橋本甲狀腺炎伴甲狀腺腫患者的腸道菌群特征研究

孟淑華 肖瑤 高云逸 魏軍平

橋本甲狀腺炎(hashimoto’s thyroiditis,HT)是一種臨床上常見的自身免疫性甲狀腺疾病,也是目前導(dǎo)致甲狀腺功減退的主要原因[1]。我國(guó)HT的患病率為1.6%,發(fā)病率為0.69%,且近年來HT的發(fā)病率也逐漸升高[2]。該病臨床特征主要包括甲狀腺體積增大、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)以及甲狀腺自身抗體水平升高。HT又分為甲狀腺腫型和萎縮型,然而,HT以及造成兩種不同類型的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,目前臨床上針對(duì)HT的治療也主要以改善甲狀腺功能、調(diào)節(jié)免疫為主,針對(duì)甲狀腺腫尚無特殊治療方式。因此,需要從新的角度探討HT及HT相關(guān)甲狀腺腫的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,以助開發(fā)新的治療用藥。 腸道菌群對(duì)人體健康存在影響已被廣泛認(rèn)可。近年來,隨著16S rRNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,腸道菌群與自身免疫性疾病以及內(nèi)分泌代謝相關(guān)疾病的研究成為熱點(diǎn)。研究表明,HT患者腸道菌群的豐度及多樣性與健康人有明顯差異,因此腸道菌群物種組成和豐度改變可能與HT發(fā)病相關(guān)[3-5]。同時(shí),從組織胚胎學(xué)角度看,甲狀腺是由原始消化管的前腸分化而來,腸道菌群的改變可能對(duì)甲狀腺組織的形態(tài)、大小也存在一定的影響。然而,關(guān)于甲狀腺腫與腸道菌群之間的關(guān)系尚不明確。因此,本研究采用16S rRNA測(cè)序技術(shù)對(duì)HT伴甲狀腺腫患者、HT不伴甲狀腺腫患者和健康人群進(jìn)行腸道菌群檢測(cè),以觀察HT及HT伴甲狀腺腫患者的腸道菌群豐度、多樣性等特征。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年10月至2021年12月于北京市西城區(qū)廣外醫(yī)院、中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院招募的健康受試者(A組,n=10)、HT伴甲狀腺腫患者(B組,n=9)、HT不伴甲狀腺腫患者(C組,n=12)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 HT診斷標(biāo)準(zhǔn):參考2008年中華醫(yī)學(xué)會(huì)內(nèi)分泌學(xué)分會(huì)發(fā)布的《中國(guó)甲狀腺疾病診治指南-甲狀腺炎》[6]中HT的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 甲狀腺腫判斷標(biāo)準(zhǔn):甲狀腺腫的判斷以臨床醫(yī)生的望診及觸診為主,其判斷標(biāo)準(zhǔn)參見《診斷學(xué)》[7]:①甲狀腺Ⅰ度腫大:外觀上看不出,但觸診可以觸及甲狀腺;②甲狀腺Ⅱ度腫大:既可以看到又可以觸及甲狀腺腫大,但腫大范圍在胸鎖乳突肌以內(nèi);③甲狀腺Ⅲ 度腫大:腫大程度超過胸鎖乳突肌外側(cè)緣。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 納入橋本甲狀腺炎伴甲狀腺腫組、不伴甲狀腺腫組的標(biāo)準(zhǔn):①符合橋本甲狀腺炎診斷標(biāo)準(zhǔn);②近3個(gè)月內(nèi)未服用硒酵母片(或膠囊)等硒制劑;③近3個(gè)月內(nèi)未患有感染性疾病或服用抗生素類藥物;④近3個(gè)月內(nèi)未服用任何中藥(包括中成藥、成分明確的湯劑以及成分未知的偏方等);⑤近3個(gè)月內(nèi)未服用過益生菌/益生元或其他微生態(tài)調(diào)節(jié)劑;⑥近3個(gè)月內(nèi)未曾患過包括急性胃腸炎在內(nèi)的任何腸道相關(guān)疾病;⑦年齡18～65歲;納入患者需符合以上全部條件,任何一項(xiàng)為“否”,此受試者不能參加試驗(yàn)。

1.3.2 納入健康受試組的標(biāo)準(zhǔn):①無橋本病或甲狀腺疾病及相關(guān)家族病史;②近3個(gè)月內(nèi)未患有感染性疾病或服用抗生素類藥物;③近3個(gè)月內(nèi)未服用任何中藥(包括中成藥、成分明確的湯劑以及成分未知的偏方等);④近3個(gè)月內(nèi)未服用過益生菌/益生元或其他微生態(tài)調(diào)節(jié)劑;⑤近3個(gè)月內(nèi)未曾患過包括急性胃腸炎在內(nèi)的任何腸道相關(guān)疾病;⑥年齡18～65歲。納入人群需符合以上全部條件,任何一項(xiàng)為“否”,此受試者不能參加試驗(yàn)。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)合并有感染性疾病、惡性腫瘤、冠心病、高血壓、糖尿病、腦血管疾病、白血病、急性心力衰竭、急性冠脈綜合征等嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病者;(2)妊娠期或哺乳期女性;(3)具有精神性疾病患者及不能配合完成試驗(yàn)期間實(shí)驗(yàn)室檢查及問卷調(diào)查者。如以上任何一項(xiàng)為“是”,此受試者不能參加試驗(yàn)。

1.5 調(diào)查內(nèi)容 (1)一般資料:包括受試者的性別、年齡、身高、體重、體重指數(shù)(BMI)、血壓、心率等;(2)甲狀腺功能及自身抗體水平:甲狀腺功能包括:促甲狀腺激素(TSH)、游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)、總?cè)饧谞钕僭彼?TT3)、總甲狀腺素(TT4);甲狀腺自身抗體包括:甲狀腺過氧化物酶抗體(TPO-Ab)和甲狀腺球蛋白抗體(Tg-Ab);(3)甲狀腺超聲檢查;(4)甲狀腺查體:包括甲狀腺的質(zhì)地、大小、是否觸及結(jié)節(jié)及是否存在觸痛等;(5)臨床癥狀及中醫(yī)基本證型:基本證型根據(jù)受試者臨床癥狀及舌脈進(jìn)行判定,分為陰證及陽證兩大證型。

1.6 16S rRNA基因測(cè)序檢測(cè)

1.6.1 糞便樣本采集與保存:準(zhǔn)備糞便樣本收集套裝(包括一次性采樣拭子、穩(wěn)定劑、防震袋、采樣紙、一次性手套)交于受試者。告知受試者先排空尿液,戴上一次性手套取中層未被污染(未直接接觸空氣及便池)的新鮮糞便樣本約2 g置于試管中,囑受試者采集后立即交研究人員。待取得受試者的新鮮糞便樣本后,立刻放入-80℃冰箱保存待行后續(xù)16S rRNA檢測(cè)。

1.6.2 生物信息數(shù)據(jù)提取流程:①常規(guī)方法提取糞便樣本中的總DNA;②針對(duì)V3與V4測(cè)序區(qū)域合成引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增;③將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物純化并進(jìn)行二次擴(kuò)增,引入所需的接頭序列,構(gòu)建16S擴(kuò)增子文庫,并進(jìn)行文庫的純化和質(zhì)檢;④運(yùn)用Illumina MiSeq平臺(tái)將質(zhì)量良好的產(chǎn)物上機(jī)測(cè)序,得到原始數(shù)據(jù)。

1.6.3 生物信息數(shù)據(jù)分析流程:將高通量平臺(tái)測(cè)序后得到的原始數(shù)據(jù)去雜處理后進(jìn)行拼接,得到可用的優(yōu)質(zhì)序列數(shù)據(jù),將相似度高于97%的序列聚類為1個(gè)操作分類單元(OTU),之后與相關(guān)的數(shù)據(jù)庫比對(duì)并進(jìn)行物種注釋?；贠TU豐度進(jìn)行Alpha多樣性分析及Beta多樣性分析,結(jié)果關(guān)聯(lián)后得出腸道菌群的物種豐度及群落結(jié)構(gòu)。Alpha多樣性是指一個(gè)特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性,使用mothur[9]計(jì)算Alpha多樣性指數(shù),以反映樣本中微生物的豐富度和均勻度。其中,Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)反映物種的豐富度,分別是使用Chao1和ACE方法估計(jì)所得樣品中實(shí)際存在的物種數(shù),數(shù)值越大說明物種越豐富;shannon為香農(nóng)指數(shù),評(píng)價(jià)物種數(shù)和各種間個(gè)體分配的均勻性兩部分,其數(shù)值越大,說明樣品多樣性越高,個(gè)體分配越均勻;simpson為辛普森指數(shù),是指隨機(jī)抽取的兩個(gè)個(gè)體屬于不同種的概率,其數(shù)值越小,表明物種多樣性越高。

2 結(jié)果

2.1 3組受試者一般情況比較 3 組受試者的年齡、性別比、身高、體重、BMI、血壓(收縮壓、舒張壓)、心率等一般情況比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組受試者一般情況比較

2.2 HT受試者甲狀腺功能、自身抗體水平及甲狀腺結(jié)節(jié)伴隨情況比較 依據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果參考值范圍為標(biāo)準(zhǔn)將HT受試者分為甲功正常期、亞臨床甲減期與甲減期;根據(jù)TPO-Ab及Tg-Ab>1 000 U/mL作為抗體高滴度的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn);根據(jù)甲狀腺超聲是否檢測(cè)出甲狀腺結(jié)節(jié)作為是否伴有甲狀腺結(jié)節(jié)的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。B組與C組間在甲功分期、甲狀腺滴度、是否伴有甲狀腺結(jié)節(jié)等方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 HT受試者甲狀腺功能、抗體及超聲情況比較 例(%)

2.3 腸道菌群分析結(jié)果

2.3.1 腸道菌群測(cè)序結(jié)果及OTU聚類分析:本研究共納入31個(gè)樣本,共得到4 238 310個(gè)原始序列;將原始序列進(jìn)行拼接及過濾后,共得到1 437 030個(gè)序列。使用 USEARCH[8]將序列相似度>97%的序列聚類為1個(gè)OTU,OTU 聚類時(shí)將稀有序列棄去,最終共聚類為16 941個(gè)OTU,以O(shè)TU為基礎(chǔ)進(jìn)行多樣性分析。由于每組均有多個(gè)樣本,若檢測(cè)到某個(gè)OTU樣本數(shù)達(dá)到該組樣本數(shù)量的50%以上,認(rèn)為這組含有這個(gè)OUT。B組腸道菌群樣品平均OTU;A組腸道菌群OTU(622.5±176.8)個(gè)相較于B組(544.2±194.4)個(gè)及C組(484.8±243.3)個(gè)更多,但OTU數(shù)目總體數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.324)。此外,分析3組共有和特有的OTU發(fā)現(xiàn),3組共有的OTU有120個(gè),A組、B組、C組特有的OTU分別為123個(gè)、75個(gè)、15個(gè)。 見表3。

表3 3組OTU數(shù)量比較 個(gè),

2.3.2 Alpha多樣性比較:檢測(cè)3組樣本覆蓋率均>0.99,表明樣本中序列被檢出的概率均很高。A組菌群的豐富度及均勻度較B組和C組更高,而C組的菌群多樣性較B組更低,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 3組受試者腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)

2.3.3 Beta多樣性比較:Beta多樣性反映的是不同樣本間的微生物群落構(gòu)成差異情況。本研究采用Unifrac生成群落間距離矩陣,計(jì)算不同樣本間的差異。UniFrac度量方法又分為weighted UniFrac和unweighted UniFrac,其中unweighted UniFrac只考慮 OTU 組成,不考慮其豐度;weighted UniFrac則需考慮其豐度。unweighted UniFrac的聚類熱圖分析,熱圖以顏色代表群落距離,距離越小(越紅)群落相似度越高,距離取值為[0, 1]。在不考慮OTU豐度的情況下,健康受試者的腸道菌群樣本間差異更小,而HT患者(不論是否伴有甲狀腺腫)樣本間差異相對(duì)更大,但3組間差異不明顯。weighted UniFrac的PCoA三維分析,坐標(biāo)軸為 PcoA 降維后產(chǎn)生的新變量,括號(hào)內(nèi)百分比為新變量的解釋量。在考慮OTU豐度的情況下,3組間樣本可呈現(xiàn)相互分離的趨勢(shì),且橋本伴甲狀腺腫組間不同樣本分布更離散,相似性更小。見圖1、2。

圖1 unweighted UniFrac距離熱圖;A 健康受試者;B 橋本伴甲狀腺腫者;C 橋本不伴甲狀腺腫者

圖2 weighted UniFrac的 PcoA三維圖;A 健康受試者;B 橋本伴甲狀腺腫者;C 橋本不伴甲狀腺腫者

2.3.4 物種分布及其豐度的比較:為探討3組腸道菌群的分布特征,尋找組間在科、屬水平的差異物種,行Kruskal-Wallis檢驗(yàn),找出差異顯著的菌科和菌屬。

2.3.4.1 在科水平上:B組患者的擬桿菌科(Bacteroidaceae)顯著低于A組和C組,而普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)及韋榮氏球菌科(Veillonellaceae)則顯著高于A組和C組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 3組腸道菌群科水平相對(duì)豐度水平(前10位) M(P25,P75)

2.3.4.2 在屬水平上:B組患者的擬桿菌屬(Bacteroides)顯著低于A組和C組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而B組的普氏菌屬(Prevotella)顯著高于A組和C組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外,HT患者的羅氏菌屬(Roseburia)和布勞特氏菌屬(Blautia)相對(duì)豐度較A組低,且B組較橋C組更低,但3組間Roseburia和Blautia比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表6。

表6 3組腸道菌群屬水平相對(duì)豐度水平(前10位) M(P25,P75)

3 討論

人體內(nèi)的腸道菌群種類豐富,數(shù)量龐大,其復(fù)雜性與多樣性是人類和微生物共同進(jìn)化的結(jié)果,對(duì)人體健康有許多直接或間接的影響。隨著近年來腸道菌群與甲狀腺疾病研究的深入,證據(jù)表明可能存在一個(gè)甲狀腺-腸軸使腸道菌群參與各種甲狀腺疾病的發(fā)生發(fā)展之中[10]。本研究發(fā)現(xiàn),從整體微生物群落構(gòu)成角度來看，健康受試者腸道菌群的豐富度及均勻度較HT受試者更高,且HT伴甲狀腺腫與HT不伴甲狀腺腫2組間也具有菌群分布差異,說明HT患者腸道菌群的改變與是否伴有甲狀腺腫有一定關(guān)系。此外,本研究從科、屬水平對(duì)3組間的菌群豐度進(jìn)行了非參數(shù)秩和檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn)HT伴甲狀腺腫組擬桿菌科及菌屬的豐度顯著低于其他2組,而普雷沃氏菌科、韋榮氏球菌科及普氏菌屬的豐度則顯著高于另外2組,說明這些菌科及菌屬可能是區(qū)別HT是否伴有甲狀腺腫的生物標(biāo)志物。但由于是否伴有甲狀腺腫是以臨床醫(yī)生查體作為判斷標(biāo)準(zhǔn),臨床查體手法的差異可能在區(qū)別無甲狀腺腫及Ⅰ度甲狀腺腫時(shí)存在一定誤差,可能對(duì)HT伴甲狀腺腫組和HT不伴甲狀腺腫組腸道菌群差異性分析造成一些影響。

HT分為甲狀腺腫型和萎縮型。有研究認(rèn)為,HT引起甲狀腺腫的原因可能與細(xì)胞及抗體介導(dǎo)的甲狀腺組織破壞、甲狀腺功能受損,反饋性刺激腺體分泌TSH,進(jìn)而刺激甲狀腺細(xì)胞腫大有關(guān),故甲狀腺體積大小在一定程度上可能也反映了甲狀腺局部免疫反應(yīng)的情況[11]。此外,HT患者甲狀腺體積/質(zhì)量大小與甲狀腺功能[12-13]、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)與局部水腫[14]、甲狀腺細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡關(guān)系的失衡[15]、血清TSH水平[16]和碘水平[17]等具有一定關(guān)系。腸道菌群對(duì)T細(xì)胞亞群介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)、碘的吸收、細(xì)胞凋亡等方面都具有影響。擬桿菌屬主要與免疫調(diào)節(jié)、碘吸收等方面相關(guān)。研究表明,脆弱擬桿菌的莢膜多糖可以刺激IL-10等免疫抑制因子的產(chǎn)生,并誘導(dǎo)激活其向Tregs轉(zhuǎn)化[18],而Th17 /Treg細(xì)胞失衡與HT的發(fā)生密切相關(guān);多形擬桿菌及其代謝產(chǎn)物也可通過減少與腸上皮細(xì)胞表面Toll樣受體結(jié)合,抑制NF-κB活性,下調(diào)IL-6、IL-1β、TNF-α等下游炎性因子的表達(dá),進(jìn)而抑制局部免疫反應(yīng)的發(fā)生[19]。此外,人體內(nèi)有一種Na+/多種維生素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,可以代表腸吸收碘的互補(bǔ)結(jié)構(gòu),若腸道菌群出現(xiàn)紊亂、腸黏膜屏障受損,則可能影響碘的吸收[20];而擬桿菌屬可以促進(jìn)短鏈脂肪酸的生成,進(jìn)而保護(hù)腸黏膜屏障[21],對(duì)碘的吸收產(chǎn)生影響。本研究中,HT伴甲狀腺腫患者擬桿菌屬水平明顯較其余2組降低,因此可能由于免疫調(diào)節(jié)或腸道黏膜屏障保護(hù)作用的減弱,造成甲狀腺局部免疫反應(yīng)增強(qiáng)及碘吸收減少,出現(xiàn)甲狀腺腫明顯的表現(xiàn)。同時(shí),韋榮氏球菌科與普氏菌屬則可能通過抑制細(xì)胞凋亡對(duì)HT及甲狀腺腫產(chǎn)生影響。HT患者的甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞具有細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,而一項(xiàng)針對(duì)HT患者甲狀腺體積和全基因組的關(guān)聯(lián)發(fā)現(xiàn),AATF和SMARCA2這兩個(gè)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因與HT患者的甲狀腺體積顯著相關(guān)[22]。Ebersole等[23]發(fā)現(xiàn),韋榮氏球菌科、普雷沃氏菌屬與抗細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白如AKT3、PI3KCG、CSF2RB、PIK3CD、CFLAR等呈正相關(guān)作用。也有研究顯示,進(jìn)行益生菌、藥物、灸法等干預(yù)前后,小鼠胰腺細(xì)胞[24]、肝細(xì)胞[25]和胃癌細(xì)胞[26]的凋亡情況與普雷沃氏菌的變化呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,間接說明了普雷沃氏菌與細(xì)胞凋亡之間可能存在的聯(lián)系。體外研究也表明,韋榮氏球菌科可能通過分泌GroEL蛋白激活CRC細(xì)胞的PI3K/AKT通路,從而抑制細(xì)胞凋亡[27]。本研究中,普雷沃氏菌、韋榮氏球菌在HT伴甲狀腺腫組豐度較高,可能與這兩種菌對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制性影響相關(guān)。

綜上綜述,HT伴甲狀腺腫患者的常見擬桿菌屬等的豐度較HT不伴甲狀腺腫者和健康受試者降低,而普雷沃氏菌科、韋榮氏球菌科及普氏菌屬等豐度則較高。考慮到年齡[28]、性別[29]等因素對(duì)腸道菌群會(huì)產(chǎn)生影響,因此本研究根據(jù)納入HT患者的基本情況對(duì)符合納排標(biāo)準(zhǔn)的健康受試者進(jìn)行匹配以減少偏倚。