表皮生長(zhǎng)因子受體，繆鵬飚等[17]研究發(fā)現(xiàn)，干擾EGFR的表達(dá)能夠調(diào)節(jié)基因組變化來抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)達(dá)到治療胃癌的目的。

Fig 11 Effect of formononetin on apoptotic rate of SGC-7901 cells detected by flow cytometry**P<0.01 vs control

Fig 12 Effect of anthocyanin on calcium level of SGC-7901 cells detected by Fluo-3AM staining(×100)**P<0.01 vs control

KEGG通路結(jié)果顯示，惡性腫瘤信號(hào)通路富集靶點(diǎn)最多，提示其可能是紫藤瘤治療胃癌較顯著的通路，在靶點(diǎn)參與通路的可視化圖中，EGFR、MET等基因參與了調(diào)節(jié)惡性腫瘤通路發(fā)揮作用。另外，研究也發(fā)現(xiàn)p53信號(hào)通路在治療胃癌中的影響作用愈發(fā)明顯[18]。

綜上所述，本研究探討了紫藤瘤治療胃癌的可能活性成分及潛在作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究及臨床應(yīng)用提供了參考。