β-谷甾醇對(duì)帕金森病模型大鼠腦氧化應(yīng)激損傷及Nrf2/HO-1蛋白通路的影響

袁明洲，袁欣欣，林 瑤，蔡 晶

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)修園臨床醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122）

帕金森?。≒arkinson's disease，PD）是世界第二大神經(jīng)退行性疾?。?］。中腦部位的黑質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元（dopaminergic neurons，DN）的進(jìn)行性損傷是造成PD 的主要病理變化。而氧化應(yīng)激的發(fā)生可導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)氧化-還原失衡，進(jìn)而導(dǎo)致生成大量活性氧，這是導(dǎo)致中腦黑質(zhì)DN 損害的重要原因［2-3］。在臨床中往往采用口服左旋多巴，即美多芭外源性補(bǔ)充多巴胺進(jìn)行治療。但單一長(zhǎng)期用藥易引起較多不良反應(yīng)，因此可考慮聯(lián)合用藥。核轉(zhuǎn)錄因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）是一種氧化還原的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［4］。大部分抗氧化細(xì)胞產(chǎn)生的保護(hù)蛋白表達(dá)受Nrf2 信號(hào)蛋白的調(diào)控。在PD 患者中，Nrf2 及下游蛋白醌氧化還原酶-1（NQO-1）激活可有效保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷［5］。β-谷甾醇（β-sitosterol）是一種重要的植物甾醇，廣泛存在于如肉蓯蓉、半夏等中藥植物中，具有顯著的抗氧化作用［6］，β-谷甾醇還可在不影響線粒體外膜的情況下，使線粒體膜電位及ATP 含量增加，起到緩解神經(jīng)退行性疾病的作用［7］。但β-谷甾醇能否改善PD 大鼠腦氧化應(yīng)激損傷尚有待研究。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)構(gòu)建PD 動(dòng)物模型驗(yàn)證β-谷甾醇對(duì)大腦氧化應(yīng)激的保護(hù)作用，進(jìn)一步探究是否通過(guò)Nrf2 及下游蛋白Nrf2、HO-1、NQO-1 發(fā)揮作用，為β-谷甾醇對(duì)PD 氧化應(yīng)激的保護(hù)作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2 月齡SPF 級(jí)SD 雄性大鼠40 只，體質(zhì)量為（200±20）g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（閩）2019-0007。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)條件：室溫（22±2）℃，濕度（60±5）%，飼喂標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料，自由飲水和取食。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 β-谷甾醇（貨號(hào)：S1270）、魚(yú)藤酮（貨號(hào)：R8875）均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；美多芭（貨號(hào)：H10930198）購(gòu)自上海羅氏制藥有限公司；魚(yú)藤酮（貨號(hào)：A8007）、葵花油乳化液（貨號(hào)：H8923）均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；丙二醛（MDA）測(cè)試盒（貨號(hào)：A003-1）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（貨號(hào)：A001-1）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；SDSPAGE 凝膠配置試劑盒（貨號(hào)：P0012A）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；ECL 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：B500022）購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；PVDF 膜（貨號(hào)：W0162）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒（貨號(hào)：PT0001）購(gòu)自福建邁新技術(shù)有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司）；倒置顯微鏡（上海尼康儀器有限公司）；光學(xué)顯微鏡（上海徠卡儀器有限公司）；石蠟切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；石蠟包埋機(jī)（孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)公司）；電泳儀（上海伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)醫(yī)學(xué)產(chǎn)品公司）；轉(zhuǎn)膜儀（上海伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品公司）；化學(xué)發(fā)光成像儀（上海伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1分組與造模 將40 只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、治療組和美多芭組，每組10只。模型組、治療組及美多芭組大鼠采用魚(yú)藤酮葵花油乳液（將魚(yú)藤酮、葵花油乳液按1.5∶1 比例混合均勻）頸背部皮下注射，每只大鼠注射劑量為1.5 mg/（kg·d），連續(xù)注射14 d［8］。根據(jù)VOITENKO 等［9］行為學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，得分2～8 分者為合格的PD 模型大鼠。PD 模型大鼠表現(xiàn)為自主行為減少，拒捕行為減弱，弓背向上抬高，單側(cè)斜臥，行走困難。正常組大鼠正常飲食，不予處理。

2.2給藥方法 以60 mg/（kg·d）β-谷甾醇的給藥劑量對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃［10］，美多芭組予5 mg/（kg·d）美多芭混懸液灌胃，正常組、模型組大鼠采用生理鹽水灌胃。以上各組給藥均為每天1次，連續(xù)14 d。

2.3觀察指標(biāo)

2.3.1大鼠一般情況 每天觀察4 組大鼠進(jìn)食、飲水、活動(dòng)、精神情況，并做好記錄。

2.3.2血清SOD、MDA 含量 造模、干預(yù)成功后，所有大鼠處死留取血液，離心后取上層血清，采用SOD、MDA 試劑檢測(cè)4 組大鼠血清中SOD、MDA含量。

2.3.3腦黑質(zhì)組織TH、Nrf2 陽(yáng)性細(xì)胞率 取4 組大鼠腦黑質(zhì)組織于多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋后切片。切片烘干脫蠟后進(jìn)行抗原修復(fù)，再用內(nèi)源性過(guò)氧化物酶孵育10 min，PBS 清洗，非特異性染色阻斷劑孵育10 min，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，第2 天烘箱37 ℃復(fù)溫30 min，二抗孵育10 min，PBS 清洗，鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶孵育10 min，最后DAB 染色。200 倍顯微鏡下觀察，以棕黃色或淡黃色顆粒染色為陽(yáng)性表達(dá)。每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)視野，應(yīng)用Image Plus 6.0 軟件分析圖像，讀取TH、Nrf2 陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞率，取平均值。

2.3.4腦黑質(zhì)組織Nrf2、HO-1、NQO-1 蛋白表達(dá)量 取相應(yīng)腦組織50 mg，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。經(jīng)過(guò)蛋白變性、SDS-PAGE 電泳、濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂牛奶封閉1 h。加一抗 Nrf2（1∶1000）、HO-1（1∶1 000）、NQO-1（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000），4 ℃搖床過(guò)夜。TBST 洗滌，加入二抗稀釋液（1∶5 000），室溫孵育2 h，TBST 洗滌，ECL 顯影并成像，Image Lab 4.0 軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與β-actin 條帶灰度值的比值做為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析；各組間的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.14 組一般情況比較 造模后正常組大鼠活動(dòng)無(wú)差異；模型組大鼠造模7 d 后出現(xiàn)皮毛變黃，自發(fā)活動(dòng)減少，尾部僵硬，弓背向上抬高，行走困難等帕金森癥狀。治療組和美多芭組大鼠一般情況有較為明顯改善，皮毛較光亮，行動(dòng)不便情況也有所好轉(zhuǎn)。

3.24 組血清SOD、MDA 含量比較 與正常組比較，模型組大鼠血清中SOD 含量降低，MDA 含量升高（P＜0.05）。與模型組比較，治療組和美多芭組SOD 含量升高，MDA 水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 4 組血清中SOD、MDA 含量比較（±s） μg/moL

表1 4 組血清中SOD、MDA 含量比較（±s） μg/moL

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

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3.34 組腦黑質(zhì)組織TH、Nrf2 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況比較 與正常組比較，模型組TH、Nrf2 陽(yáng)性細(xì)胞率均減少（P＜0.05）；與模型組比較，治療組和美多芭組TH、Nrf2 陽(yáng)性細(xì)胞率均增加（P＜0.05）。見(jiàn)圖1-2、表2。

圖1 4 組腦黑質(zhì)TH 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況（免疫組化，×200）

圖2 4 組腦黑質(zhì)區(qū)Nrf2 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況（免疫組化，×200）

表2 4 組腦黑質(zhì)TH、Nrf2 陽(yáng)性細(xì)胞率比較（±s）

表2 4 組腦黑質(zhì)TH、Nrf2 陽(yáng)性細(xì)胞率比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

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3.44 組腦組織Nrf2、HO-1、NQO-1 蛋白表達(dá)情況 見(jiàn)圖3、表3。

圖3 4 組腦組織Nrf2、HO-1、NQO-1 蛋白條帶圖

表3 4 組腦組織Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表3 4 組腦組織Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

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4 討 論

PD 是高發(fā)于老年人的慢性神經(jīng)退行性疾病，其主要病理特征為中腦DN 凋亡導(dǎo)致其數(shù)目減少。造成DN 凋亡的機(jī)制尚未完全明確，但氧化應(yīng)激損傷起到了十分重要的作用。氧化應(yīng)激造成腦內(nèi)氧化與還原能力的失衡，增多的氧化產(chǎn)物損害中樞組織和細(xì)胞的功能，引發(fā)PD 癥狀［11］。因此尋找有效的抗氧化藥物成為PD 治療的有效手段。

β-谷甾醇是一種廣泛存在于中草藥植物根、莖、葉中的植物甾醇，具有多種生物學(xué)活性，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抗衰老、修復(fù)損傷和調(diào)節(jié)血糖等多種作用［12-14］。尤其引人注意的是，β-谷甾醇在如阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病中的作用。SHI等［15］的研究證實(shí)，β-谷甾醇可抑制葡萄糖氧化酶誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷及脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，從而改善因腦脂質(zhì)過(guò)氧化引起的阿爾茨海默病。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用β-谷甾醇干預(yù)后，治療組大鼠自主行為、拒捕行為增多，弓背向上抬高、行動(dòng)困難等PD 相關(guān)癥狀有所改善。TH 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)反應(yīng)腦內(nèi)存活的多巴胺神經(jīng)元的數(shù)量，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，運(yùn)用β-谷甾醇治療后，治療組TH 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與模型組比較有所增加，說(shuō)明β-谷甾醇可有效保護(hù)PD 大鼠多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞。

SOD 是機(jī)體重要的抗氧化酶蛋白質(zhì)，可有效去除氧自由基，起到重要的維持氧化和抗氧化平衡的作用。但在PD 患者中，SOD 含量往往降低［16］。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，PD 小鼠模型腦部病變區(qū)域MDA 含量增加，而MDA 是重要的脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)［17］。YIN等［18］在急性肝損傷小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇可增高小鼠SOD、降低MDA 的表達(dá)，起到較好的抗氧化應(yīng)激作用。本研究采用β-谷甾醇干預(yù)PD 大鼠模型，大鼠血清中SOD 含量高于模型組，MDA 濃度低于模型組。提示β-谷甾醇在PD 中亦有較好的抗氧化應(yīng)激作用。

為進(jìn)一步明確β-谷甾醇在PD 中的抗氧化作用機(jī)制，本研究采用免疫組化檢測(cè)腦黑質(zhì)中Nrf2 表達(dá)，Western blot檢測(cè)PD大鼠腦組織中的Nrf2、HO-1、NQO-1 的蛋白表達(dá)情況。Nrf2 是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化調(diào)節(jié)因子［19］，當(dāng)機(jī)體細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷時(shí)，磷酸化的Nrf2 進(jìn)入細(xì)胞核并激活下游抗氧化基因HO-1 和NQO-1 的表達(dá)，使HO-1 和NQO-1 蛋白含量上調(diào)。HO-1 的抗氧化作用體現(xiàn)在可阻止游離膽紅素參與氧化應(yīng)激反應(yīng)及能夠激活具有抗氧化作用的膽紅素［20］，而NQO-1 可抑制ROS 的生成［21］，兩者共同發(fā)揮抗氧化損傷能力和保護(hù)細(xì)胞作用［22］?；诖耍琋rf2 及下游蛋白HO-1 和NQO-1 可在多種由氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致的疾病中起到保護(hù)作用［23］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組腦黑質(zhì)中Nrf2 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較正常組降低，β-谷甾醇治療后，Nrf2 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)有所增加。同時(shí)，Western blot 結(jié)果顯示，模型組Nrf2、HO-1、NQO-1 表達(dá)較正常組降低，而在β-谷甾醇干預(yù)后，Nrf2、HO-1、NQO-1 表達(dá)較模型組升高，說(shuō)明β-谷甾醇可通過(guò)上調(diào)Nrf2 并激活其下游基因發(fā)揮抗氧化應(yīng)激損傷的作用。

綜上，β-谷甾醇可能通過(guò)Nrf2/HO-1 信號(hào)通路起到有效去除氧自由基、降低脂質(zhì)過(guò)氧化的作用，一定程度抑制PD 大鼠腦組織中氧化應(yīng)激損傷，從而發(fā)揮保護(hù)黑質(zhì)神經(jīng)元的作用。