胡黃連苷Ⅱ調(diào)節(jié)cAMP/PKA信號軸對脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響

范雁東 王佳明 馬木提江·木爾提扎 羅坤

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是指交通事故、戰(zhàn)時、自然災(zāi)害等造成的脊柱骨折,合并脊髓和神經(jīng)根損傷,是一種破壞性的神經(jīng)和病理狀態(tài),可導(dǎo)致主要的運(yùn)動、感覺和自主神經(jīng)功能障礙[1]。全球范圍內(nèi)SCI的發(fā)病率為10.4～83.0例/百萬/年,是社會發(fā)病負(fù)擔(dān)的重要來源。對于急性SCI的管理策略包括早期手術(shù)減壓和固定、使用血管加壓藥物增加平均動脈血壓、使用皮質(zhì)類固醇等,最近使用去甲腎上腺素作為神經(jīng)重癥監(jiān)護(hù)策略,但對神經(jīng)保護(hù)和再生的作用有限[2],因此,需要探索新型治療制劑。有研究發(fā)現(xiàn),胡黃連苷Ⅱ(picroside Ⅱ,PⅡ)是從胡黃連提取的環(huán)烯醚萜類化合物,具有抗氧化、抗炎、抗凋亡活性,能夠抑制脊髓反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥,減輕慢性縮窄性損傷誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)性疼痛[3],但對SCI神經(jīng)功能的研究較少。此外,激活環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)-蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)信號可以改善SCI后炎癥[4],PⅡ是否能通過調(diào)節(jié)cAMP/PKA通路改善SCI神經(jīng)功能尚不清楚,因此,本研究借助SCI大鼠模型,探究PⅡ?qū)ζ渖窠?jīng)功能的影響及相關(guān)cAMP/PKA通路的調(diào)節(jié)作用,以期為臨床治療提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SD雄性大鼠(220～240 g),購自河南省實(shí)驗(yàn)動物中心[SCXK(豫)-2022-0001]。飼養(yǎng)環(huán)境為12 h/12 h光暗循環(huán),溫度(25±1)℃,濕度(50±5)%,實(shí)驗(yàn)操作遵守相關(guān)規(guī)定。

1.2 試劑 PⅡ(純度≥98%,G0174),購自美國Merck公司;PKA抑制劑H-89(HY-15979),購自美國MCE公司;勞克堅(jiān)牢藍(lán)(LuxolFastBlue, LFB)染液,購自南京信帆生物技術(shù)有限公司;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、cAMP ELISA試劑盒,購自北京四正柏有限公司;一抗磷酸化(p)-PKA、PKA、p-環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)成分結(jié)合蛋白(CREB)、CREB,購自美國Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 造模與分組:①造模:大鼠吸入乙醚至完全麻醉后,俯位固定,背部剃毛并消毒,計數(shù)肋骨以確定(第10胸椎)T10水平,以T10水平為中心作3 cm長縱向切口,剝離椎旁肌,去除棘突和椎板,暴露(第9胸椎)T9～T10節(jié)段脊髓;在3 cm高度使10 g NYU打擊器自由下落擊打T9～T10節(jié)段脊髓,隨后脊髓充血、水腫,大鼠后肢和尾部抽搐,表示SCI大鼠模型建立成功[5]。為預(yù)防感染,建模大鼠傷口縫合后連續(xù)3 d皮下注射105U·kg-1·d-1青霉素G。②分組:大鼠適應(yīng)1周,將其分為正常組(CT組)、SCI模型組(SCI組)、PⅡ低劑量組(PⅡ L組)、PⅡ高劑量組(PⅡ H組)和PⅡ高劑量組+H-89組(PⅡ H+H-89組),每組18只。除CT組外的所有大鼠按上述方法建立SCI模型并注射青霉素G,CT組大鼠僅暴露T9～T10節(jié)段脊髓不損傷脊髓;PⅡ溶于1×PBS獲得2 mg/mL PⅡ溶液,PⅡ L組、PⅡ H組分別腹腔注射5 mg·kg-1·d-1、20 mg·kg-1·d-1PⅡ[3];PⅡ H+H-89組腹腔注射20 mg·kg-1·d-1PⅡ+5 mg·kg-1·d-1H-89[6];CT組和SCI組大鼠腹腔注射適量0.9%氯化鈉溶液,給藥時間從造模后第3天開始持續(xù)2周。

1.3.2 運(yùn)動功能評分:使用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)評分評價大鼠的運(yùn)動功能恢復(fù)情況[7]。觀察大鼠行走時臀、膝、踝關(guān)節(jié)及軀干運(yùn)動及協(xié)調(diào)情況,以0～21分做等級評估,0代表完全不能運(yùn)動,21代表正常運(yùn)動,每增加1分代表運(yùn)動功能逐漸恢復(fù),分別在給藥期0、7、14 d做BBB評分。

1.3.3 脊髓組織病理學(xué)特征檢測:給藥結(jié)束后每組選取6只大鼠,吸入乙醚麻醉,打開大鼠胸腔暴露心臟,剪開右心耳,在心尖處注入4℃ PBS至內(nèi)臟變白,將PBS換成4%多聚甲醛,注射至組織變硬,分離脊柱,去除肌肉及椎骨,以損傷部位為中心取1 cm長的脊髓組織,固定于4%多聚甲醛中12 h,脫水,石蠟包埋并做橫向切片,HE染液染色,二甲苯做透明處理,封片,使用低、高倍顯微鏡觀察組織病理學(xué)特征。

1.3.4 脫髓鞘情況檢測:取1.3.3脊髓組織石蠟切片行LFB染色。切片用蒸餾水清洗,加入0.1%LFB溶液60℃下密封浸染8 h;蒸餾水清洗,加入95%乙醇分色;0.05%碳酸鋰水溶液分色10 s;再加入70%乙醇繼續(xù)分色,直至顯微鏡下觀察灰、白質(zhì)區(qū)分清晰為止;滴加0.25%焦油紫與冰醋酸染液復(fù)染10 min,再次使用70%乙醇將復(fù)染顏色分至細(xì)胞核及尼氏體呈紅色;使用濾紙沾盡多余液體,加入正丁醇脫水2次,每次脫水5 min;二甲苯透明,封片,顯微鏡下觀察,髓鞘呈鮮藍(lán)色,核呈深藍(lán)色,統(tǒng)計LFB陽性組織比例。

1.3.5 星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞活化增生情況檢測:每組選擇6只大鼠,麻醉,打開胸腔,使用鈍器分離出損傷部位處1 cm長的脊髓組織,PBS清洗,立即放入4%多聚甲醛過夜,乙醇梯度脫水,包埋劑包埋,切制5 μm切片。將切片置于抗原修復(fù)液內(nèi)煮沸3次修復(fù)抗原,冷卻,使用胎牛血清封閉30 min,膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、離子鈣結(jié)合適配器分子-1(IBA-1)一抗稀釋液封閉過夜,FITC標(biāo)記二抗稀釋液孵育1 h,DAPI染液孵育5 min,清洗切片,封片,熒光顯微鏡下觀察視野下GFAP、IBA-1陽性細(xì)胞。

1.3.6 MDA、SOD、cAMP含量檢測:將每組剩余6只大鼠麻醉,取損傷處脊髓組織,剪碎、勻漿,一半勻漿液-80℃儲存,剩余勻漿液離心取上清,根據(jù)ELISA試劑盒操作要求檢測MDA、SOD、cAMP含量。

1.3.7 p-PKA、PKA、p-CREB、CREB蛋白表達(dá)檢測:取1.3.6勻漿液,定量蛋白濃度,配制PAGE凝膠,點(diǎn)樣,電泳、轉(zhuǎn)膜后,封閉含樣品PVDF膜,置于p-PKA、PKA、p-CREB、CREB稀釋液中過夜,二抗孵育2 h,加入發(fā)光液, Tanon 1600拍照,分析蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 5組大鼠BBB評分比較 給藥0.7、14 d,與CT組比較,SCI組大鼠BBB評分降低(P<0.05);給藥7.14 d與SCI組比較,PⅡ L組、PⅡ H組BBB評分劑量依賴性升高(P<0.05);與PⅡ H組比較,PⅡ H+H-89組BBB評分降低(P<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠BBB評分比較 n=18,分,

2.2 5組大鼠脊髓組織病理學(xué)特征

2.2.1 低倍鏡:CT組大鼠組織完整;SCI組大鼠組織缺損較嚴(yán)重,空腔多見;與SCI組大鼠比較,PⅡ L組、PⅡ H組大鼠的組織損傷情況有所改善,空腔減少;PⅡ H+H-89組大鼠組織缺損,與SCI組大鼠情況類似。見圖1。

圖1 5組大鼠脊髓組織HE染色情況(×100)

2.2.2 高倍鏡:CT組組織及細(xì)胞生長狀態(tài)良好;SCI組損傷局部出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤;與SCI組比較,PⅡ L組、PⅡ H組炎性細(xì)胞數(shù)量減少;與PⅡ H組比較,PⅡ H+H-89組炎性細(xì)胞浸潤增加。見圖2。

圖2 5組大鼠脊髓組織HE染色情況(×400)

2.3 5組大鼠脊髓組織脫髓鞘比較

2.3.1 LFB染色結(jié)果:與CT組比較,SCI組大鼠脫髓鞘增加,LFB染色陽性比例顯著減少(P<0.05);與SCI組比較,PⅡ L組、PⅡ H組脫髓鞘呈劑量依賴性降低,LFB染色陽性比例顯著增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與PⅡ H組比較,PⅡ H+H-89組脫髓鞘增加,LFB染色陽性比例顯著減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 5組大鼠脊髓組織LFB染色陽性比較 n=6,%,

2.3.2 高倍鏡:CT組髓鞘排列緊密、完整;SCI組可見大量髓鞘空泡,呈嚴(yán)重的脫髓鞘現(xiàn)象;PⅡ L組、PⅡ H組較SCI組空泡顯著減少,排列更加緊密;PⅡ H+H-89組呈現(xiàn)脫髓鞘現(xiàn)象。見圖3、4。

圖3 5組大鼠脊髓組織LFB染色(×100)

圖4 5組大鼠脊髓組織LFB染色(×400)

2.4 5組大鼠脊髓組織星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞活化增生比較 與CT組比較,SCI組大鼠的脊髓組織GFAP陽性細(xì)胞數(shù)、IBA-1陽性細(xì)胞數(shù)增加,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與SCI組比較,PⅡ L組、PⅡ H組GFAP陽性細(xì)胞數(shù)、IBA-1陽性細(xì)胞數(shù)呈劑量依賴性降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與PⅡ H組比較,PⅡ H+H-89組GFAP陽性細(xì)胞數(shù)、IBA-1陽性細(xì)胞數(shù)增加,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3,圖5、6。

圖5 5組大鼠脊髓組織星形膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光染色(×200)

圖6 5組大鼠脊髓組織小膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光染色(×200)

表3 5組大鼠脊髓組織GFAP、IBA-1陽性細(xì)胞數(shù)比較 n=6,個,

2.5 5組大鼠脊髓組織MDA、SOD、cAMP含量比較 與CT組比較,SCI組MDA含量增加,SOD、cAMP含量降低(P<0.05);與SCI組比較,PⅡ L組、PⅡ H組MDA含量減少,SOD、cAMP含量增加,且呈劑量依賴性(P<0.05);與PⅡ H組比較,PⅡ H+H-89組MDA含量增加,SOD、cAMP含量降低(P<0.05)。見表4。

表4 5組大鼠脊髓組織MDA、SOD、cAMP含量比較 n=6,

2.6 5組大鼠脊髓組織p-PKA、PKA、p-CREB、CREB蛋白表達(dá)水平比較 與CT組比較,SCI組p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05);與SCI組比較,PⅡ L組、PⅡ H組p-PKA/PKA、p-CREB/ CREB蛋白表達(dá)水平呈劑量依賴性增加(P<0.05);與PⅡ H組比較,PⅡ H+H-89組p-PKA/PKA、p-CREB/

CREB蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。見圖7,表5。

圖7 5組大鼠脊髓組織蛋白表達(dá)水平;A CT組;B SCI組;C PⅡ L組;D PⅡ H組;E PⅡ H+H-89組

表5 5組大鼠脊髓組織蛋白表達(dá)水平比較 n=6,

3 討論

SCI是一種危及生命的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,男性發(fā)病率更高,除了造成醫(yī)療相關(guān)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)外,尤其對截肢、癱瘓患者腸道、性功能、心理障礙的影響也是毀滅性的[8],因此,亟須開發(fā)治療SCI的新策略。PⅡ基于其抗炎、抗氧化、抗凋亡特性,已經(jīng)被用于預(yù)防和治療器質(zhì)性缺血/再灌注損傷、炎癥、肝損傷、癌癥轉(zhuǎn)移及血管生成[9]。本研究主要探究PⅡ?qū)CI大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。

SCI分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷,原發(fā)性損傷由機(jī)械損傷、牽引力、擠壓等引起脊髓通道血腫、缺血性梗死等;繼發(fā)性損傷指在SCI數(shù)小時或數(shù)天后,由于缺血灌注受損導(dǎo)致的出血、脫髓鞘、水腫和空腔形成,并伴有軸突和神經(jīng)元壞死及神經(jīng)組織的一系列病理變化,進(jìn)一步增加梗死[10]。本研究中,SCI模型大鼠BBB評分降低,受損脊髓組織缺損嚴(yán)重,空腔多,出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤且髓鞘減少,說明模型構(gòu)建成功;PⅡ干預(yù)可以升高SCI模型大鼠BBB評分和髓鞘數(shù)量,組織損傷情況有所改善,空腔及炎性細(xì)胞浸潤減少,說明PⅡ可以幫助SCI大鼠恢復(fù)運(yùn)動功能,減少損傷、炎性反應(yīng)及脫髓鞘。

SCI繼發(fā)性損傷后,神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與外周免疫細(xì)胞一同對具有異質(zhì)修復(fù)和病理特性的損傷產(chǎn)生強(qiáng)烈的炎性反應(yīng),并成為SCI治療修飾的目標(biāo)[11]。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,對中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理學(xué)至關(guān)重要,并在維持穩(wěn)態(tài)、突觸可塑性發(fā)展和神經(jīng)保護(hù)方面發(fā)揮重要作用,星形膠質(zhì)細(xì)胞在SCI、慢性疼痛、退行性疾病、神經(jīng)腫瘤及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病中通過反應(yīng)性增生發(fā)揮不利影響[12]。SCI引起的免疫反應(yīng)由背角和腹角的小膠質(zhì)細(xì)胞激活主導(dǎo),揭示小膠質(zhì)細(xì)胞激活/增生與運(yùn)動功能神經(jīng)元和感覺傳入神經(jīng)受損有關(guān)[13]。GFAP和IBA-1分別是星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物,研究發(fā)現(xiàn)SCI大鼠受損周圍脊髓組織GFAP和IBA-1表達(dá)升高,代表星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化增生,從而加劇繼發(fā)性損傷[5,14]。本研究與之一致,SCI大鼠受損脊髓組織GFAP和IBA-1表達(dá)增加,這種異常變化可以被PⅡ抑制,提示PⅡ可有效抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的增生,為突觸再生創(chuàng)造有益條件,減少神經(jīng)炎性反應(yīng)。

cAMP是維持細(xì)胞代謝和生理功能的重要物質(zhì),在G蛋白結(jié)合-耦聯(lián)受體聯(lián)合作用下激活腺苷酸環(huán)化酶(ACs),促進(jìn)釋放[15]。PKA是cAMP的主要靶點(diǎn),cAMP可以結(jié)合PKA并誘導(dǎo)PKA磷酸化,繼而促進(jìn)CREB磷酸化并啟動轉(zhuǎn)錄,形成cAMP/PKA/CREB信號通路控制細(xì)胞生長過程[16]。激活cAMP/PKA/CREB信號可以抑制神經(jīng)元凋亡,改善神經(jīng)細(xì)胞營養(yǎng)和能量不足,緩解SCI[17]。本研究提示,SCI大鼠脊髓組織cAMP、p-PKA/PKA、p-CREB/CREB表達(dá)減少,說明cAMP/PKA信號軸抑制;PⅡ干預(yù)可以增加SCI大鼠cAMP、p-PKA/PKA、p-CREB/CREB的表達(dá),其對神經(jīng)功能的恢復(fù)作用可能與上調(diào)cAMP/PKA信號軸有關(guān)。使用cAMP/PKA抑制劑H-89聯(lián)合PⅡ干預(yù)SCI大鼠,其完全逆轉(zhuǎn)PⅡ的治療作用,驗(yàn)證了PⅡ?qū)CI大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)作用與激活cAMP/PKA信號通路有關(guān)。此外,我們還檢測了脊髓組織MDA、SOD的含量。MDA和SOD是氧化應(yīng)激反應(yīng)中的重要成員,MDA是自由基與脂質(zhì)作用發(fā)生過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物,具有細(xì)胞毒性,促進(jìn)細(xì)胞衰老;SOD能夠抵消氧自由基對細(xì)胞的損傷,修復(fù)受損細(xì)胞[18-19]。研究發(fā)現(xiàn),通過減少氧化應(yīng)激反應(yīng)可以減少細(xì)胞凋亡,改善SCI大鼠的運(yùn)動功能[20]。本研究中,PⅡ逆轉(zhuǎn)了SCI大鼠脊髓組織MDA含量增加、SOD含量降低,提高BBB評分,可能也是PⅡ在SCI中的另一個作用機(jī)制。

綜上所述,PⅡ可能通過激活cAMP/PKA信號軸促進(jìn)SCI大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。