乳酸菌發(fā)酵菊芋馬齒莧復(fù)合飲料及其抑菌活性

張宏志　馬艷弘　李亞輝等

摘要：以鮮菊芋和馬齒莧為原料，經(jīng)打漿、滅菌、混合調(diào)配等預(yù)處理后接種乳酸菌發(fā)酵劑進(jìn)行發(fā)酵，采用單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)分別確定制備菊芋馬齒莧乳酸菌飲料的最佳發(fā)酵條件、穩(wěn)定劑配方，并探討該飲料的體外抑菌活性。結(jié)果表明，在接種量4%、發(fā)酵溫度41 ℃、發(fā)酵時(shí)間20 h的條件下，菊芋馬齒莧乳酸菌飲料的乳酸產(chǎn)量和感官品質(zhì)俱佳，酸度為1.18%；最優(yōu)穩(wěn)定劑配方為黃原膠0.010%、瓜爾豆膠0.006%、耐酸型CMC 0.008%，其離心沉淀率僅為0.31%；菊芋馬齒莧乳酸菌飲料對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、釀酒酵母、黑曲霉等微生物的抑菌作用顯著，且抑菌效果隨作用濃度的增加而顯著提高。菊芋馬齒莧乳酸菌飲料兼具馬齒莧多糖、菊糖的諸多功效以及乳酸菌的益生抗菌作用，是一種開發(fā)前景廣闊的營(yíng)養(yǎng)保健型功能飲料。

關(guān)鍵詞：菊芋；馬齒莧；乳酸菌；復(fù)合飲料；抑菌

中圖分類號(hào)： TS275.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0362-04

收稿日期：2015-01-13

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號(hào)：CX（12）1005、CX（14）5059]；江蘇省科技支撐計(jì)劃（農(nóng)業(yè)）（編號(hào)：BE2014347）。

作者簡(jiǎn)介：張宏志（1985—），男，山西汾陽(yáng)人，博士，助理研究員，主要從事功能性低聚糖和多糖的研究。E-mail：zhz0731@sina.cn。

通信作者：馬艷弘，博士，副研究員，主要從事生物技術(shù)與功能食品研究。E-mail：ma_yhhyy@126.com。菊芋（Helianthus tuberosus L.）別稱洋姜、生姜，為菊科向日葵屬多年生草本植物，其適應(yīng)性廣、耐貧瘠、產(chǎn)量高，適于在灘涂地、鹽堿地種植。菊芋塊莖的產(chǎn)量一般為30 000～60 000 kg/hm2，其富含菊糖（別稱菊粉），菊糖含量為菊芋濕質(zhì)量的10%～20%、干質(zhì)量的80%左右，菊芋塊莖是生產(chǎn)菊糖及其制品的首選原料[1]。菊糖是由D-果糖經(jīng)（2→l）糖苷鍵脫水聚合而成的果聚糖，呈直鏈結(jié)構(gòu)，其末端連接1個(gè)葡萄糖殘基，每個(gè)菊糖分子含30～50個(gè)果糖殘基[2]。菊糖不僅是天然功能性食用多糖，也是一種可溶性膳食纖維，能夠增加腸道內(nèi)雙歧桿菌、防止腸道感染、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、控制血脂、防治便秘和肥胖、降低血糖；此外，菊糖作為糖、脂肪的替代物被大量用于低熱量、低糖、低脂肪食品中，可顯著改善無脂、低脂食品的口感和質(zhì)感[3]。菊芋菊糖的開發(fā)利用受到國(guó)內(nèi)外食品界的高度重視。

馬齒莧（Portulaca oleracea L.）別稱五行草、長(zhǎng)壽菜等，為馬齒莧科一年生肉質(zhì)草本植物，具有耐旱、耐貧瘠、生長(zhǎng)速度快等特點(diǎn)，廣布于田間、菜園、路旁等，近年來部分地區(qū)對(duì)其進(jìn)行田間栽種[4]?，F(xiàn)代研究表明，馬齒莧含有多種對(duì)人體有益的營(yíng)養(yǎng)成分和藥用成分，既是常見中草藥，也是人們喜愛的野生蔬菜，已被我國(guó)衛(wèi)生部定為藥食共有資源。馬齒莧富含海產(chǎn)品中特有的ω-3不飽和脂肪酸，能夠防止動(dòng)脈粥樣硬化、延緩血栓形成、顯著改善心血管疾?。煌瑫r(shí)含有大量去甲腎上腺素，能夠促進(jìn)胰島素分泌、調(diào)節(jié)人體糖代謝、降低血糖濃度、保持血糖穩(wěn)定，對(duì)治療糖尿病有良效。馬齒莧對(duì)大腸桿菌、痢疾桿菌等腸道病菌的生長(zhǎng)有明顯抑制作用，可用于治療腸炎、痢疾、闌尾炎、乳腺炎、腮腺炎、尿道感染等多種炎癥疾病，外用可治療丹毒及毒蛇咬傷，素有“天然抗生素”之稱[5-6]。馬齒莧作為新型的食物源，被營(yíng)養(yǎng)學(xué)家譽(yù)為21世紀(jì)最有前途的綠色食品之一，已引起越來越多人的關(guān)注。

馬齒莧和菊芋是優(yōu)良的功能食品原料，目前對(duì)它們的開發(fā)研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。國(guó)內(nèi)關(guān)于馬齒莧的研究主要集中于其藥用成分的藥理、中醫(yī)應(yīng)用、野菜資源開發(fā)利用等方面，關(guān)于馬齒莧功能飲料的研究非常少，已有的文獻(xiàn)報(bào)道僅僅是將馬齒莧汁與其他原料簡(jiǎn)單混合，并添加檸檬酸、蔗糖等輔料調(diào)制而成的果蔬復(fù)合飲料[7-9]，功能性更強(qiáng)的馬齒莧、菊芋系列保健產(chǎn)品仍有待開發(fā)。結(jié)合乳酸菌的發(fā)酵優(yōu)勢(shì)制得的發(fā)酵飲品具有廣闊的發(fā)展前景，兼具原料和乳酸菌發(fā)酵食品的雙重優(yōu)點(diǎn)，不僅能滿足人們對(duì)營(yíng)養(yǎng)和保健的需求、豐富軟飲料市場(chǎng)，還可獲得可觀的經(jīng)濟(jì)效益。

1材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮、無霉?fàn)€、無病蟲害的菊芋和馬齒莧均購(gòu)自江蘇大豐鹽土大地有限公司。植物乳酸菌（Lactobacillus plantarum 70810）由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物研究室提供，黑曲霉（Aspergillus niger）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）均為筆者所在研究室保藏菌種。苯酚、濃硫酸、3，5-二硝基水楊酸等均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蔗糖、蜂蜜、黃原膠、瓜爾豆膠、海藻酸鈉、果膠、耐酸型羧甲基纖維素鈉（CMC）等均為市售食品級(jí)。果蔬脫衣劑購(gòu)自廈門味可多食品添加劑有限公司。

1.2儀器設(shè)備

JJ500型電子天平（江蘇省常熟市雙杰測(cè)試儀器廠產(chǎn)品），DK-8D型電熱恒溫水槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品），HR2096型攪拌機(jī)（飛利浦電子香港有限公司產(chǎn)品），D-8型紫外可見分光光度計(jì)（上海奧析科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品），F(xiàn)E-20型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（梅特勒-托利儀器有限公司產(chǎn)品），LXJ-ⅡB型低速大容量多管離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品）。

1.3工藝流程

具體工藝流程見圖1。

1.4操作要點(diǎn)

1.4.1菊芋汁的制備將新鮮菊芋洗凈后瀝干，蒸煮至熟化，浸入85 ℃含1.5%果蔬脫衣劑的水溶液，靜置15 min并輕微攪拌，待菊芋表皮自然脫落后將菊芋塊莖取出，按料水比1 g ∶5 mL打漿、90 ℃熱水浸提90 min、121 ℃滅菌20 min，得到無褐變反應(yīng)的菊芋汁。

1.4.2馬齒莧汁的制備將馬齒莧洗凈，于沸水中漂燙1～2 min，瀝干后按料水比1 g ∶3 mL打漿，添加0.05%果膠酶酶解2.5 h，于80～90 ℃保持20 min、121 ℃滅菌20 min，得到用于發(fā)酵的馬齒莧汁。

1.4.3發(fā)酵劑的活化將乳酸菌發(fā)酵劑植物乳桿菌按2%的接種量于培養(yǎng)基（菊芋汁50 mL+馬齒莧汁50 mL+脫脂乳粉10 g）中活化培養(yǎng)2～3次，至活菌數(shù)達(dá)到1 億CFU/mL時(shí)放入4 ℃冰箱保藏，作為菊芋馬齒莧復(fù)合發(fā)酵飲料的種子液。

1.4.4菊芋馬齒莧乳酸菌飲料的發(fā)酵制備在無菌條件下將菊芋汁和馬齒莧汁按質(zhì)量比3 ∶1混勻，調(diào)節(jié)pH值至中性，加入4%蔗糖以提高產(chǎn)酸水平。按一定接種量接入工作發(fā)酵劑，于恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。發(fā)酵結(jié)束后，利用紗布過濾除去濾渣，再經(jīng)4 500 r/min離心20 min，棄去沉淀得到澄清發(fā)酵液。最后向發(fā)酵液加入5%蔗糖、2%蜂蜜、穩(wěn)定劑等輔料，均勻混合。灌裝封罐后采用高溫85 ℃殺菌30 min，經(jīng)冷卻貼標(biāo)后即為成品。對(duì)成品抽樣進(jìn)行感官、理化指標(biāo)、微生物指標(biāo)的檢驗(yàn)。

1.5指標(biāo)測(cè)定

1.5.1部分理化指標(biāo)的測(cè)定采用苯酚硫酸法測(cè)定總糖含量，采用3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖，采用pH計(jì)測(cè)定pH值，采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)。其中，多糖含量（g）=總糖含量（g）-還原糖含量（g）。

1.5.2酸度的測(cè)定 采用滴定酸度法[10]測(cè)定酸度。吸取 5 mL 樣液，加入45 mL煮沸并冷卻至室溫的蒸餾水，添加 2～3 滴酚酞指示劑，用0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色，以30 s不褪色為終點(diǎn)，記錄NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液所消耗的體積（V，mL），計(jì)算酸度并推算為乳酸含量（以%計(jì)）。乳酸含量=（0.1×V×0.09）/5×100%。

1.5.3穩(wěn)定性測(cè)定 準(zhǔn)確量取10 mL配制好的飲料，采用離心沉淀法，以3 500 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min并棄去上清液，準(zhǔn)確稱量沉淀物質(zhì)量，計(jì)算樣品沉淀率[11]。每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行測(cè)定，取沉淀率平均值。沉淀率（%）=沉淀物質(zhì)量（g）/離心飲料質(zhì)量（g）×100%。

1.5.4感官指標(biāo)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)感官指標(biāo)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.5.5體外抑菌試驗(yàn)（1）供試菌種為黑曲霉、釀酒酵母、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌。

（2）進(jìn)行抑菌圈試驗(yàn)。分別取0.1 mL供試菌懸液，于馬鈴薯瓊脂（PDA）培養(yǎng)基表面涂布均勻，用無菌鑷子夾取浸有菊芋馬齒莧乳酸菌發(fā)酵飲料的濾紙片貼于各含菌平板上，以浸有無菌水的濾紙片作對(duì)照。黑曲霉、釀酒酵母于28 ℃培養(yǎng)48 h，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌于37 ℃培養(yǎng)24 h。每個(gè)菌種做3個(gè)平板，測(cè)量各自抑菌圈直徑的大小，比較抑菌效果。

（3）進(jìn)行最小抑菌濃度（MIC）試驗(yàn)。分別取0.1 mL供試菌懸液，依次加入到100.00%、50.00%、25.00%、1250%、6.25%菊芋馬齒莧乳酸菌發(fā)酵飲料水溶液中，充分搖勻。黑曲霉、釀酒酵母于28 ℃培養(yǎng)48 h，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌于37 ℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完成后取出觀察，管底有膜狀生成物，或管內(nèi)液體渾濁則為陽(yáng)性管；管內(nèi)液體澄清，肉眼未見有菌生長(zhǎng)則為陰性管。找出乳酸菌發(fā)酵菊芋馬齒莧抑菌液濃度最小的陰性管，其濃度即為最小抑菌濃度（MIC）。

2結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵條件的確定

乳酸菌飲料的產(chǎn)酸情況、風(fēng)味口感與發(fā)酵過程中的工藝參數(shù)密切相關(guān)。由發(fā)酵單因素試驗(yàn)（表2）結(jié)果可知，菌種接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸菌飲料的產(chǎn)酸情況影響顯著，其基本的發(fā)酵條件為：接種量2%、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時(shí)間20 h。以菌種接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間為研究對(duì)象，進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，待發(fā)酵結(jié)束后選取乳酸產(chǎn)量、感官作為共同評(píng)價(jià)指標(biāo)，以確定菊芋馬齒莧乳酸菌飲料的最優(yōu)發(fā)酵條件，即接種量為2%、4%、6%，發(fā)酵溫度37、39、41 ℃，發(fā)酵時(shí)間為16、20、24 h，其具體的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表3。

2.2產(chǎn)品穩(wěn)定性

離心沉淀率直接反映產(chǎn)品的穩(wěn)定性程度，影響產(chǎn)品的保質(zhì)期、風(fēng)味、口感等各項(xiàng)指標(biāo)。根據(jù)不同穩(wěn)定劑的特性及前期試驗(yàn)結(jié)果，分別選用黃原膠、果膠、耐酸型CMC、瓜爾豆膠、海藻酸鈉5種單體穩(wěn)定劑，以離心沉淀率為指標(biāo)進(jìn)行單因素篩選試驗(yàn)（表4），每組試驗(yàn)重復(fù)3次并取平均值。

由穩(wěn)定劑單因素試驗(yàn)可知，單一穩(wěn)定劑很難達(dá)到理想效果，須使用復(fù)合穩(wěn)定劑，所以選用穩(wěn)定效果較好的黃原膠、耐酸型CMC、海藻酸鈉進(jìn)行正交試驗(yàn)，以確定最佳的配比含量。

由極差分析結(jié)果（表5）可知，黃原膠含量對(duì)飲料的體態(tài)穩(wěn)定性影響最大，其次是耐酸型CMC含量，瓜爾豆膠含量影響最小。由正交試驗(yàn)得到最佳穩(wěn)定劑組合為A2B1C3，即黃原膠含量0.010%、瓜爾豆膠含量0.006%、耐酸型CMC含量 0.008%，經(jīng)驗(yàn)證該參數(shù)組合產(chǎn)品的離心沉淀率為0.31%。

2.3產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)

具體情況見表6。

2.4體外抑菌活性

2.4.1抑菌效果抑菌圈直徑可直觀反映各種抑菌液的抗菌能力。通過比較菊芋馬齒莧乳酸菌飲料對(duì)各種微生物的抑菌圈直徑（圖2），可對(duì)乳酸發(fā)酵液的抗菌性作出較全面的評(píng)判。

試驗(yàn)結(jié)果表明，菊芋馬齒莧乳酸菌飲料對(duì)黑曲霉、釀酒酵母、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均有明顯的抑制作用，具有潛在的廣譜抗菌活性。可能是由于乳酸菌代謝過程中產(chǎn)生的乳酸、乙酸等有機(jī)酸大幅降低了環(huán)境的pH值和氧化還原電位，并能產(chǎn)生細(xì)菌素，從而抑制或殺滅多種致病菌、腐敗菌[13-15]；也可能由于飲料中的馬齒莧多糖、菊芋多糖均具有顯著的抑菌活性[16-20]。

具有純正濃郁的乳酸菌發(fā)酵氣味，并伴有菊芋清香和輕微中草藥味，無任何異味口味酸甜適中，口味協(xié)調(diào)細(xì)膩 理化指標(biāo)總糖含量（%）9.82還原糖含量（%）0.75酸度（%）1.18pH值3.85微生物大腸菌群（CFU/mL）≤2指標(biāo)霉菌計(jì)數(shù)（CFU/mL）≤30酵母菌數(shù)（CFU/mL）≤45致病菌無法檢出

2.4.2最小抑菌濃度（MIC）按照“1.5.5”節(jié)的方法對(duì)菊芋馬齒莧乳酸菌飲料的最小抑菌濃度進(jìn)行研究（表7）。

菊芋馬齒莧乳酸菌飲料對(duì)不同微生物的生長(zhǎng)抑制作用存在較大差異，其對(duì)大腸桿菌的抑制作用在較低濃度下也較為明顯，而對(duì)黑曲霉的MIC卻在濃度為100%時(shí)才起作用。各微生物的最小抑菌濃度分別為：黑曲霉100%、釀酒酵母50%、金黃色葡萄球菌50%、大腸桿菌25%。隨著菊芋馬齒莧乳酸菌飲料濃度的降低，平皿中菌落生長(zhǎng)越來越多，這也表明菊芋馬齒莧發(fā)酵液的濃度與其抑菌效果呈一定量效關(guān)系。

3結(jié)論與討論

3.1原料選擇

本研究選用藥食同源的馬齒莧和菊芋作為原料，且均采于鹽堿灘涂，材料價(jià)格低廉、來源廣泛。由其制備的乳酸菌飲料富含去甲腎上腺素、ω-3不飽和脂肪酸、維生素、馬齒莧多糖、菊糖等多種活性成分，融合了馬齒莧多糖、菊糖的益生元作用和乳酸菌的益生抗菌作用，是一種開發(fā)前景廣闊的營(yíng)養(yǎng)保健型飲料。新鮮蔬菜榨汁后經(jīng)乳酸菌發(fā)酵，可部分替代發(fā)酵乳制品飲料，在降低乳酸菌發(fā)酵飲料成本的同時(shí)增加乳酸菌飲料的花色品種，這成為未來發(fā)酵飲品的重要發(fā)展方向之一。

3.2前處理工藝

在原料前處理中，將清洗后的菊芋蒸煮至熟化狀態(tài)不僅防褐變效果顯著，保證菊芋汁的色澤、品質(zhì)，還有助于菊芋細(xì)胞中菊糖的溶解和溶出，顯著提高菊芋汁中的菊糖含量。馬齒莧純汁微酸、較澀、中草藥味濃，直接制備飲料口味欠佳，將其與菊芋汁配伍進(jìn)行乳酸發(fā)酵，賦予其豐富的口味和香味，并有效改善口感。

3.3發(fā)酵菌種及工藝的選擇

目前，乳酸菌發(fā)酵果蔬飲料主要采用經(jīng)馴化得來的嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌等酸奶生產(chǎn)菌株，其生長(zhǎng)緩慢、發(fā)酵效果不佳、口味不協(xié)調(diào)。本試驗(yàn)選用的乳酸菌發(fā)酵劑為植物乳桿菌，它分離自泡菜，使制得的飲品口味和諧自然，乳酸菌活菌數(shù)高，且后期存活率高。由于來自同為植物源的泡菜，植物乳桿菌在發(fā)酵馬齒莧和菊芋上具有無法比擬的優(yōu)越性。在發(fā)酵工藝的選擇上，一般果蔬飲料均采用清汁發(fā)酵，即先把濾渣去除再發(fā)酵；本研究則選用帶渣發(fā)酵工藝，通過乳酸菌的代謝和轉(zhuǎn)化，最大程度利用發(fā)酵基質(zhì)中的營(yíng)養(yǎng)和藥用成分。相比清汁發(fā)酵，乳酸發(fā)酵的酵香和馬齒莧、菊芋的清香更為濃厚。

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