核桃青皮提取物對(duì)梨黑斑病的防治研究

侯敬儀　趙丹　馬光　高小寬

摘 要：【目的】采用不同提取劑提取成熟期的核桃果實(shí)青皮，研究核桃青皮提取物對(duì)梨黑斑病病原菌的抑菌效果，為廢棄核桃青皮資源再利用的抑菌構(gòu)建提供理論支撐?！痉椒ā恳岳婧诎卟樵囼?yàn)材料，分別用不同濃度（25％、50％、75％、100％）的石油醚、乙酸乙酯、甲醇、乙醇為提取液提取成熟期的核桃果實(shí)青皮，獲得核桃青皮提取物，研究核桃青皮提取物對(duì)梨黑斑病菌菌絲生長(zhǎng)的影響?！窘Y(jié)果】甲醇對(duì)核桃青皮中對(duì)梨黑斑病的抑菌物質(zhì)的萃取效果最好；核桃青皮中對(duì)梨黑斑病的抑菌物質(zhì)既有水溶性的也有易于有機(jī)溶劑萃取的，且在水和有機(jī)溶劑量相等時(shí)萃取效果最好；1.0 mL的核桃青皮提取物比其他用量對(duì)梨黑斑病的抑菌效果更好；50%甲醇提取的成熟期核桃青皮提取物對(duì)梨黑斑病菌絲的抑制效果最好?！窘Y(jié)論】50%的甲醇提取的成熟期核桃青皮提取物對(duì)梨黑斑病菌落生長(zhǎng)抑菌效果最好，抑制率可達(dá)到38.73%，對(duì)病原菌的毒力最強(qiáng)，EC50為4.624 483 442 mL/100mL。

關(guān)鍵詞：梨黑斑??；核桃青皮提取物；抑菌

文章編號(hào)：2096-8108（2024）03-0056-04中圖分類(lèi)號(hào)：S664.1中圖分類(lèi)號(hào)文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文獻(xiàn)標(biāo)志碼

Study on the Prevention and Control of Walnut Green Husk Extract on Pear Black Spot

HOU? Jingyi，ZHAO? Dan，MA? Guang，GAO Xiaokuan*

（College of Life Sciences， Hengshui University， Hengshui Hebei 053000， China）

Abstract： 【Objective】Different extractants were used to extract the green peel of mature walnut fruit， and the antibacterial effect of walnut green peel extract on the pathogen of pear black spot was studied so as to provide theoretical support for the antibacterial construction of the reuse of waste walnut green peel resources.【Methods】With pear black spot as test material， walnut green husk extracts were obtained by using different concentrations （25%， 50%， 75%， 100%）of petroleum ether， ethyl acetate， methanol and ethanol as extracts to extract mature walnut green husk. The effects of walnut green husk extracts on mycelial growth of pear black spot were studied.【Results】Methanol had the best extraction effect on the antibacterial substances against pear black spot in walnut green husk. The antibacterial substances against pear black spot in walnut green husk are both water-soluble and easy to be extracted by organic solvent， and the extraction effect is the best when the amount of water and organic solvent is equal. The antibacterial effect of 1.0 mL walnut green husk extract on pear black spot was better than that of other doses. The mature walnut green husk extract extracted by 50% methanol had the best inhibitory effect on the mycelium of pear black spot.【Conclusion】50% methanol extract of mature walnut peel extract has the best bacteriostatic effect on the colony growth of pear black spot， and the inhibition rate can reach 38.73%. It has the strongest virulence to the pathogen， and the EC50 was 4.624 483 442 mL/100 mL.

Keywords：pear black spot; walnut green husk extract; antibacterial

核桃（Juglans regia L.）別名胡桃、羌桃等，是胡桃科核桃屬多年生落葉喬木。核桃青皮作為核桃生產(chǎn)中的副產(chǎn)物，一直被視為廢料而棄之，不僅造成了環(huán)境污染，同時(shí)也浪費(fèi)了自然資源。隨著核桃青皮的利用價(jià)值逐漸被發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了深入研究和探索，并取得了一定的成果。前人的研究中包含了核桃青皮中活性物質(zhì)的有效成分［1-3］、提取方法及其抑菌作用［4-6］等內(nèi)容，為核桃青皮的農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)利用提供一定的參考。梨黑斑病又名裂果病，是梨的三大病害之一，由鏈格孢屬真菌（Alternaria） alternate （Fr．）Keissl 侵染引起。梨黑斑病主要危害梨樹(shù)葉、果實(shí)和新梢，導(dǎo)致樹(shù)體衰弱，結(jié)果年限縮短，并引起貯藏期果實(shí)發(fā)病，造成重大經(jīng)濟(jì)損失［7］。鑒于此，本試驗(yàn)擬在核桃果實(shí)成熟期篩選青皮提取物對(duì)梨黑斑病病原菌的抑菌效果，構(gòu)建核桃青皮最佳抑菌效果期，通過(guò)抑菌活性測(cè)定，找到有效拮抗菌的生長(zhǎng)期果實(shí)的防效測(cè)定，為廢棄核桃青皮資源再利用的抑菌構(gòu)建提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料

供試植物病原菌為梨黑斑病儲(chǔ)藏期病，經(jīng)儲(chǔ)藏15 d后取病組織分離得到各植物病菌。

從河北昌黎選取10～20株野生核桃樹(shù)，2023年8月25日分別從每株樹(shù)上選取無(wú)病害的核桃果實(shí)10個(gè)。

1.2 核桃青皮提取物、病原菌和PDA培養(yǎng)基的制備

1.2.1 核桃青皮提取物的制備

將采的核桃果實(shí)剝下青皮烘干、粉粹、過(guò)100目篩，混勻后干燥保存。分別稱(chēng)取10g青皮粉末份，分別以乙酸乙酯、甲醇、乙醇、石油醚（25％、50％、75％、100％）為提取液，其中石油醚、乙酸乙酯、甲醇、乙醇與青皮料液比按照1∶10混勻，25 ℃搖床浸提8 h，四層紗布過(guò)濾，取上清液，濃縮至20 mL作為母液，3次重復(fù)；將各提取物4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌的分離、純化和鑒定

參照方中達(dá)方法［8］。用70%酒精擦拭病果表面，無(wú)菌水沖洗干凈后，切取一小塊染病組織，在超凈工作臺(tái)中移到PDA培養(yǎng)基上，于25 ℃保溫培養(yǎng)，待長(zhǎng)出分生孢子后進(jìn)行單孢分離，純化后在PDA培養(yǎng)基上保存待用。各菌株在PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)至菌落直徑接近2/3培養(yǎng)皿直徑時(shí)，用打孔器在菌落邊緣打取直徑 5 mm的菌餅。

1.2.3 PDA培養(yǎng)基制備

參照方中達(dá)方法進(jìn)行［8］。首先用天平稱(chēng)量去皮的馬鈴薯200 g，將其切成小方形塊，放入鍋中，加無(wú)菌水1 000 mL，煮沸30 min。用紗布濾去馬鈴薯殘?jiān)?，將馬鈴薯濾液放回鍋中，加入瓊脂15～20 g，加熱熔化加入葡萄糖20 g。待葡萄糖溶解后，加入適量的水以補(bǔ)充加熱過(guò)程中損失的水分，定容至1 000 mL。分裝后，在0.103 Mpa、121 ℃下，高壓蒸氣滅菌20 min。

1.2.4 對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制活性測(cè)定

在無(wú)菌條件下，從母液分別量取0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0ml核桃青皮提取物加入100 mL的PDA培養(yǎng)基中，搖勻后趁熱倒入直徑90 mm的培養(yǎng)皿內(nèi)。預(yù)先培養(yǎng)梨黑斑病病原菌，滅菌后用直徑為6 mm打孔器在菌落邊沿處鉆取適量菌齡相同的菌餅，接種于含有殺菌劑的PDA培養(yǎng)基的中央，菌絲面向下，每皿接種1個(gè)菌餅，同等濃度做3次重復(fù)試驗(yàn)。25 ℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 d，用十字交叉法測(cè)量供試真菌菌落生長(zhǎng)直徑。計(jì)算菌絲生長(zhǎng)的抑制率。

菌絲生長(zhǎng)抑制率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 11軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同條件下核桃皮提取物對(duì)梨黑斑病菌絲的抑菌率的三因素方差分析

采用SPSS對(duì)不同溶劑、提取液濃度、用量對(duì)抑菌率進(jìn)行三因素方差分析（見(jiàn)表1）。因變量為抑菌率，3個(gè)固定因子分別為溶劑、提取液濃度、用量。方差分析結(jié)果表明，溶劑、提取液濃度、用量3個(gè)主效應(yīng)的P值均為0.000，表明不同溶劑、提取液濃度、用量下的抑菌率差異極顯著。3個(gè)兩兩交互，溶劑×提取液濃度、溶劑×用量、提取液濃度×用量，以及三者間的交互溶劑× 提取液濃度× 用量的P值也均為0.000，表明以上交互也對(duì)抑菌率具有極顯著的影響。在選取最佳提取條件時(shí)，要考慮三者間的交互作用。

2.2 不同萃取劑提取的核桃青皮提取物對(duì)梨黑斑病菌絲的抑制作用

對(duì)用石油醚、乙酸乙酯、乙醇、甲醇4種不同溶劑處理核桃青皮，處理后的提取物對(duì)梨黑斑病抑菌率進(jìn)行Duncan法多重比較（α=0.05），結(jié)果見(jiàn)圖1。4種溶劑處理間抑菌率均差異顯著。其中甲醇提取的抑菌率最高達(dá)到44.30%；其次是乙醇為39.49%；再次為乙酸乙酯為33.80%，最差的則是石油醚抑菌率為9.07%。這表明，甲醇對(duì)核桃青皮中對(duì)梨黑斑病的抑菌物質(zhì)的萃取效果最好。

2.3 不同濃度提取劑提取的核桃青皮提取物對(duì)梨黑斑病菌絲的抑制作用

對(duì)以上4種有機(jī)溶劑的不同濃度，25%、50%、75%、100% 4種不同濃度處理核桃青皮，處理后的提取物對(duì)梨黑斑病抑菌率進(jìn)行Duncan法多重比較（α=0.05），結(jié)果見(jiàn)圖2。4種濃度間抑菌率均差異顯著。其中50%的抑菌率最高達(dá)到38.73%；其次是25%為32.95%；再次是100%為28.57%，最差的則是75%抑菌率為36.42%。這表明，核桃青皮中對(duì)梨黑斑病的抑菌物質(zhì)既有水溶性的也有易于有機(jī)溶劑萃取的，且在水和有機(jī)溶劑量相等時(shí)萃取效果最好。

2.4 不同用量核桃青皮提取物對(duì)梨黑斑病菌絲的抑制作用

采用5個(gè)不同量的萃取物（0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0 mL）進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，處理后對(duì)梨黑斑病抑菌率進(jìn)行Duncan法多重比較（α=0.05），結(jié)果見(jiàn)圖3。5種用量間抑菌率均差異顯著。其中1.0 mL的抑菌率最高，抑菌率達(dá)到39.41%；其次是0.25 mL為34.41%；再次是0.5 mL為32.10%；第四為0.125 mL，抑菌率為27.57%；最差的則是0.0625 mL抑菌率為24.83%。這表明，1.0 mL的用量相對(duì)于其他用量可以取得更好的抑菌效果。

2.5 不同提取液提取的核桃青皮提取物對(duì)梨黑斑病菌絲的室內(nèi)毒力測(cè)定

由表2可知，不同提取液提取的核桃青皮提取物對(duì)梨黑斑病菌的毒力回歸方程的相關(guān)系數(shù)均高于0.9000，說(shuō)明該試驗(yàn)具有較高的精密度。由各時(shí)期的EC50值可知，50%甲醇提取的成熟期核桃青皮提取物對(duì)梨黑斑病菌絲的抑制效果最好，毒力最強(qiáng)，EC50值為4.624483442，相關(guān)系數(shù)為0.999755572。

3 結(jié)論

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可得出結(jié)論，4種提取物中，甲醇對(duì)核桃青皮中對(duì)梨黑斑病的抑菌物質(zhì)的萃取效果最好；不同用量的核桃青皮提取物對(duì)梨黑斑病的菌落生長(zhǎng)均具有不同程度的抑制效果，其中1.0 mL的核桃青皮提取物相對(duì)于其他用量對(duì)梨黑斑病可以取得更好的抑菌效果。50%甲醇提取的成熟期核桃青皮提取物對(duì)菌落生長(zhǎng)抑菌效果最好，此抑制率可達(dá)到38.73%，對(duì)病原菌的毒力最強(qiáng)，EC50為4.624483442 mL/100mL。

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收稿日期：2024-03-10

基金項(xiàng)目：衡水學(xué)院校級(jí)項(xiàng)目（2023ZRY15）；2023年“河北省濕地保護(hù)與綠色發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心”專(zhuān)項(xiàng)課題（2023XTCX004）；2023年“河北省濕地保護(hù)與綠色發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心”專(zhuān)項(xiàng)課題（2023XTCX005）

第一作者簡(jiǎn)介：侯敬儀（2002-），女，在讀學(xué)生，主要從事植物病理方面的研究。

*通信作者：高小寬（1981-），女，講師，主要從事植物病理方面的研究。