新橙皮苷治療潰瘍性結(jié)腸炎的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

吳與倫，張欣然，沈阿靈，劉麗雅，魏麗慧，陳友琴，方 翌*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新與轉(zhuǎn)化中心，福建 福州 350122；4.美國(guó)凱斯西儲(chǔ)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，俄亥俄州 克利夫蘭 44106）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性炎癥性腸病，以黏膜和胃腸道生理改變?yōu)樘卣?，臨床表現(xiàn)為腹痛、便血、腹瀉、體質(zhì)量減輕，但目前其發(fā)病機(jī)制尚不清楚［1］。UC 的主要病機(jī)以濕熱瘀血為標(biāo)，脾腎虧虛為本；清熱化濕散瘀、止瀉止痢為其治法治則［2］。中醫(yī)藥治療UC 的歷史悠久，臨床療效確切，抗炎效果顯著［3］。清化腸飲是臨床治療UC 的常用方，方中厚樸苦燥降瀉，辛散溫通，入大腸經(jīng)，是中醫(yī)學(xué)治療胃腸疾病要藥［4］。新橙皮苷作為厚樸中的活性成分，在最新的研究中被證實(shí)具有較強(qiáng)的抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用，可減輕DSS誘導(dǎo)的UC 小鼠結(jié)腸黏膜組織病理損傷，但其治療UC 中的作用機(jī)制尚未明確［5-7］。因此，本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，初步探討新橙皮苷治療潰瘍性結(jié)腸炎的相關(guān)機(jī)制，以期闡明新橙皮苷治療UC 的新機(jī)制和新靶點(diǎn)，為臨床研發(fā)治療UC 藥物提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30 只雄性SPF C57BL/6J 小鼠，8～10 周齡，體質(zhì)量（21±3）g，購(gòu)自上海SLAC 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SYXK（閩）2020-0002。本實(shí)驗(yàn)已通過福建中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（FJTCM IACUC 2022185）。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物的配制 新橙皮苷給藥劑量按照人與動(dòng)物體型系數(shù)換算，每只小鼠按照0.1 mL/10 g 的灌胃劑量配制藥物，以蒸餾水配置0.5、5、50 mg/（kg·d）的新橙皮苷混懸液，超聲4～5 h 至液體充分溶解澄清透明，每日現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑 DSS 購(gòu)自美國(guó)MP Biochemicals 公司（貨號(hào)：0216011080-100 g）；新橙皮苷購(gòu)自北京MedChemExpress 有限公司，純度＞98.48%（貨號(hào)：HY-N0101）；便隱血（OB）試劑（匹拉米洞法）購(gòu)自珠海市貝索生物技術(shù)有限公司（貨號(hào)：BA2020B）；4%多聚甲醛固定液、蘇木素溶液購(gòu)自北京索萊寶公司（貨號(hào)：LA0427、G1140）；免疫組化超敏Ultra-SensitiveTMSP 試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司（貨號(hào)：KIT-9710）；p-p38 一抗購(gòu)自南京SAB公司（貨號(hào)：12322）；p38 一抗購(gòu)自美國(guó)CST 公司（貨號(hào)：8690）。

1.4實(shí)驗(yàn)儀器 生物組織脫水機(jī)和生物組織石蠟包埋機(jī)購(gòu)自湖北孝感亞光有限公司；全自動(dòng)石蠟切片機(jī)和倒置顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica 公司；熒光正置顯微鏡購(gòu)自日本Nikon 公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1潰瘍性結(jié)腸炎疾病靶點(diǎn)的收集 以“ ulcerative colitis”為檢索詞，在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）和DisGenet（http：//www.disgenet.org/）2 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索UC 的相關(guān)人類基因靶點(diǎn)，并將2 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中的靶點(diǎn)取并集并刪除重復(fù)項(xiàng)。

2.2新橙皮苷作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）、中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)（TCMIP，http：//www.tcmip.cn/TCMIP/index.php）、Swisstargets數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、Sym-Map（http：//www.symmap.org/）、BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）中檢索新橙皮苷潛在蛋白靶點(diǎn)，利用Unitprot 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.Unitprot.org/）將獲取的蛋白靶點(diǎn)校準(zhǔn)其基因名并刪除重復(fù)項(xiàng)，與UC 的疾病相關(guān)靶點(diǎn)取交集獲得的新橙皮苷治療UC 的潛在靶點(diǎn)。

2.3GO 和KEGG 富集分析 將“2.2”項(xiàng)中預(yù)測(cè)的新橙皮苷治療UC 的潛在靶點(diǎn)基因名輸入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/）中，設(shè)置物種為“ homo sapiens”，進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，篩選P＜0.005的結(jié)果，從中選取KEGG 通路富集排名前20和GO 分類富集排名前10 的結(jié)果，使用R-Studio 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化，并分別繪制相應(yīng)氣泡圖。

2.4構(gòu)建靶點(diǎn)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò) 將“2.2”中新橙皮苷治療UC 的潛在靶點(diǎn)基因名導(dǎo)入STRING 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/），設(shè)置物種為“ homo sapiens”，置信度設(shè)定＞0.9，獲取作用靶點(diǎn)的互作信息。通過Cytoscape 3.7.2 軟件繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，并對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，確定新橙皮苷治療UC 的核心靶點(diǎn)。

2.5小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型的構(gòu)建 采用口服2%葡聚糖硫酸鈉（DSS）溶液的方法建立潰瘍性結(jié)腸炎模型［8］，讓小鼠自由飲用7 d 2% DSS 溶液，DSS溶液每天更換1 次，第8～10 d 恢復(fù)正常飲水，第11 d 取材，期間正常飲食。

2.6分組與干預(yù) 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，在開始構(gòu)建模型前，通過隨機(jī)數(shù)字表法將其分為對(duì)照組、模型組和低、中、高劑量組，每組6 只。構(gòu)建模型后，對(duì)照組和模型組小鼠使用蒸餾水灌胃，低、中、高組（具體劑量參見“1.2”）使用配置好的不同濃度新橙皮苷溶液灌胃。

2.7疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）評(píng)分及體質(zhì)量變化計(jì)算 造模期間每日通過盲法評(píng)估每只小鼠臨床特征：包括糞便性狀、體質(zhì)量改變和便血程度情況，并參考JACKSON 等［9］的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算DAI 評(píng)分。同時(shí)，每日記錄小鼠體質(zhì)量與給藥第1 天變化百分比，繪制小鼠體質(zhì)量變化百分率折線圖［10-11］。

2.8結(jié)腸組織免疫組化檢測(cè) 給藥干預(yù)11 d 后取材，小鼠結(jié)腸組織固定于4%多聚甲醛中；24 h 后，進(jìn)行組織梯度乙醇脫水及二甲苯石蠟透明，將結(jié)腸組織包埋于石蠟，切成4 μm 切片，用顯微鏡載玻片承載后60 ℃烘烤5 h，將其脫蠟至水化，以0.25%TritonX-100 的PBS 溶液破膜10 min。隨后，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性10 min，并用封閉液阻斷抗體非特異性結(jié)合1 h。將切片與p-p38 或p38 抗體在4 ℃下孵育過夜，然后與酶標(biāo)二抗孵育1 h。最后使用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）試劑盒和蘇木素對(duì)樣本進(jìn)行染色，然后在鏡下觀察并拍照。

2.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料服從正態(tài)分布以（±s）表示，多組間體質(zhì)量變化和免疫組化陽性率比較采用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用［M（P25，P75）］表示，多組間DAI 評(píng)分比較采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1新橙皮苷治療UC 的潛在作用靶點(diǎn) 由Gene-Cards 數(shù)據(jù)庫(kù)和DisGenet 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得2 374 個(gè)UC 疾病作用靶點(diǎn)，TCMSP、Swiss Target Prediction、TCMIP、SymMap、BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索合計(jì)獲取101 個(gè)新橙皮苷作用靶點(diǎn)。將新橙皮苷潛在蛋白靶點(diǎn)與UC 相關(guān)疾病靶點(diǎn)相映射，二者交集獲得51 個(gè)新橙皮苷治療UC 的潛在靶點(diǎn)，見圖1。

圖1 新橙皮苷治療UC 的潛在靶點(diǎn)

3.2GO 功能富集分析 采用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)新橙皮苷治療UC 的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能富集分析，獲得50 個(gè)涉及生物過程（biological process，BP），包括對(duì)外源性刺激的反應(yīng)、膠原分解代謝過程、細(xì)胞外基質(zhì)分解、蛋白水解、基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控、環(huán)氧合酶途徑等，見圖2；20 個(gè)細(xì)胞組分（cellular component，CC），包括細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外間隙、大分子復(fù)合物、外泌體、細(xì)胞質(zhì)膜等，見圖3；42 個(gè)分子功能（molecular function，MF），包括內(nèi)肽酶活性、金屬內(nèi)肽酶活性、絲氨酸內(nèi)肽酶活性、酶結(jié)合、相同蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄共激活因子結(jié)合等。見圖4。

圖2 新橙皮苷生物過程分析圖

圖3 新橙皮苷細(xì)胞組分分析圖

圖4 新橙皮苷分子功能分析圖

3.3KEGG 通路分析 使用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路分析，得到66 條通路，根據(jù)富集的基因數(shù)的多少進(jìn)行排序，整理出排名前20 名，繪制氣泡圖。這些交潛在靶點(diǎn)主要富集的通路包括MAPK 信號(hào)通路、癌癥的發(fā)病途徑、化學(xué)致癌-活性氧、內(nèi)分泌耐藥、雌激素信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE 通路、IL-17 信號(hào)通路等。見圖5。

圖5 潛在靶點(diǎn)KEGG 信號(hào)通路富集分析結(jié)果

3.4潛在靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)分析新橙皮苷治療UC 的潛在靶點(diǎn)，構(gòu)建獲取50 個(gè)節(jié)點(diǎn)，172 條節(jié)點(diǎn)連接線的蛋白互作PPI 網(wǎng)絡(luò)。Cytoscape 3.7.2 軟件繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，節(jié)點(diǎn)平均度值為10.244 897 96，接近中心性平均值為0.515 360 558，介數(shù)中心度平均值為0.021 421 335。其中，有19 個(gè)節(jié)點(diǎn)度值＞平均數(shù)，包括：絲裂原激活蛋白激酶14（MAPK14；p38）、白蛋白（ALB）、環(huán)狀素受體1（ESR1）、纖維連接蛋白1（FN1）、胱天蛋白酶3（CASP3）、環(huán)氧合酶2（PTGS2）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2（FGF2）、干擾素（IFNG）、前列腺素-內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）、胱天蛋白酶1（CASP1）等，以上節(jié)點(diǎn)為新橙皮苷治療UC 的核心靶點(diǎn)。見圖6。

圖6 新橙皮苷治療UC 潛在靶點(diǎn)蛋白PPI 互作圖

3.5不同劑量新橙皮苷對(duì)UC 小鼠體質(zhì)量的影響 為進(jìn)一步驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)采用不同劑量新橙皮苷干預(yù)UC 模型小鼠，初步分析新橙皮苷的藥效和作用機(jī)制。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，模型組在服用DSS 后體質(zhì)量出現(xiàn)顯著下降（P＜0.05）；然而與模型組相比，低、中、高劑量干預(yù)后，體質(zhì)量都出現(xiàn)顯著升高（P＜0.05）。見圖7。

圖7 新橙皮苷干預(yù)對(duì)UC 小鼠體質(zhì)量的影響

3.6不同劑量新橙皮苷對(duì)UC 小鼠DAI 評(píng)分的影響 5 組小鼠的DAI 評(píng)分顯示，在第11 天時(shí)，對(duì)照組的小鼠DAI 評(píng)分為0；與對(duì)照組相比，模型組在服用DSS 后DAI 評(píng)分顯著上升（P＜0.05）；與模型組相比，低、中、高劑量新橙皮苷干預(yù)都能顯著降低DAI 評(píng)分（P＜0.05）。見圖8。

圖8 新橙皮苷干預(yù)對(duì)UC 小鼠DAI 評(píng)分的影響

3.7不同劑量新橙皮苷對(duì)UC 小鼠結(jié)腸組織中pp38、p38 蛋白的影響 KEGG 富集到的關(guān)鍵通路MAPK 通路中重要組成部分p38（MAPK14）同樣在的PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中富集到，結(jié)合圖5 和圖6 的分析結(jié)果，對(duì)排分靠前的MAPK 通路關(guān)鍵蛋白pp38 和p38 進(jìn)行驗(yàn)證分析。結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，模型組小鼠的結(jié)腸組織蛋白中p-p38 蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），p38 蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，低、中、高劑量組小鼠結(jié)腸組織蛋白p-p38蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），p38 蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖9—12。

圖9 5 組結(jié)腸組織p-p38 蛋白陽性面積率比較

圖10 5 組結(jié)腸組織p-p38 蛋白表達(dá)（×400）

圖11 5 組結(jié)腸組織p38 蛋白表達(dá)（×400）

圖12 5 組結(jié)腸組織p38 蛋白陽性面積率比較

4 討 論

先前的研究發(fā)現(xiàn)，新橙皮苷可通過降低結(jié)腸組織中促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β 的表達(dá)水平來發(fā)揮其對(duì)UC 的保護(hù)作用［5］。本研究通過TCMSP、Swiss Target Prediction、TCMIP、SymMap、BATMANTCM 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行新橙皮苷靶點(diǎn)的挖掘，并通過Dis-Genet 和GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行UC 靶點(diǎn)的挖掘，篩選并確定新橙皮苷可能作用于UC的潛在靶點(diǎn)51個(gè)。通過KEGG 通路分析，富集到MAPK 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、化學(xué)致癌-活性氧通路等信號(hào)通路。MAPK 信號(hào)通路的激活主要涉及JNK、ERK 和p38的磷酸化，進(jìn)一步激活細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄信號(hào)從而在細(xì)胞增殖與分化、凋亡、調(diào)節(jié)炎癥等生理和病理過程中發(fā)揮重要作用［12］。林雄［13］發(fā)現(xiàn)MAPK通路的激活可以促進(jìn)NF-κB p65 的磷酸化，上調(diào)炎癥細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6 和IL-1β 的表達(dá)水平，通過蒼術(shù)醇提物抑制MAPK 通路的激活可改善UC 癥狀。IL-17 是一種促炎因子，在多種細(xì)胞中都有表達(dá)，通過促進(jìn)TNF-α、IL-6 等炎性因子的釋放，發(fā)揮擴(kuò)大炎癥等功能［14］。馬杰等［15］研究結(jié)果表明，黃芩多糖可通過抑制IL-17 的表達(dá)發(fā)揮對(duì)UC 的治療作用。活性氧（reactive oxygen species，ROS）的過量累積導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，促進(jìn)炎癥反應(yīng)［16］。研究發(fā)現(xiàn)在UC 腸道黏膜中會(huì)過量生成ROS，促進(jìn)組織損傷［17］。這些研究進(jìn)一步佐證了新橙皮苷可能通過調(diào)控MAPK 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、活性氧相關(guān)通路來發(fā)揮其對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的保護(hù)作用。

本研究通過構(gòu)建新橙皮苷治療UC 的潛在作用靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)MAPK14（p38）、CASP1、PTGS2 等靶點(diǎn)可能參與新橙皮苷治療UC 的作用機(jī)制。陳賽等［18］研究證實(shí)白芍七物顆粒干預(yù)UC 小鼠，能降低p38 的磷酸化水平，通過阻斷NOXs-ROS-p38 信號(hào)通路的傳導(dǎo)，緩解UC 小鼠結(jié)腸組織的炎癥反應(yīng)；EPSTEIN 等［19］研究證實(shí)，姜黃素可通過阻斷p38 MAPK 信號(hào)通路，減輕結(jié)腸黏膜組織的白細(xì)胞浸潤(rùn)，有效治療DSS 誘導(dǎo)的UC 小鼠的結(jié)腸炎性病變。Caspase-1 是介導(dǎo)細(xì)胞焦亡所依賴的核心蛋白，它的激活是細(xì)胞焦亡經(jīng)典途徑的核心，屬于免疫系統(tǒng)的重要組成部分［20］。研究表明，人炎性腸組織中Caspase-1 活化水平比正常腸組織中活化水平更高［21］。PTGS2 在調(diào)控免疫應(yīng)答發(fā)揮重要作用，主要表達(dá)在單核細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞中，在UC發(fā)展過程中對(duì)結(jié)腸黏膜愈合有促進(jìn)作用［22］。這些研究提示新橙皮苷可能通過MAPK14（p38）、CASP1、PTGS2 等關(guān)鍵靶點(diǎn)的表達(dá)水平，調(diào)控相關(guān)免疫應(yīng)答，治療DSS 誘導(dǎo)的UC 小鼠的結(jié)腸炎性病變。

UC 的主要臨床表現(xiàn)是腹痛、腹瀉、黏液膿血便等，DSS 為經(jīng)典的UC 造模方法，利用DAI 評(píng)分能反映該模型中UC 體質(zhì)量下降、腹瀉、黏液膿血便情況。本研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中DSS 造模后的UC 小鼠出現(xiàn)了明顯的DAI 評(píng)分升高和體質(zhì)量下降，而新橙皮苷可顯著降低DSS 誘導(dǎo)的UC 小鼠體質(zhì)量下降和DAI評(píng)分升高，結(jié)果表明新橙皮苷可緩解DSS 誘導(dǎo)的UC 小鼠的UC 體質(zhì)量下降、腹瀉、黏液膿血便癥狀。再以該模型驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析富集出的MAPK14（p38）關(guān)鍵靶點(diǎn)，通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，可得出以下結(jié)果：在DSS 誘導(dǎo)的UC 小鼠模型中，新橙皮苷干預(yù)能夠顯著逆轉(zhuǎn)模型組小鼠結(jié)腸組織中p38 蛋白磷酸化水平的升高，提示新橙皮苷對(duì)UC 的治療作用可能是通過發(fā)揮對(duì)p38 MPAK 通路的抑制而實(shí)現(xiàn)。

綜上，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)新橙皮苷治療UC 的相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行探討。采用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)新橙皮苷調(diào)控p38 MPAK 信號(hào)通路，進(jìn)而起到抑制UC 的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)行驗(yàn)證，為臨床中研發(fā)防治UC的藥物提供了有效的依據(jù)。不足之處在于，研究中僅對(duì)p38 MPAK 信號(hào)通路進(jìn)行了探索驗(yàn)證，并未對(duì)該通路上下游相關(guān)通路蛋白進(jìn)一步分析，計(jì)劃在下一步的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行探究。