苦碟子總黃酮基于PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)冠心病心絞痛大鼠血管內(nèi)皮功能的影響

曾靜 雷玉華 楊淑蓉 華曉芳 周慧 黃晶

冠心病也稱為“冠狀動(dòng)脈性心臟病”,該病的產(chǎn)生與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化緊密相關(guān),容易使機(jī)體冠脈血管腔內(nèi)出現(xiàn)阻塞、痙攣及狹窄,當(dāng)心肌缺血缺氧時(shí)常常會(huì)出現(xiàn)心絞痛,當(dāng)心肌壞死時(shí)則會(huì)進(jìn)展為心肌梗死,在>40歲的中老年人群中比較多見,尤其是處于腦力工作者占大多數(shù)且隨著國(guó)內(nèi)經(jīng)濟(jì)、社會(huì)逐漸發(fā)展,人民的生活質(zhì)量提升、飲食習(xí)慣轉(zhuǎn)變以及人口的老齡化情況,該病對(duì)人們身體健康造成嚴(yán)重危害的常見病,其死亡率及患病率呈不斷上升的趨勢(shì),且患病年齡逐步趨于年輕化[1-3]。而冠心病心絞痛屬于醫(yī)學(xué)“心痛”、“胸痹”的范疇內(nèi),在中醫(yī)上將癥狀特征常歸納為胸痛、胸悶窒息、喘息嚴(yán)重、悲痛徹心等[4-5]?？嗟涌傸S酮屬于中藥苦碟子內(nèi)所提取的有效成分,有研究發(fā)現(xiàn),苦碟子注射液在治療冠心病心絞痛中獲得了比較明顯的效果,但具體何種成分起到作用尚未清晰[6]。基于此,本文采用苦碟子總黃酮對(duì)冠心病心絞痛大鼠病癥予以干預(yù),效果顯著,其機(jī)制可能與PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān),報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取SPF級(jí)45只SD大鼠,體重17～25 g,平均(21.45±2.60)g,由深圳灣實(shí)驗(yàn)室提供,動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(粵)2022-0287,所有大鼠均在濕度40%～65%,溫度20～23℃的標(biāo)準(zhǔn)鼠籠里飼養(yǎng),光照24 h,明暗交替12 h,飼養(yǎng)過(guò)程中大鼠自主飲食。適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后進(jìn)行試驗(yàn)。本試驗(yàn)均嚴(yán)格按動(dòng)物實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作,且獲得醫(yī)院委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 藥品 苦碟子總黃酮由通化華夏藥業(yè)有限責(zé)任公司提供,純度≥90%,應(yīng)用時(shí)選取無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液配制相應(yīng)濃度的苦碟子總黃酮溶液,需注意現(xiàn)用現(xiàn)配,并儲(chǔ)存于干燥、密封避光的環(huán)境中。

1.3 方法

1.3.1 建模與分組:在適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后選取20只作為對(duì)照組,其余65只參照文獻(xiàn)[7]建立冠心病心絞痛模型,用自制的高脂飼料持續(xù)性喂養(yǎng)10周,高脂飼料為正常的飼料內(nèi)放入3%的膽固醇(TC)、0.5%的膽酸鈉、10%的蛋黃粉、10%的豬油、0.2%丙基硫氧嘧啶,35 g/d。對(duì)照組大鼠使用正常的飼料養(yǎng)育,35 g/d。后在大鼠尾靜脈抽血做樣本,采取動(dòng)物自動(dòng)生化分析儀(廠家:山東博科科學(xué)儀器有限公司,型號(hào):BK-200VET型)測(cè)定大鼠總膽固醇(TC)、三酯甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)表達(dá)予以證實(shí)模型建立成功,共60只大鼠建模成功,將建模成功的60只大鼠隨機(jī)分為模型組、苦碟子總黃酮低劑量組、苦碟子總黃酮高劑量組3組,每組20只。

1.3.2 給藥干預(yù):建模完成后,開始進(jìn)行給藥。對(duì)照組、模型組予以注射用水(4 mL)進(jìn)行灌服,苦碟子總黃酮低劑量組給予注射用水+1.0 mg/mL苦碟子總黃酮進(jìn)行灌胃,苦碟子總黃酮高劑量組給予注射用水+2.0 mg/mL苦碟子總黃酮進(jìn)行灌胃。1次/d,連續(xù)飼養(yǎng)10周,觀察大鼠情況。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 樣本采集:收集大鼠心臟中5 mL的血液樣本,以離心半徑6 cm、轉(zhuǎn)速2 500 r/min,離心處理15 min,提取上層血清,-65℃低溫環(huán)境存儲(chǔ)備檢。在大鼠腹部注入戊巴比妥后斷頸處死,取其心臟,收集周圍結(jié)扎的心肌組織,制成樣本,于-75℃冰箱內(nèi)保存,備用。

1.4.2 病理組織學(xué)觀察:取大鼠心肌組織,放進(jìn)4%多聚甲醛溶液內(nèi)予以固定,并使用梯度乙醇脫水,埋于石蠟內(nèi),制作切片,厚度為3 μm,后制作成玻片標(biāo)本,放入蘇木精于室溫狀態(tài)下培養(yǎng)10～15 min,滴加0.5%的曙紅溶液在室溫狀態(tài)下培養(yǎng)3～5 min,應(yīng)用HE染色試劑盒進(jìn)行染色,于光鏡下觀察病理組織的形態(tài)學(xué)變化。

1.4.3 血管內(nèi)皮功能、心肌酶、炎性因子指標(biāo)表達(dá)檢測(cè):采用ELISA法檢測(cè)一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素-1(ET-1)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LD)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)水平,首先經(jīng)包被液將蛋白稀釋至最佳含量,保持5℃過(guò)夜后,待檢,后經(jīng)反復(fù)沖洗、稀釋,洗3～5次,4 min/次,上述步驟反復(fù)試驗(yàn)3～5次,后放入終止制劑發(fā)生反應(yīng),使用酶標(biāo)儀(廠家:山東三體儀器有限公司,型號(hào):ST-MB96S)測(cè)量460 mm處的吸光值,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的曲線觀察并計(jì)算4組大鼠NO、ET-1、CK-MB、LD、TNF-α、IL-6表達(dá)水平,試劑盒分別由優(yōu)利科(上海)生命科學(xué)有限公司、博輝生物科技(廣州)有限公司、艾美捷科技有限公司、北京伊塔生物科技有限公司提供,貨號(hào)分別為YLK-EDS001、EK-R37841、GBS-IT7209、SY6352、GBS-IT7716、GBS-IT6570進(jìn)行檢測(cè)。其檢測(cè)步驟均由專業(yè)醫(yī)師按說(shuō)明書操作進(jìn)行。

1.4.4 PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白相對(duì)表達(dá)量檢測(cè):采用免疫印跡法測(cè)定4組大鼠心肌組織中PI3K、Akt水平表達(dá),取4組大鼠心肌組織,冰上溶解約15 min后,以100 mg∶1 mL的比例置于相應(yīng)體積的蛋白清液內(nèi)進(jìn)行裂解反應(yīng),于5℃靜置3～5 min后,將4組樣本放入勻漿機(jī)中使其均勻的研磨加以萃取總蛋白,應(yīng)用BCA法對(duì)蛋白液體含量進(jìn)行測(cè)定,試劑盒由(天根生化科技(北京)有限公司,貨號(hào):PA115-01)提供,計(jì)算樣本數(shù)據(jù),后取含量為45 μg的總蛋白樣本用凝膠(10%)行電泳分離(75～125V,90～100 min),后在100 mV的穩(wěn)定電壓下和PVDF膜行濕轉(zhuǎn)移,加入牛血清白蛋白(5%)在室溫狀態(tài)下培養(yǎng)1 h,后將以1∶500比例稀釋的PI3K、Akt放進(jìn)分離后的蛋白質(zhì)內(nèi),于5℃下培養(yǎng)過(guò)夜后,接著在沖洗后于室溫環(huán)境下滴入二抗培養(yǎng)1 h,放于顯示儀下,加入化學(xué)發(fā)光制劑,進(jìn)行1～2 min顯影后操作,獲取數(shù)值,重復(fù)試驗(yàn)3次。內(nèi)參為β-actin。應(yīng)用Image J軟件分析4組SPF級(jí)大鼠相對(duì)應(yīng)的條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 病理組織學(xué)觀察 對(duì)4組大鼠心肌組織切片染色用光鏡觀察,對(duì)照組的心肌細(xì)胞形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)較為完整、細(xì)胞核均勻染色,心肌纖維整齊排列,無(wú)顯著變化;模型組細(xì)胞核縮小或消失,心肌細(xì)胞發(fā)生變性,部分心肌纖維出現(xiàn)斷離,散亂排列心肌間質(zhì)中存在較多的炎性細(xì)胞入侵,伴有水腫、充血情況;苦碟子總黃酮低、高劑量組相較于模型組,心肌纖維排列、心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)有所改善,充血、炎癥及水腫情況明顯緩輕。見圖1。

對(duì)照組 模型組 苦碟子總黃酮低劑量組 苦碟子總黃酮高劑量組

2.2 4組大鼠血管內(nèi)皮功能表達(dá)比較 與對(duì)照組比較,模型組、苦碟子總黃酮低劑量組的ET-1表達(dá)升高,NO表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,苦碟子總黃酮低、高劑量組的ET-1表達(dá)降低,NO表達(dá)上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與苦碟子總黃酮低劑量組比較,苦碟子總黃酮高劑量組的ET-1表達(dá)下降,NO表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠血管內(nèi)皮功能表達(dá)比較 n=20,

2.3 4組大鼠心肌酶水平表達(dá)變化比較 與對(duì)照組比較,模型組、苦碟子總黃酮低劑量組的CK-MB、LD表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,苦碟子總黃酮低、高劑量組的CK-MB、LD表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與苦碟子總黃酮低劑量組對(duì)比,苦碟子總黃酮高劑量組的CK-MB、LD表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠心肌酶水平表達(dá)變化比較 n=20,U/L,

2.4 4組大鼠炎性因子水平表達(dá)變化比較 與對(duì)照組比較,模型組、苦碟子總黃酮低、高劑量組的TNF-α、IL-6表達(dá)上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,苦碟子總黃酮低、高劑量組的TNF-α、IL-6表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與苦碟子總黃酮低劑量組比較,苦碟子總黃酮高劑量組的TNF-α、IL-6表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 4組大鼠血清炎性因子表達(dá)變化比較 n=20,pg/mL,

2.5 4組大鼠PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白相對(duì)表達(dá)量 與對(duì)照組比較,模型組、苦碟子總黃酮低、高劑量組PI3K、AKT表達(dá)均有所下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,苦碟子總黃酮低、高劑量組的PI3K、AKT表達(dá)均有所升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與苦碟子總黃酮低劑量組比較,苦碟子總黃酮高劑量組PI3K、AKT表達(dá)均有所升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4,圖2。

表4 4組大鼠PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白相對(duì)表達(dá)量 n=20,

圖2 PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白Western blot圖;A 對(duì)照組;B 模型組;C 苦碟子總黃酮低劑量組;D 苦碟子總黃酮高劑量組

3 討論

出現(xiàn)在冠狀動(dòng)脈中的栓塞、創(chuàng)傷、結(jié)締性組織疾病、先天性畸形及炎癥等均會(huì)使心肌缺氧、缺血,上述癥狀廣義而言均屬冠心病范圍。世界衛(wèi)生組織對(duì)冠心病常分為五大類別,包括心絞痛、無(wú)病灶心肌缺血、心肌梗死、猝死及缺血性心臟病[8-10]。中西醫(yī)診治冠心病心絞痛主要包含以下內(nèi)容:調(diào)整飲食習(xí)慣;少鹽清淡;對(duì)高血糖、高血壓及高血脂等癥狀給予有效的抑制;實(shí)施針灸或藥物的診療;重建血管進(jìn)行治療等方面[11-12]。

苦碟子總黃酮屬于中藥苦碟子內(nèi)的黃酮類化合物,其有抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激等作用,可用于治療心腦血管系統(tǒng)病癥,且通過(guò)苦碟子注射液還可通過(guò)改善循環(huán)、血管擴(kuò)張等途徑起到“化瘀活血”的效果,可有效改善心臟功能、緩解心臟血氧供應(yīng)?？嗟幼⑸湟耗芴嵘委煿谛牟⌒慕g痛的效果,但其除黃酮類化合物外,還包括腺苷等成分,而有關(guān)苦碟子總黃酮對(duì)冠心病作用的研究相對(duì)偏少[13]。ET-1、NO通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生有較強(qiáng)拮抗作用的活性物質(zhì),為反映血管內(nèi)皮功能的主要指標(biāo),二者比例紊亂可加重冠心病病癥的進(jìn)展;且ET-1可造成冠狀動(dòng)脈痙攣加劇,有導(dǎo)致心律失常、細(xì)菌細(xì)胞毒性作用;NO是一種血管舒張的重要因子,是通過(guò)分子氧及L-精氨酸在NO合成酶的刺激下產(chǎn)生[14]。CK-MB、LD均屬于心肌損傷有關(guān)的酶學(xué)指標(biāo),CK-MB主要分布在骨骼、心肌及平滑肌等組織細(xì)胞中,為評(píng)估心肌損傷程度的重要指標(biāo),可作為檢測(cè)冠心病的一種酶;LD為一類糖酵解酶,存在于所有組織細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中,心肌細(xì)胞內(nèi)的活性相較于血清明顯升高,心肌細(xì)胞受損時(shí)可釋放至血液中,致使血液中水平上升,可作為評(píng)估心肌受損主要的非特異性指標(biāo)[15]。IL-6、TNF-α是炎性反應(yīng)加重、啟動(dòng)因子,與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生及斑塊的穩(wěn)定性密切相關(guān),促進(jìn)血管壁中炎性反應(yīng),促使動(dòng)脈粥樣硬化產(chǎn)生,加速冠心病發(fā)展[16]。本研究發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,模型組、苦碟子總黃酮低劑量組的ET-1、CK-MB、LD、TNF-α、IL-6表達(dá)升高,NO、PI3K、AKT表達(dá)降低(P<0.05);與模型組比較,苦碟子總黃酮低、高劑量組的ET-1、CK-MB、LD、TNF-α、IL-6表達(dá)降低,NO、PI3K、AKT表達(dá)上升(P<0.05),與有關(guān)學(xué)者[17]研究較相似。表明苦碟子總黃酮在冠心病心絞痛大鼠治療中可以有效調(diào)節(jié)機(jī)體中血管內(nèi)皮功能,改善心肌酶水平,降低炎性反應(yīng),為臨床治療提供了有利參考。

PI3K屬于一類細(xì)胞中具有特異性催化磷脂酰肌醇的重要激酶,PI3K/AKT信號(hào)通路平衡失調(diào)常見于多項(xiàng)人類病癥中,包含心血管病癥、癌癥、神經(jīng)性病癥及糖尿病[18]。AKT屬于一種在細(xì)胞中存活的主要調(diào)節(jié)性因子,可通過(guò)直接抑制蛋白凋亡或減緩轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生促使凋亡得以有效調(diào)節(jié)[19]。本研究發(fā)現(xiàn),在冠心病心絞痛大鼠機(jī)體中PI3K、AKT表達(dá)降低,通過(guò)苦碟子總黃酮對(duì)其進(jìn)行干預(yù),可使PI3K、AKT表達(dá)顯著上升,由此證實(shí)其作用機(jī)制與PI3K/AKT信號(hào)通路有一定關(guān)系。研究顯示,藥物在病情治療中,可通過(guò)對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路進(jìn)行激活,有效降低TNF-α、IL-6表達(dá),從而發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用,調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的病變程度,調(diào)節(jié)ET-1、NO表達(dá),以改善血管內(nèi)皮功能,最終起到治療冠心病心絞痛的作用[20-21],與本研究結(jié)果相似。表明通過(guò)苦碟子總黃酮對(duì)PI3K/AKT表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,能有效降低冠心病心絞痛大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng),改善血管內(nèi)皮功能,提升心肌細(xì)胞血供,減緩炎性反應(yīng),降低心肌細(xì)胞受損程度,促使病癥改善。

綜上所述,苦碟子總黃酮可通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路降低炎性反應(yīng),進(jìn)而改善機(jī)體血管內(nèi)皮功能及減緩心肌組織損傷,對(duì)冠心病心絞痛大鼠起到有效緩解的作用。