黃連解毒湯調(diào)控lncRNA MALAT1減輕小鼠膿腫創(chuàng)面炎性焦亡的實(shí)驗(yàn)研究

林尊友，翁美容，辛廷振，2

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬福州中醫(yī)院，福建 福州 350001；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122）

創(chuàng)面愈合是影響肛周膿腫疾病轉(zhuǎn)歸的一個(gè)亟需解決的重要問題。鑒于臨床肛周膿腫術(shù)后，其創(chuàng)面常暴露于開放環(huán)境，且易受排泄物污染，故而常引起術(shù)后創(chuàng)面延遲愈合。創(chuàng)面愈合緩慢或不愈合不僅進(jìn)一步加劇患者感染風(fēng)險(xiǎn)，而且導(dǎo)致患者持續(xù)疼痛不適，嚴(yán)重影響其日常生活［1-2］。研究表明，在內(nèi)毒素（lipopolysaccharides，LPS）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）等炎癥因子影響下，尤其在炎癥風(fēng)暴持續(xù)作用下可引起細(xì)胞發(fā)生炎性焦亡，進(jìn)而導(dǎo)致創(chuàng)口延遲愈合或不愈合發(fā)生［3-5］。因此，改善膿腫創(chuàng)面炎性焦亡狀態(tài)是促進(jìn)肛周膿腫創(chuàng)面愈合的重要途徑［6］。

肛周膿腫所致創(chuàng)面愈合緩慢歸屬中醫(yī)學(xué)“肛癰”范疇，其核心病機(jī)多為機(jī)體濕熱蘊(yùn)結(jié)、氣血凝滯堵塞肛門所致，故對(duì)其治則宜行清熱利濕、解毒養(yǎng)陰之法［7］。黃連解毒湯具有清熱利濕、解毒養(yǎng)陰之效，該方治療肛周膿腫及促進(jìn)術(shù)后創(chuàng)面愈合具有良效［8］。lncRNA 肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本（MALAT1）在創(chuàng)面愈合中發(fā)揮了關(guān)鍵調(diào)控作用［9］。研究證實(shí)，MALAT1可通過調(diào)節(jié)miR-378a/FGF2軸促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合［10］。另有研究表明，lncRNA MALAT1 與炎性焦亡存在密切聯(lián)系［11-12］。但黃連解毒湯是否通過調(diào)控lncRNA MALAT1，改善小鼠膿腫創(chuàng)面炎性焦亡的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

1 材 料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與藥物 48 只C57BL/6 雄性小鼠（SPF 級(jí)），由斯萊克（上海）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005］；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常規(guī)飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［使用許可證號(hào)：SYXK（閩）2019-0007］，提供實(shí)驗(yàn)過程及方法均符合福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)要求（審批號(hào)：FJTCM IACUC 202305T）；雷夫諾爾（廣東恒健制藥有限公司，批號(hào)：221205）；黃連解毒湯購于福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬福州中醫(yī)院中藥房，方中黃連、黃芩、黃柏、梔子參照2020 版《中華人民共和國藥典》藥物配比（9∶6∶6∶9）制成水煎液，濃縮至質(zhì)量濃度為1 g/mL，低溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 NLRP3（武漢Proteintech 公司，貨號(hào)：00090163）、Caspase-1（武漢Proteintech 公司，貨號(hào)：00092065）、IL-1β（武漢Proteintech 公司，貨號(hào)：00121535）、IL-18（武漢Proteintech 公司，貨號(hào)：00086146）、GAPDH（武漢Proteintech 公司，貨號(hào)：10029187）；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，貨號(hào)：71642J2）；lncRNA MALAT1（5'：GGCACTGAAGGCT TAATGTAGG，3'：AAGGTGTTACGGTAGGGTAGTC）、GAPDH（5'：ACGGCAAGTTCAACGGCACAG，3'：GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC）（福州尚亞生物技術(shù)有限公司）。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 電泳儀（美國Bio-RAD 公司）；凝膠成像系統(tǒng)（GELDOC 2000 型，美國Bio-RAD 公司）；DNA 擴(kuò)增儀（9600 型，美國PE 公司）；低溫高速離心機(jī)（64R型，美國Beckman公司）等。

2 方 法

2.1動(dòng)物分組、造模及干預(yù) 將48 只C57BL/6 雄性小鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組12 只、造模小鼠36 只。造模小鼠予以皮膚開窗＋污染物覆蓋的改良小鼠膿腫創(chuàng)面模型法制備模型［13］，造模成功后再采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、中藥組和對(duì)照組各12 只。空白組小鼠進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)，模型組小鼠給予等體積生理鹽水灌胃，中藥組先采用0.1%雷夫諾爾沖洗創(chuàng)面，1 次/d換藥，再給予5 g/kg黃連解毒湯水煎液灌胃給藥［14］；對(duì)照組小鼠采用0.1%雷夫諾爾沖洗創(chuàng)面，1 次/d 換藥，再給予等體積生理鹽水灌胃；灌胃劑量依據(jù)小鼠體質(zhì)量調(diào)整，干預(yù)共2 周。干預(yù)結(jié)束后，經(jīng)5%異氟醚吸入麻醉下處死各組小鼠，分離與收集小鼠膿腫創(chuàng)面皮膚組織。

2.2組織取材 末次灌胃后，各組小鼠經(jīng)5 %異氟醚麻醉處死。分離與收集其小鼠膿腫創(chuàng)面組織，置于超低溫環(huán)境下凍存。

2.3觀察指標(biāo)

2.3.1HE 染色觀察膿腫創(chuàng)面組織形態(tài)變化 取C57BL/6小鼠膿腫創(chuàng)面組織，置卡諾液中固定45 min，石蠟包埋、切片，行常規(guī)HE 染色，觀察各組膿腫創(chuàng)面組織形態(tài)變化。

2.3.2小鼠膿腫創(chuàng)面組織中l(wèi)ncRNA MALAT1 水平情況 采用TriZol 法提取各組小鼠皮膚創(chuàng)面組織中總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及PCR，待反應(yīng)完畢，確認(rèn)Realtime PCR 擴(kuò)增曲線和溶解曲線，分析結(jié)果。觀察黃連解毒湯對(duì)小鼠膿腫創(chuàng)面組織中l(wèi)ncRNA MALAT1水平影響。

2.3.3小鼠皮膚創(chuàng)面組織中與炎性焦亡相關(guān)蛋白含量表達(dá)情況 提取小鼠膿腫創(chuàng)面組織總蛋白，采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量，制膠（12%分離膠與5%濃縮膠）后，進(jìn)行上樣、電泳，依次進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，封閉，置于NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 一抗中充分反應(yīng)，孵育二抗后進(jìn)行顯影成像，分析結(jié)果。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料若符合正態(tài)分布采用（±s）表示，采用方差分析進(jìn)行組間比較，如果方差齊，兩兩比較選用LSD-t法；如果方差不齊，兩兩比較則選用Games-Howell法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物情況 本次實(shí)驗(yàn)過程各組小鼠均未出現(xiàn)意外死亡。

3.2HE 染色結(jié)果 與空白組比較，模型組肉芽組織新生毛細(xì)血管減少，周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤；與模型組比較，中藥組、對(duì)照組新生毛細(xì)血管增多；與對(duì)照組比較，中藥組炎性細(xì)胞浸潤程度減輕，成纖維細(xì)胞數(shù)量增多。見圖1。

圖1 HE 染色結(jié)果（×200）

3.34 組皮膚創(chuàng)面組織中l(wèi)ncRNA MALAT1 水平情況結(jié)果 qPCR 結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組lncRNA MALAT1 水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組和對(duì)照組lncRNA MALAT1 水平顯著增高（P＜0.05）；與對(duì)照組比較，中藥組lncRNA MALAT1水平顯著增高（P＜0.05）。見表1。

表1 4組膿腫創(chuàng)面組織中l(wèi)ncRNA MALAT1水平比較（±s）

表1 4組膿腫創(chuàng)面組織中l(wèi)ncRNA MALAT1水平比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與對(duì)照組比較，3） P＜0.05。

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3.44 組膿腫創(chuàng)面組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 蛋白含量表達(dá)比較 與空白組比較，模型組NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 蛋白含量表達(dá)顯著增高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組和對(duì)照組的NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 的蛋白含量表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與對(duì)照組比較，中藥組NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白含量表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。見表2、圖2。

表2 4 組膿腫創(chuàng)面組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 蛋白含量表達(dá)比較（±s）

表2 4 組膿腫創(chuàng)面組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 蛋白含量表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與對(duì)照組比較，3） P＜0.05。

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圖2 4 組膿腫創(chuàng)面組織中相關(guān)蛋白條帶圖

4 討 論

一般而言，肛周膿腫創(chuàng)傷愈合需要經(jīng)歷凝血及炎癥、肉芽組織形成、再上皮化、創(chuàng)面收縮等過程［15］。創(chuàng)面組織、細(xì)胞的炎癥狀態(tài)與分化功能的強(qiáng)弱，對(duì)創(chuàng)面愈合具有重要影響［16-17］。焦亡作為一種炎性程序性細(xì)胞死亡方式，通常由炎性小體NLRP3 引發(fā)。細(xì)胞發(fā)生炎性焦亡的過程主要由Caspase-1 介導(dǎo)的傳統(tǒng)信號(hào)通路介導(dǎo)，焦亡發(fā)生后會(huì)促使IL-1β 和IL-18 的前體加工裂解，轉(zhuǎn)變成為成熟的活性形式，進(jìn)一步加劇創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致創(chuàng)面延遲愈合［18-19］。

lncRNA MALAT1在促進(jìn)傷口愈合過程中發(fā)揮了重要作用［20］。研究證實(shí)，敲低MALAT1 顯著抑制人成纖維細(xì)胞（HFF-1）的增殖、遷移和基質(zhì)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制傷口愈合［21］。過表達(dá)MALAT1 可提高DFU 成纖維細(xì)胞的活力，抑制其凋亡和焦亡［22］。本研究結(jié)果顯示，在小鼠膿腫創(chuàng)面組織中，MALAT1水平較空白組顯著降低，與相關(guān)研究報(bào)道一致［23］。

黃連解毒湯源自唐代《外臺(tái)秘要》，由黃芩、黃連、黃柏、梔子4 味中藥組方，方中黃連為君藥，發(fā)揮清瀉心和中焦火之效，黃芩性寒味苦，可清上焦之火為臣藥；佐以黃柏可瀉下焦之火；梔子為使藥，可通瀉三焦［24］。課題組前期臨床研究亦發(fā)現(xiàn)，黃連解毒湯可顯著降低肛周膿腫手術(shù)患者炎性因子水平，改善創(chuàng)口腫脹狀態(tài)，促進(jìn)創(chuàng)口愈合［25］。本實(shí)驗(yàn)形態(tài)學(xué)染色結(jié)果證實(shí)，經(jīng)黃連解毒湯干預(yù)后，膿腫創(chuàng)面組織處的新生毛細(xì)血管、成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯增多，炎性細(xì)胞浸潤程度顯著降低。此外，與模型組比較，中藥組和對(duì)照組的NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 的蛋白含量表達(dá)顯著降低，lncRNA MALAT1 水平顯著增高，而中藥組療效顯著優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.05）。進(jìn)一步驗(yàn)證了黃連解毒湯可通過抑制炎性焦亡，促進(jìn)膿腫創(chuàng)面愈合的作用。

綜上表明，黃連解毒湯可有效減輕膿腫創(chuàng)面組織處的炎性焦亡，其作用機(jī)制與調(diào)控lncRNA MALAT1 與NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 的表達(dá)密切相關(guān)。同時(shí)，本研究仍具有一定的局限性，如黃連解毒湯是否調(diào)控lncRNA MALAT1 與關(guān)聯(lián)miRNA構(gòu)建的ceRNA 發(fā)揮作用的確切機(jī)制仍需深入研究。