泰山磐石散對(duì)自然流產(chǎn)模型大鼠子宮蛻膜組織中T-bet/GATA-3的影響

陸登艷，陳蘇蘇，鐘 濱，陳 越，鐘玉環(huán)，王 林，黃玉梅，江 澍

（福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122）

自然流產(chǎn)（spontaneous abortion，SA），中醫(yī)學(xué)屬“胎漏”“滑胎”“胎動(dòng)不安”［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)SA 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)占臨床妊娠的10%～15%［2］。其病因十分復(fù)雜，包括免疫調(diào)節(jié)失衡、內(nèi)分泌異常、子宮解剖結(jié)構(gòu)異常等［3］。有研究表明，免疫調(diào)節(jié)失衡是SA 的重要病理機(jī)制之一［4］。T 盒子轉(zhuǎn)錄因子（T-bet）和GATA 結(jié)合蛋白3（GATA-3）是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，它們對(duì)免疫細(xì)胞的分化和功能具有重要作用［5］。泰山磐石散是治療SA 的經(jīng)典方劑，也是我國(guó)古代安胎方劑中的代表之一，出自《古今醫(yī)統(tǒng)大全》，由人參一錢(qián)（3 g）、黃芪一錢(qián)（3 g）、白術(shù)五分（1.5 g）、炙甘草五分（1.5 g）、當(dāng)歸一錢(qián)（3 g）、川芎八分（2 g）、白芍藥八分（2 g）、熟地黃八分（2 g）、川續(xù)斷一錢(qián)（3 g）、糯米一撮（3 g）、黃芩一錢(qián)（3 g）、砂仁五分（1.5 g）組成［6］。前期研究表明，泰山磐石散可以明顯降低大鼠血清中Th1 經(jīng)典分泌因子干擾素-γ（IFN-γ）和白細(xì)胞介素-2（IL-2）的表達(dá)；明顯升高Th2 型經(jīng)典分泌因子白細(xì)胞介素-10（IL-10）的表達(dá)，從而改善胚胎流產(chǎn)情況［7］。因此，本研究通過(guò)觀察泰山磐石散對(duì)自然流產(chǎn)模型大鼠蛻膜組織中Th1/Th2 型細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet/GATA-3 表達(dá)水平的影響，以期為SA 的防治提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)屏障系統(tǒng)中的SD大鼠30只，雌雄各半，體質(zhì)量240±20 g，均來(lái)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為：SCXK（滬）2018-0004，于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心中統(tǒng)一喂養(yǎng)，其室內(nèi)溫度為（25±1）℃，空氣濕度為（50±10）%，每12 h 明暗循環(huán)交換，大鼠可自由攝食和飲水。動(dòng)物使用許可證編號(hào)為SYXK（閩）2020-0002，本研究已獲福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批通過(guò)（審批號(hào)：FJTCM IACUC 2022171）。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 溴隱亭（規(guī)格：2.5 mg/片，瑞士諾華制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：T2B350A）。泰山磐石散組方：人參3 g，黃芪3 g，白術(shù)1.5 g，炙甘草1.5 g，當(dāng)歸3 g，川芎2 g，白芍藥2 g，熟地黃2 g，川續(xù)斷3 g，糯米3 g，黃芩3 g，砂仁1.5 g（后下）。中藥材由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院中藥房提供。

1.3試劑與儀器 GATA-3 抗體（批號(hào)：sc-268）、T-bet 抗體（批號(hào)：sc-21749）均購(gòu)自美國(guó)Sant Cruz公司；二抗（批號(hào)：SA00001-1）購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；Western 專(zhuān)用一抗二抗稀釋液（批號(hào)：AR1017）購(gòu)自中國(guó)武漢博士德生物工程有限公司；濃縮型SABCCY3（POD）（小鼠IgG）免疫組化試劑盒（批號(hào)：SA1041）購(gòu)自中國(guó)武漢博士德生物工程有限公司；電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；電泳槽（美國(guó)Bio-Rad 公司）；包埋機(jī)（德國(guó)MICROM 公司）；半自動(dòng)石蠟切片機(jī)（德國(guó)MICROM 公司）；倒置顯微鏡（日本Nikon 公司）。

2 方 法

2.1藥液制備 泰山磐石散中除砂仁外，先用1 000 mL 的蒸餾水提前浸泡30 min 后再用大火煮沸，再改用小火煮25 min，最后加入提前搗碎的砂仁煮5 min。所得藥液用干凈的雙層紗布過(guò)濾；再用500 mL 蒸餾水將未濾過(guò)的藥渣大火煮沸，改小火煮30 min 后經(jīng)紗布過(guò)濾；將2 次所得藥液水浴蒸發(fā)至28.5 mL，使得終濃度為1 g/mL。

2.2分組、造模及給藥 SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，提前將雌雄SD 大鼠按照1∶1 比例合籠，次日早上8 點(diǎn)觀察雌性大鼠有無(wú)脫落的陰栓。發(fā)現(xiàn)陰栓者則記錄為妊娠第1 天，同時(shí)記錄妊娠大鼠體質(zhì)量。將妊娠雌鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組和治療組。空白組于妊娠的第1～11 天灌服生理鹽水，第6～8 天皮下注射生理鹽水；模型組于妊娠的第1～11 天灌服生理鹽水，第6～8 天皮下注射0.4 mg/（kg·d）溴隱亭溶液建立SA 模型；治療組于妊娠的第1～11 天灌服10 g/（kg·d）泰山磐石散藥液，第6～8 天皮下注射0.4 mg/（kg·d）溴隱亭溶液。

2.3取材 于實(shí)驗(yàn)結(jié)束次日使用1 g/kg 烏拉坦腹腔麻醉，待大鼠完全麻醉后進(jìn)行解剖，觀察并記錄胚胎發(fā)育情況，快速分離孕鼠的子宮蛻膜組織，然后將其置于提前預(yù)冷的PBS 溶液中清洗，將用于后續(xù)石蠟包埋實(shí)驗(yàn)的子宮蛻膜組織放入4%多聚甲醛中固定24 h，后期用于HE 染色和免疫組化實(shí)驗(yàn)。

2.4觀察指標(biāo)

2.4.1妊娠大鼠生命狀態(tài)及體質(zhì)量增長(zhǎng)變化 觀察3 組妊娠大鼠運(yùn)動(dòng)狀態(tài)、毛發(fā)色澤及飲食等一般狀況。

體質(zhì)量增長(zhǎng)值（g）＝妊娠第11 天體質(zhì)量－妊娠第1 天體質(zhì)量

2.4.2妊娠大鼠胚胎發(fā)育及吸收情況 觀察妊娠大鼠胚胎大小、顏色等一般發(fā)育狀況。

胚胎吸收率/%＝（胚胎吸收數(shù)÷胚胎總數(shù)）×100%

2.4.3大鼠子宮蛻膜組織的病理變化 將蛻膜組織用4%多聚甲醛固定后切片（5 μM），進(jìn)行脫蠟水化后用蘇木素染色反藍(lán)，再用伊紅染色并脫水，封片后可在顯微鏡下固定同一視野觀察3 組大鼠子宮蛻膜組織中細(xì)胞分布排列、血管發(fā)育等形態(tài)學(xué)的改變情況。

2.4.4免疫組化法檢測(cè)大鼠子宮蛻膜組織中轉(zhuǎn)錄因子T-bet 和GATA-3 蛋白表達(dá)水平 嚴(yán)格按照購(gòu)買(mǎi)的試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。主要分為3 個(gè)模塊：第一是固定、脫水；第二進(jìn)行包埋、切片、制片；第三是染色。最后在顯微鏡下拍照。使用Image-Pro-Plus 6.0 分析圖像的平均光密度（IOD/Area）。

2.4.5Western blot 測(cè)定大鼠子宮蛻膜組織轉(zhuǎn)錄因子T-bet 和GATA-3 蛋白表達(dá)量 先提取并制備子宮蛻膜組織蛋白樣本；然后進(jìn)行電泳；最后轉(zhuǎn)膜與顯色。使用Image Lab 進(jìn)行灰度值分析。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.13 組大鼠一般狀態(tài)及體質(zhì)量增長(zhǎng)情況 空白組大鼠背毛干凈有光澤，活潑好動(dòng)，飲食正常；模型組大鼠運(yùn)動(dòng)少，背毛粗糙無(wú)光澤，攝入食物較少；治療組大鼠相對(duì)活躍，體毛順滑有光澤，飲食適量。3 組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)情況見(jiàn)表1。

表1 3 組大鼠妊娠第1～11 天體質(zhì)量增長(zhǎng)情況比較（±s）

表1 3 組大鼠妊娠第1～11 天體質(zhì)量增長(zhǎng)情況比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

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3.23 組胚胎吸收及發(fā)育情況 空白組大鼠胚胎發(fā)育良好大小均一、飽滿、顏色粉紅明亮，無(wú)胚胎吸收；模型組的胚胎呈深紫色嚴(yán)重淤血，且胚胎大小不等，長(zhǎng)勢(shì)不均，胚胎發(fā)育異常；治療組接近對(duì)照組胚胎發(fā)育情況。與空白組比較，模型組大鼠胚胎吸收率明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，治療組大鼠胚胎吸收率明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖1和表2。

圖1 3 組胚胎發(fā)育情況

表2 3 組胚胎吸收情況比較

3.33 組子宮蛻膜組織的病理變化 空白組大鼠子宮蛻膜組織中細(xì)胞分布均勻，排列整齊，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色的圓形或橢圓形，血管豐富；模型組的子宮蛻膜組織中細(xì)胞排列紊亂、分布不均，血管擴(kuò)張嚴(yán)重；治療組子宮蛻膜組織形態(tài)接近對(duì)照組。見(jiàn)圖2。

圖2 3 組蛻膜組織病理情況（HE 染色，×200）

3.43 組子宮蛻膜組織T-bet 和GATA-3 蛋白表達(dá)水平 見(jiàn)圖3 和表3。

圖3 3 組子宮蛻膜組織T-bet 和GATA-3 蛋白表達(dá)情況（免疫組化，×400）

表3 3 組蛻膜組織中T-bet 和GATA-3蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表3 3 組蛻膜組織中T-bet 和GATA-3蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

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3.53 組子宮蛻膜組織中T-bet 和GATA-3 蛋白表達(dá)量 見(jiàn)圖4、表4。

圖4 3 組蛻膜組織蛋白條帶圖

表4 3 組蛻膜組織T-bet 和GATA-3蛋白表達(dá)量比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

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4 討 論

自然流產(chǎn)是一種常見(jiàn)的妊娠并發(fā)癥［3］。越來(lái)越多的研究表明，免疫因素的調(diào)控作用在自然流產(chǎn)中發(fā)揮著重要的作用，其參與了胚胎著床、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)等多個(gè)方面的生物學(xué)過(guò)程，因此免疫平衡在維持胎兒生存和發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用［8］。研究表明在自然流產(chǎn)的發(fā)生和發(fā)展中，Th1/Th2 免疫失衡可能是導(dǎo)致胚胎死亡和流產(chǎn)的重要因素之一。因此，Th1/Th2 免疫平衡可能是預(yù)防和治療流產(chǎn)的新靶點(diǎn)［9］。

研究表明，通過(guò)糾正Th1/Th2 免疫因子失衡，自然流產(chǎn)患者的妊娠結(jié)局能得到明顯改善［10］。Tbet 作為T(mén)h1 型免疫細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，不僅能夠促進(jìn)Th1 型細(xì)胞分化；還能誘導(dǎo)Th1 型經(jīng)典細(xì)胞因子IFN-γ 的分泌［11］。Th2 型免疫細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-3，促進(jìn)Th2 型免疫細(xì)胞發(fā)育的同時(shí)，還可以誘導(dǎo)Th2 型經(jīng)典細(xì)胞因子IL-4 的分泌，同時(shí)還能一定程度地抑制Th1 型細(xì)胞的免疫反應(yīng)［5］。

泰山磐石散是一種具有調(diào)節(jié)免疫功能的中藥復(fù)方，已被證明具有調(diào)節(jié)免疫功能的作用［12-13］。本研究結(jié)果顯示，泰山磐石散可下調(diào)自然流產(chǎn)模型大鼠蛻膜組織中T-bet 的蛋白表達(dá)水平，同時(shí)上調(diào)GATA-3 蛋白表達(dá)水平。而且經(jīng)泰山磐石散治療后大鼠蛻膜組織的免疫病理?yè)p傷明顯改善。這可能因?yàn)門(mén)h2 型免疫應(yīng)答占優(yōu)勢(shì)，而Th1 型免疫應(yīng)答減弱。前期研究發(fā)現(xiàn)，泰山磐石散可下調(diào)自然流產(chǎn)模型大鼠血清中IFN-γ 的表達(dá)水平，而血清中IL-4的表達(dá)水平則明顯上升［6］。綜上，泰山磐石散可能是通過(guò)影響T-bet/GATA-3 信號(hào)通路，下調(diào)妊娠大鼠子宮蛻膜組織中T-bet 的蛋白表達(dá)水平，同時(shí)上調(diào)GATA-3 蛋白表達(dá)水平，從而抑制Th1 型免疫反應(yīng)促進(jìn)Th2 型免疫反應(yīng)，從而調(diào)控Th1/Th2 免疫平衡以改善大鼠妊娠結(jié)局。