電針腎俞、足三里調(diào)控脊髓背角Nrf2、miR-144-3p表達(dá)治療糖尿病周圍神經(jīng)痛

蘭艷艷，楊 婷，黃秋玲，龐莉娜，陳小梅，王志福，俞向梅

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，福建 福州 350003；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122；3.重慶市中醫(yī)院，重慶 400021；4.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122）

糖尿病周圍神經(jīng)病變是糖尿病常見的嚴(yán)重微血管并發(fā)癥，總體患病率約為26%，其中近1/3 患者出現(xiàn)糖尿病周圍神經(jīng)痛（diabetic neuropathic pain，DNP），臨床主要表現(xiàn)為肢體遠(yuǎn)端感覺功能障礙，包括麻木、灼燒或刺痛，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量［1-3］。2018 年糖尿病周圍神經(jīng)病理性疼痛診療專家共識及2019年《Nature Reviews Disease Primers》報(bào)道明確指出，DNP 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激發(fā)生是驅(qū)動脊髓背角痛覺敏化的關(guān)鍵機(jī)制［4-5］。

核因子E2 相關(guān)因子2（NF-E2 related factor 2，Nrf2）作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控多種抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄過程［6］。在慢性疼痛過程中，胞質(zhì)Nrf2 從Keap1 釋放進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而促進(jìn)抗氧化應(yīng)激基因（如HO-1、NQO1、SOD 和GCL 等）的轉(zhuǎn)錄［7-8］。研究表明，在DNP 發(fā)生時(shí)，脊髓背角Nrf2 表達(dá)顯著降低，而通過應(yīng)用白藜蘆醇、筋骨草素二萜-1（ajugarin-1）等干預(yù)可顯著提高DNP 脊髓背角Nrf2 表達(dá)，減輕氧化應(yīng)激。綜上所述，Nrf2的鎮(zhèn)痛作用可通過減少脊髓背角氧化應(yīng)激而發(fā)揮作用［9-10］。DNP 屬中醫(yī)學(xué)“消渴”“痹證”范疇。臨床研究顯示，電針足三里、腎俞等可顯著降低糖尿病周圍神經(jīng)痛［11-14］。本項(xiàng)目組前期研究證實(shí)，電針能夠顯著抑制DNP脊髓背角氧化應(yīng)激［15］，但是否與調(diào)控Nrf2 及相關(guān)基因表達(dá)，目前暫不清楚。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動物 SPF 級SD 雄性大鼠共28 只，體質(zhì)量（220±30）g，均由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心［許可證號：SYXK（閩）2019-0007］購入，并飼養(yǎng)于SPF 級動物實(shí)驗(yàn)室，予以自由飲水和進(jìn)食，保持適宜的溫度、適度，并提供光照明暗交替以形成正常的晝夜節(jié)律。本研究通過福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)倫理委員會審批（審批號：FJTCM2019-006），動物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循我國相關(guān)實(shí)驗(yàn)動物規(guī)定及本校實(shí)驗(yàn)動物中心的管理制度。

1.2主要試劑與耗材 鏈脲佐菌素（STZ，批號：S8050）、pH 4.5 0.1 mol/L檸檬酸緩沖液（批號：C1013）均購于北京索萊寶科技有限公司；Neun 抗體（批號：66836-1-Ig）購買于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；RNAs 提取試劑盒（批號：R223-01）購買于南京諾唯贊生物科技股份有限公司。PL-200 熱刺痛儀購買于成都泰盟軟件有限公司。0.25 mm×13 mm一次性無菌毫針、電子針療儀（型號：SDZ-Ⅱ）均購買于蘇州醫(yī)療用品有限公司。

2 方 法

2.1實(shí)驗(yàn)分組 28 只SPF 級SD 雄性大鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分別為對照組、模型組、電針組、Nrf2 干擾組，每組7 只。

2.2動物造模 參考文獻(xiàn)［16］的模型復(fù)制方法，具體操作如下：造模前1 d，大鼠禁食8 h。腹腔注射STZ（溶解于pH 4.5 的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液），劑量為60 mg/kg。注射后第1 周、第2 周，通過葡萄糖試紙測量大鼠尾靜脈的空腹血糖水平，僅當(dāng)大鼠連續(xù)2 次測量的空腹血糖值均＞16.7 mmol/L 時(shí)，認(rèn)定糖尿病模型復(fù)制成功。結(jié)合前期研究，糖尿病大鼠的熱痛潛伏期顯著低于對照組的1/2，則將其納入糖尿病周圍神經(jīng)痛模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)［15］。

2.3脊髓鞘內(nèi)注射 Nrf2 干擾組于造模前2 周鞘內(nèi)注射Nrf2 病毒干擾劑［rAAV-U6-shRNA（rNfe22）-C），購買于購于布林凱斯（深圳）生物技術(shù)有限公司］。鞘內(nèi)注射方法參考團(tuán)隊(duì)前期研究［17］，具體步驟如下：異氟烷快速麻醉，并使大鼠俯臥于操作臺上，充分暴露L4～L5椎間隙腰椎。確定注射位置并消毒后，使用27G 微量注射器垂直脊柱，緩慢傾斜45°并滑入關(guān)節(jié)間隙。感知落空感后固定針柄，以2 μL/min 速度緩慢注射，總注入20 μL/只，緩慢拔出注射器。

2.4干預(yù)方法 電針組、Nrf2 干擾組在造模2 周后開始進(jìn)行干預(yù)，隔日電針1次，每周3次，共電針4周。具體操作如下：將大鼠固定在專用固定架上，參照《實(shí)用腕踝針療法》［18］選取大鼠雙側(cè)“足三里”與“腎俞”穴，0.25 mm×13 mm一次性無菌毫針以5 mm的深度刺入，電針參數(shù)為10 Hz 頻率、0.5 mA 電流，連續(xù)波，每次30 min［19-20］。對照組和模型組進(jìn)行相同的固定操作，但不進(jìn)行電針干預(yù)。干預(yù)結(jié)束后，將所有大鼠放回各自的籠內(nèi)飼養(yǎng)。

2.5標(biāo)本取材及制備 樣本分為新鮮蛋白組織和多聚甲醛固定病理切片2 類。末次熱痛潛伏期測量后，各組隨機(jī)抽取4 只大鼠，斷頭處死大鼠，低溫快速取出大鼠脊髓背角新鮮組織，液氮速凍后及時(shí)存放于-80 ℃冰箱中；各組取3 只大鼠經(jīng)心灌注固定，選取大鼠脊髓進(jìn)行多聚甲醛固定制作冰凍切片。

2.6觀察指標(biāo)及檢測方法

2.6.1足底熱痛潛伏期 采用PL-200 熱刺痛儀測量，操作參考文獻(xiàn)［21］具體如下：將大鼠放入15 cm×15 cm×15 cm 的有機(jī)玻璃箱中適應(yīng)15 min。然后，將儀器的光源對準(zhǔn)大鼠足掌，光源強(qiáng)度設(shè)定為30%。設(shè)定自動切斷時(shí)間為30 s，按下開關(guān)后，記錄大鼠抬足或舔足的時(shí)間。每只大鼠分別在造模前、造模后2 周、造模后6 周進(jìn)行測量，每次間隔至少5 min。為避免足底受傷，保持檢測時(shí)間段一致，減少晝夜節(jié)律對疼痛閾值的影響。

2.6.2免疫熒光法檢測4 組大鼠脊髓背角Nrf2 與Neun 共定位情況 4 組大鼠脊髓背角冰凍切片，通過蛋白酶K 消化后添加Nrf2 原位雜交探針進(jìn)行過夜雜交，利用SSC 溶液洗滌去除非特異性結(jié)合，接著進(jìn)行免疫熒光，先后孵育一抗和二抗以標(biāo)記Neun，使用DAPI 進(jìn)行核染色，最后在熒光顯微鏡下觀察。

2.6.3qPCR 檢測4 組大鼠Nrf2 及其相關(guān)基因mRNA 和調(diào)控基因miRNA 的相對表達(dá)水平 取出4 組脊髓背角新鮮組織勻漿離心，每管加入1 mL RNA Isolator，提取RNA 樣本根據(jù)試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)mRNA、miRNA 序列，按照相應(yīng)的種屬選取GAPDH、U6 作為內(nèi)參基因；采用qPCR 技術(shù)以及2-ΔΔCT法計(jì)算上述基因相對表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布采用（±s）表示，組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t法，重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量方差分析。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.14 組大鼠足底熱痛潛伏期比較 見表2。

表2 4 組大鼠足底熱痛潛伏期比較（±s）s

表2 4 組大鼠足底熱痛潛伏期比較（±s）s

注：與對照組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與電針組比較，3） P＜0.05。

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3.24 組大鼠脊髓背角Nrf2 與神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN共定位比較 對照組大鼠脊髓背角Nrf2 與神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN 存在大量共表達(dá)，提示Nrf2 大量表達(dá)在脊髓背角神經(jīng)元上；模型組大鼠脊髓背角提示神經(jīng)元上Nrf2 顯著降低；電針組大鼠經(jīng)腎俞、足三里電針干預(yù)后神經(jīng)元上Nrf2 表達(dá)顯著升高；Nrf2 干擾組大鼠經(jīng)電針后，Nrf2仍處于低水平表達(dá)。見圖1。

圖1 4 組脊髓背角Nrf2 在神經(jīng)元上的表達(dá)情況

3.34 組大鼠脊髓背角Nrf2、Keap1、NQO1、HO-1、Catalase mRNA 相對表達(dá)水平比較 見表3。

表3 4 組脊髓背角Nrf2、Keap1、NQO1、HO-1、Catalase mRNA 相對表達(dá)水平比較（±s）

表3 4 組脊髓背角Nrf2、Keap1、NQO1、HO-1、Catalase mRNA 相對表達(dá)水平比較（±s）

注：與對照組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與電針組比較，3） P＜0.05。

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3.44 組大鼠脊髓背角miRNA 相對表達(dá)水平比較 見表4。

表4 4 組小鼠脊髓背角miR-144-3p、miR-155-5p、miR-17-5p、miR-497-5P 相對表達(dá)水平比較（±s）

表4 4 組小鼠脊髓背角miR-144-3p、miR-155-5p、miR-17-5p、miR-497-5P 相對表達(dá)水平比較（±s）

注：與對照組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與電針組比較，3） P＜0.05。

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4 討 論

糖尿病周圍神經(jīng)痛（DNP）是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，臨床表現(xiàn)為肢體刺痛，屬中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇。根據(jù)痹癥所在部位，取相應(yīng)臟腑的腧穴或合穴治療作為針灸治療痹證的康復(fù)原則，取穴主要有腎俞、足三里等。足三里為足陽明經(jīng)之要穴，具有活血通絡(luò)、除痹止痛的功效，可有效改善DNP癥候。晉代·皇甫謐《針灸甲乙經(jīng)》載：“消渴身熱……陰氣不足，熱中消谷善饑……足三里主之?！薄鹅`樞》載：“著痹不去，久寒不已，卒取其三里骨為干”，可治下肢痿痹不遂［22］。腎俞穴為腎中經(jīng)氣輸注的部位，具有滋補(bǔ)腎陰作用，可有效控制血糖水平，調(diào)節(jié)血脂，并調(diào)整微血管病變［23］?！肚Ы鸱健费裕骸跋市”銛?shù)……又灸背上脾俞下四十、腎俞兩處?！毖芯孔C實(shí)，電針足三里、腎俞等穴可明顯改善DPN痛覺過敏，如減輕脊髓背角氧化應(yīng)激，改善周圍神經(jīng)感覺和運(yùn)動傳導(dǎo)速度（SNCV、MNCV）［24-26］。

DNP 中樞敏化與脊髓背角氧化應(yīng)激密切相關(guān)，Nrf2 作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控多種抗氧化基因轉(zhuǎn)錄過程。研究證實(shí)，在DNP 發(fā)生時(shí)，脊髓背角Nrf2 表達(dá)顯著降低，應(yīng)用中藥及有效成分可顯著提高DNP 脊髓背角Nrf2 表達(dá)，調(diào)控氧化應(yīng)激基因轉(zhuǎn)錄，降低痛敏反應(yīng)［9-10］。本實(shí)驗(yàn)研究表明，電針治療可顯著提高脊髓背角Nrf2 表達(dá)，降低Keap1 釋放，提高如NQO1、HO-1、Catalase mRNA 相對表達(dá)水平，提示電針可能通過解除Nrf2 與Keap1 結(jié)合，促進(jìn)Nrf2 核內(nèi)轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)抗氧化應(yīng)激相關(guān)因子如NQO1、HO-1、Catalase 的表達(dá)，減輕疼痛反應(yīng)。通過鞘內(nèi)注射Nrf2 表達(dá)干擾病毒，可逆轉(zhuǎn)電針的鎮(zhèn)痛效果，進(jìn)一步驗(yàn)證電針可能通過脊髓背角Nrf2/Keap1 抗氧化應(yīng)激途徑，減輕DNP 熱痛覺過敏反應(yīng)，深層的機(jī)制有待今后進(jìn)一步研究。

miRNA 是一類非編碼RNA，參與轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控，研究其功能及表達(dá)有助于更好地了解疾病發(fā)生與干預(yù)的分子作用機(jī)制。研究表明，miRNA 在糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥中扮演著關(guān)鍵角色。miR-497 通過抑制USP15，參與調(diào)控糖尿病神經(jīng)性疼痛的進(jìn)程，顯示出潛在的治療作用［27］。同時(shí)，環(huán)境內(nèi)分泌干擾物DEHP 誘導(dǎo)的胰島素抵抗中，miR-17 和miR-200a 通過影響胰島素信號傳遞的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，展現(xiàn)了調(diào)控胰島素抵抗的復(fù)雜機(jī)制［28］。此外，鋅暴露與2 型糖尿?。═2DM）的發(fā)展密切相關(guān)，其中miR-144-3p 通過影響Nrf2 和抗氧化酶表達(dá)，參與鋅誘導(dǎo)的胰島素抵抗，進(jìn)一步揭示了miRNA 在糖尿病發(fā)展中的多重作用機(jī)制［29］。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DPN 發(fā)生時(shí)脊髓背角miR-144-3p 顯著上調(diào)，電針可顯著逆轉(zhuǎn)miR-144-3p 過表達(dá)，而鞘內(nèi)注射Nrf2 受體病毒干擾降低電針效應(yīng)。但miR-155-5p、miR-17-5p 和miR-497-5P 在電針干預(yù)DPN 模型中沒有顯示出顯著差異。

綜上所述，電針足三里、腎俞可能通過調(diào)節(jié)脊髓背角Nrf2/Keap1 氧化應(yīng)激重要通路，提高Nrf2 表達(dá)，降低Keap1 含量，升高NQO1、HO-1、Catalase 基因相對表達(dá)水平，并減少Nrf2 密切相關(guān)基因miR-144-3p 表達(dá)，從而提高糖尿病神經(jīng)痛大鼠熱痛潛伏期，減輕痛敏反應(yīng)。