地紅方通過miR-133b/DUSP1/JNK通路干預(yù)糖尿病腎病氧化應(yīng)激損傷

林姿 何衛(wèi)東 杜思哲

*基金項(xiàng)目：福建省自然科學(xué)基金（2021J01896）；福建省衛(wèi)生健康青年科研課題（2021QNA054）

第一作者簡介：林姿（1987-），女，主治醫(yī)師，研究方向：糖尿病及其并發(fā)癥中醫(yī)藥防治。

摘要：目的? 研究地紅方對糖尿病腎病細(xì)胞模型氧化應(yīng)激損傷的影響。方法? 地紅方含藥血清制備，小鼠腎小球系膜細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)、傳代。按以下分組：對照組（5.5mmol/L葡萄糖+正常血清）、高糖組（30mmol/L葡萄糖+正常血清）、地紅方低劑量組（30mmol/L葡萄糖+5%地紅方含藥血清）、地紅方中劑量組（30mmol/L葡萄糖+10%地紅方含藥血清）、地紅方高劑量組（30mmol/L葡萄糖+20%地紅方含藥血清）。采用實(shí)時熒光定量PCR檢測miR-133b、DUSP1 mRNA表達(dá)。Western blotting檢測DUSP1、p-JNK、Drp1、Fis1蛋白表達(dá)。Elisa檢測SOD、MDA表達(dá)。結(jié)果? 與高糖組比較，地紅方組miR-133b、MDA、p-JNK、Drp1、Fis1表達(dá)明顯下降（P<0.05），而DUSP1、SOD表達(dá)顯著升高（P<0.05）。結(jié)論? 地紅方可通過miR-133b/DUSP1/JNK通路調(diào)控線粒體分裂改善糖尿病腎病氧化應(yīng)激損傷。

關(guān)鍵詞：地紅方；糖尿病腎病；miR-133b；DUSP1；JNK；氧化應(yīng)激

中圖分類號：R587.1??? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A??? 文章編號：1007-2349（2024）05-0080-05

Study on the Intervention of Didong Decoction on Oxidative Stress Injuryof Diabetic Nephropathy through miR-133b/DUSP1/JNK Pathway

LIN Zi， HE Wei-dong， DU Si-zhe

（The Peoples Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350004， China）

【Abstract】Objective： To study the effect of Dihong Decoction on oxidative stress injury of diabetic nephropathy cell model. Methods： The serum containing Dihong Decoction was prepared， and mouse mesangial cells were cultured and passed through routine. Groups were divided as follows， control group （5.5mmol/L glucose+normal serum）， high glucose group （30mmol/L glucose+normal serum）， low dose Dihong Decoction group （30mmol/L glucose+5% Dihong Decoction containing serum）， medium dose Dihong Decoction group （30mmol/L glucose+10% Dihong Decoction containing serum）， and high dose Dihong Decoction group （30mm ol/L glucose +20% Dihong Decoction containing serum）. Real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect the mRNA expression of miR-133b and DUSP1. Western blotting to detect the expression of DUSP1， p-JNK， Drp1 and Fis1 proteins. The expressions of SOD and MDA were detected by Elisa. Results： Compared with that of the high glucose group， the expressions of miR-133b， MDA， P-JNK， Drp1 and Fis1 in Dihong Decoction groups were significantly decreased （P<0.05）， while the expressions of DUSP1 and SOD were significantly increased （P<0.05）. Conclusion： Dihong Decoction can regulate mitochondrial division through miR-133b/DUSP1/JNK pathway to improve oxidative stress injury in diabetic nephropathy.

【Key words】Dihong Decoction; Diabetic Nephropathy; miR-133b; DUSP1; JNK; Oxidative Stress

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是由糖尿病（diabetes mellitus，DM）所致的慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD），已成為 CKD 和終末期腎病的主要病因，增加了 DM 的死亡率［1-2］，因此及時防治對于延緩 DN具有極其重大意義。地紅方（滋陰活血調(diào)糖飲）是我院多年來用于防治 DN 驗(yàn)方，臨床效果顯著。地紅方由六味地黃湯、桃紅四物湯化裁而來，滋陰活血之力強(qiáng)，可作為 DN 滋陰活血的代表方。我們團(tuán)隊(duì)在前期臨床研究中表明地紅方可改善DM患者氧化應(yīng)激指標(biāo)及炎癥因子［3］，發(fā)現(xiàn)地紅方能夠改善DM血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷［4］。在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究探討地紅方基于miR-133b/雙特異性磷酸酶1（dual specificity phosphatase 1，DUSP1）/c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）通路調(diào)控線粒體分裂改善DN氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制。

1? 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)動物? SPF 級雄性SD大鼠14只，體質(zhì)量（180±20）g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，分籠飼養(yǎng)。自由攝食進(jìn)水，使用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過程符合國家《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》。

1.2? 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞? 小鼠腎小球系膜細(xì)胞（SV40 MES 13）購自武漢普諾賽，37℃水浴中進(jìn)行快速融化，加入含10 mL DMEM培養(yǎng)基中，900 rpm/min，離心5min，加入5 mL DMEM培養(yǎng)基吹打均勻，置入T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿80%融合時，進(jìn)行傳代處理，用0.25%胰酶消化2min，收集細(xì)胞放入15mL離心管中，1000 rpm/min，離心5min，按1∶3進(jìn)行傳代，細(xì)胞傳2代待用。

1.3? 實(shí)驗(yàn)藥物? 熟地黃24 g，山茱萸12 g，山藥10 g，澤瀉9 g，茯苓9 g，牡丹皮9 g，葛根20 g，天花粉15 g，桃仁6 g，紅花9 g，當(dāng)歸9 g，白芍9 g，川芎9 g，丹參9 g。配齊藥材，先以5倍量清潔自來水在5 min內(nèi)清洗兩次。加10倍量的蒸餾水浸泡半小時，以700瓦的火力加熱煎煮1 h，過濾取藥液；第二次加6倍量水，以同等火力加熱煎煮40 min，過濾。合并濾液，再以700瓦火力濃縮至每1mL藥液相當(dāng)于1 g生藥材的藥液（即1∶1藥液），無菌包裝，備實(shí)驗(yàn)使用。

1.4? 主要藥品與試劑? DUSP1抗體（武漢博士德生物工程有限公司，批號：A30451），磷酸化c-Jun氨基端激酶（p-JNK）抗體、線粒體動力相關(guān)蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1）抗體、線粒體分裂蛋白1（fission protein 1，F(xiàn)is1）抗體、GAPDH抗體（美國proteintech公司，批號：80024-1-RR、12957-1-AP、10956-1-AP、60004-1-Ig）。增強(qiáng)型RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、Western專用一抗二抗稀釋液、Western Blotting增強(qiáng)型蛋白印跡再生液（武漢博士德生物工程有限公司，批號：AR0102、AR0198、AR0138、AR1017、AR0196）。

1.5? 主要實(shí)驗(yàn)儀器? 漩渦混合器［VORTEX-6］（福州康和爾生物科技有限公司）；超凈工作臺Opticlean-1300（力康生物醫(yī)療公司）；冷凍離心機(jī)［JID-17R］（廣州吉迪儀器有限公司）；瓊脂糖水平電泳儀［DYCP-31DN］（北京六一生物科技有限公司）；漩渦混合器［VORTEX-6］（福州康和爾生物科技有限公司）；梯度PCR儀［MV-C155-ov71］（杭州米歐儀器有限公司）；QPCR儀［Archimed X6］（鯤鵬基因（北京）科技有限責(zé)任公司）；超微量紫外可見分光光度計(jì)［ND-100c］（杭州米歐儀器有限公司）。

1.6? 實(shí)驗(yàn)方法

1.6.1? 地紅方含藥血清的制備? 健康雄性SD大鼠14只，體質(zhì)量（180±20）g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后。按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常血清組和地紅方血清組，每組各7只。正常對照組予以等體積蒸餾水灌胃；地紅方組以16.695 g/（kg·d）（臨床等效劑量）進(jìn)行灌胃。連續(xù)1周，于末次給藥2h后，頸動脈取血，離心取血清，56℃水浴30min滅活補(bǔ)體，除菌過濾后，分裝凍存。將收集到的地紅方含藥血清配制成含藥 血清濃度分別為5%、10%、20%的培養(yǎng)液備用。

1.6.2? 實(shí)驗(yàn)分組? SV40 MES 13常規(guī)培養(yǎng)、傳代。按以下分組：對照組（N組，5.5mmol/L葡萄糖+正常血清）、高糖組（H組，30mmol/L葡萄糖+正常血清）、地紅方低劑量組（30mmol/L葡萄糖+5%地紅方含藥血清）、地紅方中劑量組（30mmol/L葡萄糖+10%地紅方含藥血清）、地紅方高劑量組（30mmol/L葡萄糖+20%地紅方含藥血清）。于37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱中干預(yù)培養(yǎng)72h。

1.6.3? 實(shí)時熒光定量PCR（qPCR）檢測miR-133b、DUSP1 mRNA表達(dá)? 收集各組細(xì)胞，按Trizol說明書進(jìn)行，提取總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，依據(jù)熒光定量試劑盒說明。將PCR薄壁管混勻、離心，放入PCR儀，反應(yīng)條件：95℃ 預(yù)變性 30 s；95℃ 30 s；55℃ 1 min；擴(kuò)增40個循環(huán)；95℃ 30s反應(yīng)終止。反應(yīng)結(jié)束后于-20℃保存。擴(kuò)增片段大?。篋USP1（165bp）；引物序列如下（按5′-3′排列）：DUSP1-F（Rat）：TACTGGCCCCTCACTGTTCT；DUSP1-R（Rat）：AGCTCGGAGAGGTTGTGATG； rno-miR-133b-3p- F：TCGCGTTTGGTCCCCTTCAAC； rno-miR-133b-3p-R： AGTGCAGGGTCCGAGGTATT； rno-miR-133b-3p-RT： GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAGCTG；GAPDH-F（Rat）：ACGGCAAGTTCAACGGCACAG；GAPDH-R（Rat）：GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC；U6-F（Rat）：CTCGCTTCGGCAGCACATATACT；U6-R（Rat）：ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC。每組10個樣本。

1.6.4? Elisa檢測超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）表達(dá)? 收集按以上分組的系膜細(xì)胞，根據(jù)Elisa試劑盒說明書操作，在酶標(biāo)儀下讀取吸光度值，測定各組細(xì)胞內(nèi)SOD活性及MDA的含量。每組10個樣本。

1.6.5? Western blotting（WB）檢測DUSP1、p-JNK、Drp1、Fis1蛋白表達(dá)? 收集各組細(xì)胞。用冷的PBS液洗滌細(xì)胞2次，提取總蛋白質(zhì)。配制適量BCA工作液進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，轉(zhuǎn)膜，進(jìn)行膜的染色。5%脫脂奶粉封閉，4℃孵育過夜。將一抗4℃孵育過夜。加入二抗室溫孵育1h。之后進(jìn)行膠片顯影。每組10個樣本。

1.7? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? 采用 SPSS 24.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布者以（x±s）表示，服從非正態(tài)分布以中位數(shù)（四分位間距）即 M（IQR）表示，多組定量資料數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布采用單因素方差分析，否則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

2? 結(jié)果

2.1? 各組miR-133b、DUSP1 mRNA 表達(dá)比較? 見表1。與對照組比較，高糖組miR-133b mRNA表達(dá)明顯升高（P<0.01），而DUSP1 mRNA表達(dá)顯著下降（P<0.01）；與高糖組比較，地紅方低、中、高劑量組miR-133b mRNA表達(dá)顯著降低（P<0.01），而DUSP1 mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.01）。與地紅方低、高劑量組，地紅方中劑量miR-133b mRNA表達(dá)明顯下降（P<0.01），而DUSP1 mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.01）。

2.2? 各組SOD、MDA表達(dá)比較，見表2。與對照組比較，高糖組SOD表達(dá)顯著降低（P<0.01），而MDA表達(dá)顯著升高（P<0.01）；與高糖組比較，地紅方低、中、高劑量組SOD 表達(dá)顯著增加（P<0.01），而MDA表達(dá)顯著減少（P<0.01）。與地紅方低、高劑量組，地紅方中劑量SOD表達(dá)明顯增加（P<0.01），而DUSP1 mRNA表達(dá)顯著減少（P<0.01）。

2.3? 各組DUSP1、p-JNK、Drp1、Fis1蛋白表達(dá)比較，見表3。與對照組比較，高糖組DUSP1蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.01），而p-JNK、Drp1、Fis1蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01）；與高糖組比較，地紅方低、中、高劑量組DUSP1蛋白表達(dá)顯著增加（P<0.01），而p-JNK、Drp1、Fis1蛋白表達(dá)顯著減少（P<0.01）。與地紅方低、高劑量組，地紅方中劑量DUSP1蛋白表達(dá)明顯增加（P<0.01），而p-JNK、Drp1、Fis1蛋白表達(dá)顯著減少（P<0.01）。

3? 討論

DN是DM最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，是終末期腎病的主要原因［1］，其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明。人們越來越認(rèn)識到，高血糖引起的氧化應(yīng)激是DN發(fā)生和進(jìn)展的主要觸發(fā)因素［5］。本研究采用高糖培養(yǎng)SV40 MES 13建立DN細(xì)胞模型，探討地紅方在DN發(fā)生及發(fā)展過程中，改善機(jī)體氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖組抗氧化酶SOD表達(dá)下降（P<0.01），脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物MDA表達(dá)上升（P<0.01），提示高糖引起腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。經(jīng)過地紅方低、中、高劑量干預(yù)后，高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞SOD表達(dá)顯著升高（P<0.01），MDA表達(dá)明顯下降（P<0.01），提示地紅方可改善DN氧化應(yīng)激損傷，對DN具有一定的療效。

高血糖介導(dǎo)的線粒體分裂引起活性氧（reactive oxygen species，ROS）過度產(chǎn)生，迫使細(xì)胞承受氧化應(yīng)激損傷［6］。由過量的ROS產(chǎn)生或抗氧化能力降低引起的氧化應(yīng)激，對DN發(fā)生發(fā)展起關(guān)鍵作用，是近期DN機(jī)制研究的熱點(diǎn)。本研究重點(diǎn)圍繞miR-133b/DUSP1/JNK通路調(diào)節(jié)線粒體分裂在DN氧化應(yīng)激損傷的作用。

微RNA（miR）是一系列小分子非編碼RNA，參與幾乎所有的生物過程，如分化、增殖、凋亡、細(xì)胞周期等，在糖脂代謝中起重要作用［7-8］。一般來說，miRNAs通過與下游mRNAs的3非翻譯區(qū)（3UTR）相互作用，在基因表達(dá)調(diào)控中起作用［9］。miR-133家族包含miR-133a和miR-133b的2個成員［10］，劉敏等［11］研究表明聯(lián)合檢測人體尿液中miR-133b、miR-30a和miR-342可作為DN診斷的潛在標(biāo)志物，并探討其靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度。X S等［12］發(fā)現(xiàn)miR-133可能與DN的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)；建立大鼠DN模型，沉默的miR-133通過絲裂原活化蛋白激酶/蛋白激酶（MAPK/ERK）信號通路抑制DN的腎損傷，因而表明miR-133可能是治療DN的有效靶點(diǎn)。Junqin S等［13］研究發(fā)現(xiàn)慢性高血糖刺激下調(diào)了DUSP1。有缺陷的DUSP1表達(dá)激活了JNK途徑，后者通過調(diào)節(jié)線粒體裂變因子（mitochondrial fission factor，Mff）磷酸化來選擇性地打開線粒體裂變。Mff相關(guān)的線粒體裂變引起線粒體氧化應(yīng)激，最終促進(jìn)線粒體功能障礙、腎小球凋亡和DN的發(fā)展。X-L Z等［9］發(fā)現(xiàn)LncRNA CASC2上調(diào)通過miR-133b/FOXP1調(diào)節(jié)軸抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)積累和氧化應(yīng)激。越來越多證據(jù)表明，過表達(dá)miR-133b，發(fā)揮抗氧化能力，將成為DN防治的熱點(diǎn)。本研究探討miR-133b/DUSP1/JNK通路調(diào)節(jié)線粒體分裂在DN氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制。本研究結(jié)果表明，高糖組miR-133b、p-JNK、Drp1、Fis1表達(dá)明顯升高（P<0.01），而DUSP1表達(dá)顯著下降（P<0.01）；與高糖組比較，地紅方低、中、高劑量組miR-133b、p-JNK、Drp1、Fis1表達(dá)顯著降低（P<0.01），而DUSP1表達(dá)顯著升高（P<0.01）。本研究提示miR-133b/DUSP1/JNK通路調(diào)節(jié)線粒體分裂在DN氧化應(yīng)激損傷起重要作用。

地紅方由六味地黃湯、桃紅四物湯加天花粉、葛根、丹參組成，具有滋陰活血的功效。眾所周知，六味地黃湯是滋陰的代表方，桃紅四物湯是活血養(yǎng)血的經(jīng)典方。六味地黃湯為陰虛型消渴的經(jīng)典方劑，全方六藥合用，三補(bǔ)與三瀉相伍，而以三補(bǔ)為主，肝脾腎三陰并治，尤以補(bǔ)腎陰為重；桃紅四物湯中六藥相伍，補(bǔ)中寓行，使補(bǔ)血而不滯血，行血而不傷血，共成補(bǔ)血調(diào)血之功；配伍丹參活血化瘀，天花粉清熱瀉火，葛根生津止渴，在六味地黃湯合桃紅四物湯的基礎(chǔ)上增強(qiáng)滋陰瀉火、活血化瘀之功。

臨床實(shí)踐和實(shí)驗(yàn)研究方面均有多個六味地黃湯和桃紅四物湯單獨(dú)使用治療DN的報(bào)道。陶鵬宇［14］研究表明六味地黃丸治療DN大鼠，能夠控制血糖及延緩腎功能下降，改善氧化應(yīng)激指標(biāo)，SOD表達(dá)上升，MDA表達(dá)下降，起到抗氧化應(yīng)激的作用。多個臨床研究表明桃紅四物湯能一定程度上減少尿蛋白，保護(hù)腎功能。侯君等［15］觀察桃仁紅花煎能夠改善2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）大鼠腎小球和腎小囊病變，降低DM大鼠血糖、血脂水平，抑制腎臟Wnt/β-catenin信號通路，發(fā)揮對腎臟的保護(hù)作用。地紅方可作為DN滋陰活血的代表方。課題組在長期的臨床實(shí)踐中觀察地紅方可改善DN患者的臨床癥狀，控制血糖及改善腎功能。

中藥湯劑地紅方可作為DN滋陰活血的代表方。我們課題組在長期的臨床實(shí)踐及前期的臨床研究中觀察地紅方可改善DN患者的臨床癥狀，具有控制血糖及改善腎功能的功效?，F(xiàn)代研究表明地紅方中多味中藥及其活性成分具有保護(hù)線粒體功能及抗氧化應(yīng)激的作用。本課題可望通過微觀實(shí)驗(yàn)角度驗(yàn)證標(biāo)本兼治的滋陰活血法防治DN的有效性，并科學(xué)的闡釋滋陰活血法，豐富DN中醫(yī)治療的科學(xué)內(nèi)涵。因而，筆者團(tuán)隊(duì)基于miR-133b/DUSP1/JNK通路探討地紅方調(diào)控線粒體分裂改善DN氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制。本課題組也將在今后的研究中進(jìn)一步驗(yàn)證地紅方改善DN動物模型的機(jī)制研究。這樣有助于中藥復(fù)方地紅方在治療DN的應(yīng)用和推廣，有助于治療DN的新藥開發(fā)。

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（收稿日期：2023-10-23）