基于蛋白沉淀光譜分析的核桃澀味評價(jià)技術(shù)研究

彭佳佳　姚佩　史單華　楊晉豫　鄭雄　張小軍　劉群龍

摘 要：【目的】建立核桃內(nèi)種皮澀味綜合評價(jià)體系，為鮮食核桃品種選育提供理論依據(jù)。【方法】選用澀味差異明顯的6個(gè)核桃品種（系），通過感官評價(jià)、內(nèi)種皮水浸法和蛋白質(zhì)化學(xué)沉淀法相結(jié)合的評價(jià)方式，初步建立核桃內(nèi)種皮澀味綜合評價(jià)技術(shù)體系。【結(jié)果】6個(gè)品種（系）的直接口感澀味值為5.83～9.27，分為差異顯著的3類。水浸出物濃度為10 mg/mL時(shí)，依據(jù)水浸出物澀味值‘汾核4號和‘ND-2為一類，其余4個(gè)品種（系）各為一類。內(nèi)種皮提取液濃度為20 μl/mL時(shí)，蛋白沉淀在222 nm波長下吸光值差異最大，可將6個(gè)品種（系）分為差異顯著的4類。內(nèi)種皮化學(xué)沉淀吸光值與直接口感澀味值的相關(guān)系數(shù)為0.96，內(nèi)種皮化學(xué)沉淀吸光值與10 mg/mL內(nèi)種皮水浸出物澀味值相關(guān)系數(shù)為0.97，均呈極顯著正相關(guān)。【結(jié)論】核桃內(nèi)種皮提取液濃度為20 μl/mL，222 nm波長條件下，通過蛋白質(zhì)沉淀全光譜掃描，結(jié)合感官評價(jià)，可對核桃內(nèi)種皮澀味進(jìn)行有效評價(jià)。

關(guān)鍵詞：核桃；澀味；感官評價(jià)；蛋白質(zhì)沉淀法

文章編號：2096-8108（2024）03-0018-06中圖分類號：S664.1中圖分類號文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文獻(xiàn)標(biāo)志碼

Evaluation Technique of Astringency of Walnut Based on Protein Precipitation Spectrum Analysis

PENG? Jiajia，YAO? Pei，SHI? Danhua，YANG? Jinyu，ZHENG? Xiong，ZHANG? Xiaojun，LIU? Qunlong*

（College of Horticulture， Shanxi Agricultural University， Taigu Shanxi 030801， China）

Abstract：【Objective】The establishment of a comprehensive evaluation system for the astringency of walnut kernel pellicle is of great significance to the breeding of fresh walnut varieties.【Methods】In this study， a comprehensive evaluation system for astringency of walnut kernel pellicle was established through sensory evaluation， kernel pellicle water immersion and protein chemical precipitation.【Results】The astringency value of the direct taste of the 6 cultivars was 5.83-9.27， which was divided into 3 categories with significant differences. When the concentration of water extract was 10 mg/mL， according to the astringency value of water extract， ‘Fenhe 4 and ‘ND-2 were classified as one class， and the other 4 cultivars were classified as one class each. When the concentration of walnut kernel pellicle extract was 20 μl/mL， the absorption value of protein precipitation at 222 nm was the most different. The 6cultivars could be divided into 4 categories with significant differences. The correlation coefficients between the light absorption value of chemical precipitation and the astringency value of direct taste and 10 mg/mL water extract of walnut kernel pellicle extract were 0.96 and 0.97， respectively， showing a very significant positive correlation .【Conclusion】Under the condition of 20μl/mL and 222 nm wavelength， the astringency of walnut kernel pellicle extract can be effectively evaluated by the full spectrum scanning of protein precipitation combined with sensory evaluation.

Keywords：walnut; astringency; sensory evaluation; protein precipitation method

世界衛(wèi)生組織建議成年人每天攝入375～500 g水果和蔬菜，但一些不利于食用的滋味直接影響食物的食用量［1-3］。適當(dāng)?shù)臐犊韶S富果實(shí)的滋味，澀味過高則會引起果實(shí)品質(zhì)下降［4-6］。澀味存在于多種植物中，如水果、蔬菜和茶葉。在果實(shí)澀味方面研究最多的樹種有柿子［7-10］、葡萄［11-13］、蘋果［5］、石榴［6］等，澀味物質(zhì)主要集中分布于種子、果皮和果柄部位［14-15］。澀味物質(zhì)如兒茶素、黃酮類化合物及酚酸類化合物，在所有植物源食物中都很常見，但對果實(shí)的澀味貢獻(xiàn)不同，許多澀味物質(zhì)僅在特定分類群中合成，并對相應(yīng)物種的澀味起主要作用。

核桃作為多酚物質(zhì)的第七大來源，其酚類含量顯著高于花生、杏仁、榛子等堅(jiān)果，對人體健康有重要作用。內(nèi)種皮在保護(hù)種仁的同時(shí)，其中的酚類物質(zhì)也為核桃仁增添了澀味。澀味在內(nèi)種皮高度集中，影響了人們對于核桃產(chǎn)品的消費(fèi)，同時(shí)也影響核桃滋味的口感評價(jià)。蛋白質(zhì)化學(xué)沉淀作為體外定量分析澀味的方法之一，可與口感評價(jià)相結(jié)合對內(nèi)種皮澀味進(jìn)行綜合評價(jià)。本研究選用澀味差異明顯的6個(gè)核桃品種（系），通過直接口感法、內(nèi)種皮水浸法和蛋白質(zhì)化學(xué)沉淀法相結(jié)合的評價(jià)方式，初步建立核桃內(nèi)種皮澀味綜合評價(jià)體系，為核桃無澀或低澀種質(zhì)資源評價(jià)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為‘汾核2號‘汾核4號‘禮品1號‘ND-2‘ND-1和‘農(nóng)核1號核桃品（系），均栽植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝試驗(yàn)站核桃種質(zhì)資源圃。每個(gè)品種（系）選取6株樹齡一致、長勢較一致的植株，每2株為1個(gè)重復(fù)，設(shè)3次重復(fù)。2021年9月果實(shí)成熟時(shí)，從每株試驗(yàn)樹的東、南、西、北4個(gè)方向樹冠內(nèi)外隨機(jī)采集30個(gè)無病蟲害果實(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室，打開堅(jiān)果，用鑷子將核桃種仁和內(nèi)種皮剝離，液氮速凍，冷凍干燥24 h后研磨成粉，-20℃干燥保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 感官評價(jià)

感官評價(jià)小組由23～27歲的10位本課題組成員組成，在進(jìn)行核桃內(nèi)種皮澀味口感評價(jià)前需進(jìn)行澀味強(qiáng)度訓(xùn)練，確保小組成員關(guān)于澀味標(biāo)準(zhǔn)近于相似。參考Tu等［16］的訓(xùn)練方法，選擇不同濃度的單寧酸作為參比溶液對澀味程度進(jìn)行培訓(xùn)。單寧酸溶液的澀味分為5等級，標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。本研究需對核桃內(nèi)種皮水浸出液與內(nèi)種皮進(jìn)行澀味口感評價(jià)，在口感評價(jià)過程中，保持各樣品在口腔中持續(xù)20 s左右后吐出后再進(jìn)行評分，將澀味的平均值作為該樣品的澀味值，兩個(gè)樣品間的澀味評價(jià)需間隔20 min。

1.2.2 內(nèi)種皮水浸出物體系的制備

6個(gè)核桃品種（系）分別稱取100 mg、250 mg、500 mg、750 mg及1000 mg的內(nèi)種皮干樣，用食品級茶包袋進(jìn)行包裝并置于干凈燒杯中，加入100 mL 37℃純凈水，攪動茶包使其沉于燒杯底部并靜置10 min，得到不同濃度的內(nèi)種皮水浸出物體系。在每個(gè)評審杯中加入10 mL內(nèi)種皮水浸出液，用于評審小組的口感評價(jià)。

1.2.3 化學(xué)沉淀法

樣品提取液的制備：準(zhǔn)確稱取0.1 g核桃內(nèi)種皮粉末，加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%甲醇水溶液，超聲條件參考鄭曉寧等［17］方法，溫度為40 ℃超聲提取50 min（40 KHz），于低溫（-10℃）12 000 r·min-1離心15 min，取出上清液待測。

蛋白化學(xué)沉淀反應(yīng)參考陳多多等［18］的方法，稍作修改。不同品種核桃內(nèi)種皮提取液0.1 mL稀釋配制為不同濃度梯度提取液，取不同濃度梯度的提取液0.1 mL于試管中加入0.5 mL 0.1%牛血清蛋白溶液（牛血清蛋白溶于pH值為5的Nacl溶液），使用蒸餾水定容至2.5 mL，37 ℃水浴30 min，利用UV-2600i紫外分光光度計(jì)在波長190～750 nm范圍對反應(yīng)體系進(jìn)行掃描，每個(gè)樣品重復(fù)3次，取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析、顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃內(nèi)種皮直接口感澀味評價(jià)

對6個(gè)核桃品種（系）內(nèi)種皮的澀味程度進(jìn)行直接口感澀味評價(jià)，結(jié)果見表2。參照單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液澀味體系等級分布對6個(gè)品種（系）進(jìn)行直接口感評價(jià)，依據(jù)澀味值可將6個(gè)品種（系）分為差異顯著的3個(gè)澀味等級，‘禮品1號和‘汾核2號澀味值分別為9.27和9.03，為第1類，該類別中澀味值顯著高于其余4個(gè)品種（系）；‘汾核4號和‘ND-2澀味值處于中間值，分別為7.80和8.33，為第2類；‘ND-1和‘農(nóng)核1號澀味值較低，分別為5.83和6.02，為第3類，該類別澀味值顯著低于其余4個(gè)品種（系）?！Y品1號澀味值最高，‘ND-1澀味值最低，最高的澀味值是最低澀味值的1.59倍。

2.2 核桃內(nèi)種皮水浸出物澀味評價(jià)方法的建立

對6個(gè)核桃品種（系）果實(shí)內(nèi)種皮的澀味程度進(jìn)行水浸出物澀味評價(jià)，結(jié)果見表3。水浸出物濃度為1.0 mg/mL時(shí)，6個(gè)品種（系）澀味值分布于標(biāo)準(zhǔn)溶液澀味等級1中，‘禮品1號內(nèi)種皮澀味值最高，為1.07，其澀味值與‘汾核4號‘ND-1和‘農(nóng)核1號差異顯著，與‘汾核2號和‘ND-2差異不顯著。其中‘農(nóng)核1號澀味值最低為0.17，接近0，澀味低于或等于感覺閾值，不利于味覺對澀味的感知。在該濃度下，不同品種（系）澀味值差異較小。

內(nèi)種皮水浸提物濃度為2.5、5.0、7.5、10.0 mg/mL時(shí)，水浸出物澀味值可對不同核桃品種（系）澀味值進(jìn)行較好區(qū)分。水浸出物濃度為2.5mg/mL時(shí)，‘禮品1號‘汾核2號和‘ND-2澀味值顯著高于其他3個(gè)品種（系），‘ND-1澀味為1.50，顯著低于其余5個(gè)品種（系），該濃度下內(nèi)種皮澀味值可將6個(gè)品種（系）分為差異顯著的3類；水浸出物濃度為5.0 mg/mL時(shí)，‘禮品1號與‘汾核2號澀味值差異顯著，‘ND-1澀味值顯著低于其余5個(gè)品種（系），該濃度下內(nèi)種皮澀味值可將6個(gè)品種（系）分為差異顯著的3類；水浸出物濃度為7.5 mg/mL時(shí)，6個(gè)核桃品種（系）內(nèi)種皮澀味值為3.43～7.10，不同品種（系）間澀味值差異顯著，分為差異顯著的5類；水浸出物濃度為10.0 mg/mL時(shí)，6個(gè)核桃品種（系）澀味值為5.40～8.83，可將6個(gè)品種（系）分為差異顯著的5類。因此，核桃內(nèi)種皮水浸出物濃度為7.5 mg/mL和10.0 mg/mL時(shí)，各品種（系）間澀味值差異較大，有利于味覺對不同品種澀味進(jìn)行區(qū)分。

2.3 核桃內(nèi)種皮化學(xué)沉淀澀味評價(jià)方法的建立

對6個(gè)核桃品種（系）果實(shí)內(nèi)種皮不同濃度提取液與牛血清蛋白質(zhì)互作發(fā)生的化學(xué)沉淀進(jìn)行190～750 nm全光譜掃描，結(jié)果見圖1。6個(gè)品種（系）各濃度內(nèi)種皮提取液與牛血清蛋白溶液生成的絡(luò)合物在200～400 nm光譜下吸收值變化較大，核桃內(nèi)種皮酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)互作形成的絡(luò)合物在222 nm波長處吸光值最大。因此，222 nm波長可用于核桃內(nèi)種皮酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)沉淀的測定。

由表4可知，測定波長為222 nm時(shí)，固定蛋白質(zhì)溶液的濃度，化學(xué)沉淀吸光值隨核桃品種內(nèi)種皮提取液濃度的增大而增大。內(nèi)種皮提取液濃度為5～15 μl/mL，‘ND-1和‘農(nóng)核1號中化學(xué)沉淀吸光值低于最低有效值0.2，內(nèi)種皮提取液濃度為35～50 μl/mL時(shí)，‘禮品1號和‘汾核2號中化學(xué)沉淀吸光值高于最高有效值0.8，內(nèi)種皮提取液濃度為2、25、30 μl/mL時(shí)，6個(gè)核桃品種（系）內(nèi)種皮酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)形成的絡(luò)合物吸光值在0.2～0.8有效值之間。內(nèi)種皮提取液濃度為20 μl/mL，不同核桃品種間吸光值差異最大，‘汾核2號化學(xué)沉淀吸光值最高為0.48，‘ND-1化學(xué)沉淀吸光值最低為0.20，依據(jù)化學(xué)沉淀吸光值可將6個(gè)品種（系）分為差異顯著的4類；提取液濃度為25、30 μl/mL時(shí)，依據(jù)化學(xué)沉淀吸光值將6個(gè)品種（系）分為差異顯著的3類。不同核桃品種（系）內(nèi)種皮提取液濃度為30 μl/mL，其化學(xué)沉淀吸光值在有效值范圍內(nèi)最大吸光值為0.36～0.73。因此，化學(xué)沉淀法中核桃內(nèi)種皮提取液最適濃度為20 μl/mL，不同核桃品種化學(xué)沉淀吸光值差異最顯著。

2.4 核桃內(nèi)種皮直接口感澀味值、水浸出物澀味值和化學(xué)沉淀吸光值的相關(guān)性分析

對核桃內(nèi)種皮直接口感澀味值、水浸出物澀味值和化學(xué)沉淀吸光值（提取液濃度為20 μl/mL）進(jìn)行pearson相關(guān)性分析，結(jié)果見表5。內(nèi)種皮化學(xué)沉淀吸光值與1.0 mg/mL水浸出物的澀味值相關(guān)但不顯著，1.0 mg/mL水浸出物澀味值對核桃內(nèi)種皮綜合澀味評價(jià)影響最小。內(nèi)種皮化學(xué)沉淀吸光值與2.5 mg/mL水浸出物的澀味值呈顯著相關(guān)（P<0.05），相關(guān)系數(shù)為0.90。內(nèi)種皮化學(xué)沉淀吸光值與5.0、7.5、10.0 mg/mL內(nèi)種皮水浸出物澀味值和直接口感澀味值呈極顯著正相關(guān)（p<0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.94、0.95、0.97、0.96，與10.0 mg/mL水浸出物的澀味值相關(guān)系數(shù)最大，10.0 mg/mL水浸出物澀味值對內(nèi)種皮對核桃內(nèi)種皮澀味綜合評價(jià)影響最大。內(nèi)種皮化學(xué)沉淀吸光值與直接口感澀味值相關(guān)性系數(shù)為0.96，高于化學(xué)沉淀吸光值與5.0 mg/mL及7.5 mg/mL內(nèi)種皮水浸出物的澀味值的相關(guān)系數(shù)。因此，核桃內(nèi)種皮澀味評價(jià)可依據(jù)直接口感澀味值、10.0 mg/mL內(nèi)種皮水浸出物的澀味值和化學(xué)沉淀吸光值進(jìn)行綜合分析。

3 討論與結(jié)論

本研究采用核桃內(nèi)種皮酚類物質(zhì)與牛血清蛋白質(zhì)互作生成化學(xué)沉淀的吸光值作為定量分析內(nèi)種皮澀味的方法，通過對蛋白質(zhì)化學(xué)沉淀全光譜掃描，初步確定222 nm為核桃內(nèi)種皮蛋白沉淀法的測定波長。王若輝等［19］通過多酚與蛋白質(zhì)沉淀對數(shù)曲線作為衡量核桃內(nèi)種皮澀味高低的指標(biāo)，測定波長為320 nm，而本研究中最大吸收波長為222 nm，這可能是由于反應(yīng)條件（反應(yīng)時(shí)間和蛋白質(zhì)緩沖溶液）不同所致。陳多多等［18］在對柿單寧澀味進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀評價(jià)時(shí)，測定化學(xué)沉淀波長為680 nm，與本研究中波長不一致，可能是由于核桃內(nèi)種皮與柿子中引起澀味的主要物質(zhì)不同有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)種皮化學(xué)沉淀吸光值隨內(nèi)種皮提取液濃度的增加而增大，提取液濃度為20 μL/mL時(shí)，6個(gè)核桃品種（系）化學(xué)沉淀吸光值分為差異較大，可分為4類。茶湯滋味研究中發(fā)現(xiàn)澀味與水浸出物濃度相關(guān)，高濃度水浸出物是茶湯澀味形成的主要原因［20］。葉青青［21］研究表明，蛋白沉淀隨澀味物質(zhì)EGCG濃度的增加而增加，且牛血清蛋白與EGCG生成的沉淀變化值最大。本研究發(fā)現(xiàn)化學(xué)沉淀吸光值（提取液濃度20 μL/mL）與5.0、7.5、10.0 mg/mL內(nèi)種皮水浸出物澀味值和直接口感評價(jià)內(nèi)種皮澀味值呈極顯著相關(guān)（p<0.01），與10 mg/mL內(nèi)種皮水浸出物澀味值相關(guān)系數(shù)最高，為0.97。不同核桃品種（系）內(nèi)種皮澀味在7.5 mg/mL和10.0 mg/mL內(nèi)種皮水浸出物中差異程度高于1.0、2.5和5.0 mg/mL，這與前人研究結(jié)果較一致。對內(nèi)種皮澀味不同評價(jià)方式進(jìn)行主成分分析，結(jié)果表明10.0 mg/mL水浸出物澀味值和直接口感評價(jià)內(nèi)種皮澀味值對內(nèi)種皮綜合澀味影響較大，為影響內(nèi)種皮澀味評價(jià)的主要因素。由于直接口感評價(jià)易導(dǎo)致味覺對于不同品種澀味分辨不準(zhǔn)確，不利于各品種間澀味強(qiáng)度的分辨［22］。本研究基于前期研究結(jié)果，運(yùn)用水浸法和蛋白質(zhì)沉淀光譜分析法，結(jié)合感官評價(jià)，初步建立核桃內(nèi)種皮澀味綜合評價(jià)體系，后續(xù)將進(jìn)一步在不同核桃種質(zhì)資源中進(jìn)行有效驗(yàn)證。

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收稿日期：2023-12-05

基金項(xiàng)目：山西省科技重大專項(xiàng)計(jì)劃（202201140601027）；晉中市科技重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（Y212013）

第一作者簡介：彭佳佳（1995-），女，碩士，主要從事果樹種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用研究。

*通信作者：劉群龍（1974-），男，博士，教授，主要從事果樹種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用研究。E-mail： lql0288@126.com