乙氧基血根堿改善血管緊張素Ⅱ誘導的小鼠心肌纖維化的實驗研究

魏麗慧，程 瑛，謝 意，彭 軍，沈阿靈，3*

（1.福建中醫(yī)藥大學科技創(chuàng)新與轉(zhuǎn)化中心，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，福建 福州 350122；3.福建省中西醫(yī)結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122）

高血壓是心血管疾病的主要危險因素。我國有超過3.3 億人患有高血壓，已成為日益嚴重的公共衛(wèi)生問題［1-2］。高血壓患者因長期壓力過載可導致左室肥厚、心肌纖維化等改變，心臟進行性重構，最終出現(xiàn)心力衰竭，嚴重危害居民身心健康［3］。因此，進一步探究更為有效的高血壓防治途徑，減緩心臟的損害尤為關鍵。

乙氧基血根堿（Ethoxysanguinarine，ETH）是血根堿氨化乙醇提取過程的結晶產(chǎn)物。2021 年課題組首次發(fā)現(xiàn)乙氧基血根堿具有降低血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導的高血壓小鼠血壓及改善心臟功能的作用［4］，但其改善心臟功能的具體作用機制有待深入研究。心肌纖維化是高血壓患者心臟損傷的主要病理改變［5］，預防心肌纖維化在高血壓性心臟病的治療中至關重要。因此，本研究從心肌纖維化角度探討了乙氧基血根堿改善AngⅡ誘導的高血壓心臟功能障礙的作用及其可能機制。

1 實驗材料

1.1實驗動物 36只雄性，SPF級，8周齡，C57BL/6小鼠，體質(zhì)量（28±2） g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，動物使用許可證號：SYXK（閩）2019-0007。飼養(yǎng)在SPF 級環(huán)境中（溫度：22～26 ℃，黑暗/光明各12 h）。本研究方案經(jīng)福建中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準（審批號：FJTCM IACUC 2022051）。

1.2實驗試劑 Masson 染色試劑（貨號：G1340）購自北京索萊寶科技有限公司；天狼星紅染色試劑（貨號：PH1099）購自福州飛凈生物科技有限公司；增殖細胞核抗原（PCNA）（貨號：ab29）購自英國Abcam 公司；TGF-β1（貨號：ABP52598）、GAPDH（貨號：ABL1021）購自中國Abbkine Scientific 公司；Ⅰ型膠原（貨號：14695-1-AP）、Ⅲ型膠原（貨號：22734-1-AP）、纖維連接蛋白（FN）（貨號：15613-1-AP）購自美國Proteintech 公司；α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）（貨號：40482）、p-smad2（貨號：913429）、p-smad3（貨號：12838）、smad2（貨號：41442）、smad3（貨號：41445）購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.3實驗儀器 電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、化學成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad 公司；普通顯微鏡、偏光顯微鏡購自德國Leica 公司；低溫高速離心機購自美國Thermo公司。

2 實驗方法

2.1分組、造模及給藥 雄性C57BL/6 小鼠36 只，適應性喂養(yǎng)1 周后，根據(jù)小鼠的基線血壓隨機分為空白組，模型組，低、中、高劑量組和陽性藥組。滲透泵置于生理鹽水中，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育過夜激活，采用1.5%～2%異氟烷吸入麻醉小鼠，消毒后皮下植入滲透微泵。除空白組外的其余各組小鼠皮下以500 ng/（kg·min）的速率釋放AngⅡ，空白組在泵內(nèi)注入等量生理鹽水，持續(xù)28 d；低、中、高劑量組從術后第1 天起分別給予0.1、1、10 mg/（kg·d）乙氧基血根堿灌胃，空白組和模型組給予等體積生理鹽水，陽性藥組給予10 mg/（kg·d）纈沙坦，連續(xù)灌胃給藥28 d。

2.2觀察指標

2.2.1小鼠心臟纖維化 采用Masson 染色評估各組小鼠心臟纖維化的陽性染色情況。28 d 后麻醉處死小鼠。取出心臟，用4%多聚甲醛固定48 h，制作石蠟切片；切片進行脫蠟至蒸餾水中，Weigert 鐵蘇木素液染5～10 min，沖洗液沖洗30 s；1%鹽酸酒精分化8 min，流水沖洗，麗春紅酸性復染液染色5 min，流水沖洗，1%磷鉬酸水溶液染5～10 min，1%的冰醋酸水溶液處理2 min；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡觀察小鼠心臟纖維化情況。每張切片隨機選取高倍鏡下的6 個視野，評估纖維化的陽性染色。

2.2.2小鼠心臟膠原沉積情況 采用天狼星紅染色評估各組小鼠心臟膠原沉積情況。心臟組織4 μm切片，常規(guī)脫蠟，然后用天狼星紅染色1 h，自來水沖洗，蘇木精染色8 min，自來水沖洗10 min。采用偏光顯微鏡400 倍鏡下觀察拍照。使用Image Pro-Plus 軟件，在6 個顯微鏡視野下評估膠原沉積的區(qū)域。

2.2.3Western blot檢測Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、PCNA、α-SMA、FN、TGF-β1、p-smad2/3 及smad2/3 蛋白表達量 取適量心臟組織樣本，裂解液裂解，4 ℃高速離心機（14 000 r/min）離心20 min。根據(jù)BCA 試劑盒說明書測定蛋白濃度。加入SDS 在100 ℃的金屬水浴鍋變性。利用SDS-PAGE 膠進行電泳，結束后，將其轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。用牛奶在室溫下封閉2 h，4 ℃孵育Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、PCNA、α-SMA、FN、TGF-β1、p-smad2/3 及smad2/3 一抗過夜。用含0.2% Tween 的TBST 洗滌3 次，每次洗滌10 min，然后加入相應的二抗在室溫繼續(xù)孵育2 h，用TBST洗滌3 次，最后加入ECL 顯影劑（A 液∶B 液＝1∶1），置于凝膠成像系統(tǒng)中進行成像、掃描。

2.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0 軟件分析數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 5 軟件進行數(shù)據(jù)圖繪制。在3 組或更多組之間進行差異比較時，當計量資料服從正態(tài)分布時用（±s）表示，使用單因素方差分析進行比較，方差齊時使用LSD-t進行事后檢驗；當方差不齊時使用Games-Howell 進行事后檢驗；當計量資料不服從正態(tài)分布時用［M（P25，P75）］表示，采用非參數(shù)Kruskal-Wallis 檢驗用于比較數(shù)據(jù)的組間差異。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結 果

3.16組小鼠心臟組織心肌纖維化程度及膠原沉積情況比較 與空白組比較，模型組小鼠心肌間質(zhì)和血管周圍出現(xiàn)明顯纖維化及膠原沉積（P＜0.05）；與模型組比較，低、中、高劑量組及陽性藥組心肌間質(zhì)和血管周圍纖維化及膠原沉積程度顯著減少，且作用呈劑量依賴性（P＜0.05）。圖1、表1、圖2、表2。

表1 6 組小鼠心肌纖維化程度比較（±s）

表1 6 組小鼠心肌纖維化程度比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與低劑量組比較，3） P＜0.05；與中劑量組比較，4） P＜0.05。

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表2 6 組小鼠心肌膠原沉積程度比較（±s）

表2 6 組小鼠心肌膠原沉積程度比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與低劑量組比較，3） P＜0.05；與中劑量組比較，4） P＜0.05。

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圖1 6 組小鼠心肌間質(zhì)及血管周圍心肌纖維化情況（Masson 染色，×400）

圖2 6 組小鼠心肌間質(zhì)及血管周圍心肌膠原沉積情況（天狼星紅染色，×400）

3.26 組小鼠心臟組織中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達情況 與空白組比較，模型組小鼠心臟組織中Ⅰ型、Ⅲ型膠原的蛋白表達均顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，低中高劑量及陽性藥組心臟組織中Ⅰ型、Ⅲ型膠原的蛋白表達均顯著減少（P＜0.05）。見圖3、表3。

表3 6 組小鼠心臟組織中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達量比較（±s）

表3 6 組小鼠心臟組織中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達量比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與低劑量組比較，3） P＜0.05；與中劑量組比較，4） P＜0.05。

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圖3 6 組小鼠心臟組織中Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原蛋白條帶圖

3.3小鼠心臟組織中PCNA 蛋白表達情況 與空白組比較，模型組心臟組織中PCNA 的表達顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，低、中、高劑量及陽性藥組心臟組織中PCNA 的表達均明顯減弱（P＜0.05），表明乙氧基血根堿處理顯著抑制AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞的增加。見圖4、表4。

表4 6 組小鼠心臟組織PCNA 蛋白表達量比較（±s）

表4 6 組小鼠心臟組織PCNA 蛋白表達量比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

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圖4 6 組小鼠心臟組織PCNA 蛋白條帶圖

3.46 組小鼠心肌成纖維細胞α-SMA、FN 蛋白表達情況 與空白組比較，模型組心臟組織中α-SMA及FN 蛋白的表達增加（P＜0.05）；與模型組比較，低、中、高劑量組及陽性藥組心臟組織中α-SMA 及FN的蛋白表達均顯著減少（P＜0.05）。見圖5、表5。

表5 6 組小鼠心臟組織α-SMA 及FN 蛋白表達量比較（±s）

表5 6 組小鼠心臟組織α-SMA 及FN 蛋白表達量比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與低劑量組比較，3） P＜0.05；與中劑量組比較，4） P＜0.05。

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圖5 6 組小鼠心臟組織α-SMA、FN 蛋白條帶圖

3.56 組小鼠心臟組織TGF-β1、p-smad2/3 及smad2/3 蛋白表達情況 與空白組比較，模型組小鼠心臟組織中TGF-β1 的蛋白表達、p-smad2/smad2 比值及p-smad3/smad3 比值顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，低、中、高劑量組及陽性藥組心臟組織中TGF-β1 的表達、p-smad2/smad2 比值及p-smad3/smad3 比值均顯著下降（P＜0.05）。見圖6、表6。

表6 6 組小鼠心臟組織TGF-β1 蛋白表達量、p-smad2/smad2 比值和p-smad3/smad3 比值比較（±s）

表6 6 組小鼠心臟組織TGF-β1 蛋白表達量、p-smad2/smad2 比值和p-smad3/smad3 比值比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與低劑量組比較，3） P＜0.05；與中劑量組比較，4） P＜0.05。

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圖6 6 組小鼠心臟組織中TGF-β1、p-smad2/3 及smad2/3 蛋白條帶圖

4 討 論

高血壓性心臟病是高血壓最常見的并發(fā)癥之一，最終可引起心力衰竭導致患者死亡。本課題組在前期抗高血壓新藥及機制研究過程中發(fā)現(xiàn)，降壓新成分乙氧基血根堿具有顯著降低AngⅡ誘導的高血壓小鼠血壓及改善心臟功能的作用［4］。研究表明心肌纖維化是高血壓患者心臟損傷的主要病理改變［5］，表現(xiàn)為正常心臟組織中出現(xiàn)膠原的過度沉積、排列紊亂、比例失調(diào)，心臟纖維化不僅加重心肌缺血缺氧，而且心室順應性下降，經(jīng)過一系列的變化最終導致心室腔逐漸擴大，心室收縮和舒張功能均嚴重受損，進而出現(xiàn)心力衰竭［5-8］。故預防心肌纖維化在高血壓性心臟病的治療中至關重要。

RAAS 的激活是心肌纖維化的主要原因，AngⅡ在這一過程中起著重要的調(diào)控作用［9-10］。AngⅡ可通過激活血管緊張素Ⅰ型受體，刺激心肌成纖維細胞的增殖和細胞外基質(zhì)（ECM）蛋白的表達，引起心肌纖維化［10］。因此，它可加速高血壓心力衰竭［10-12］。為此，本研究觀察乙氧基血根堿對AngⅡ誘導的高血壓小鼠心肌纖維化的影響。首先觀察乙氧基血根堿對心肌纖維化及膠原沉積情況的影響，結果表明乙氧基血根堿治療可以顯著降低高血壓小鼠的心肌纖維化及膠原蛋白的堆積，并顯著下調(diào)心臟組織中Ⅰ型、Ⅲ膠原蛋白表達。

生理情況下，心臟受到外界損傷刺激時，心肌成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，肌成纖維細胞增殖并向損傷部位遷移，合成膠原，修復損傷的心肌組織。病理狀態(tài)下，如AngⅡ等細胞因子作用于心肌成纖維細胞，心肌成纖維細胞被過度激活，向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，并大量增殖分泌膠原蛋白，這些膠原蛋白在損傷部位累積，在初始階段時起到維持心臟結構和功能的作用，但隨著心臟纖維化程度的加重，最后出現(xiàn)心力衰竭。為此，本項目還觀察了心肌成纖維細胞增殖及心肌成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的標記物PCNA 及α-SMA 蛋白表達。結果顯示，AngⅡ誘導的高血壓小鼠心肌，PCNA 及α-SMA 蛋白表達顯著升高，經(jīng)乙氧基血根堿治療后PCNA 及α-SMA 蛋白表達顯著下調(diào)?？梢娨已趸鶋A可能是通過減輕心肌成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化增殖這一過程，發(fā)揮改善高血壓導致心臟損傷。

研究表明TGF-β1/smad2/3 通路在多種心肌纖維化模型中被激活［13-14］。TGF-β1 通過激活smad2和smad3 磷酸化，并將其信號傳遞至細胞核內(nèi)，影響多種促纖維化過程的關鍵介質(zhì)，促進組織纖維化。本研究發(fā)現(xiàn)在AngⅡ刺激后，心臟組織中TGFβ1 蛋白表達升高，p-smad2/smad2 比值及p-smad3/smad3 比值增加，乙氧基血根堿治療可降低AngⅡ誘導的心臟組織中TGF-β1 的蛋白表達及p-smad2/smad2 和p-smad3/smad3 的比值。

綜上，本研究證實乙氧基血根堿可顯著減輕AngⅡ誘導的高血壓心肌纖維化，可能是通過調(diào)控TGF-β1/smad2/3 通路抑制心肌成纖維細胞的分化。