基于脂質(zhì)組學(xué)研究胡椒堿對肥胖大鼠脂代謝基因晝夜節(jié)律的影響

張瑋蕓，HO Chi-Tang，呂慕雯,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.羅格斯大學(xué)食品科學(xué)系，美國 新布朗斯維克 08901）

生物鐘系統(tǒng)作為一種重要的調(diào)控系統(tǒng)，存在于哺乳動物的細(xì)胞、器官和組織中，它由中樞生物鐘系統(tǒng)和外周生物鐘系統(tǒng)共同組成，控制著機(jī)體行為和生理功能的晝夜節(jié)律振蕩[1]。中樞生物鐘系統(tǒng)位于下丘腦視交叉上核，由許多單細(xì)胞晝夜節(jié)律振蕩器組成[2]。外周生物鐘系統(tǒng)主要存在于肝臟、腸道、心臟和胰腺等外周組織中。中樞生物鐘系統(tǒng)可直接接收來自視網(wǎng)膜的光照輸入信號，并通過神經(jīng)與體液將時間信息傳遞至機(jī)體的外周組織中，同步外周生物鐘的節(jié)律性振蕩，從而維持機(jī)體代謝穩(wěn)態(tài)[3]。中樞和外周生物鐘系統(tǒng)共享同一套生物鐘分子機(jī)制，生物鐘的節(jié)律性振蕩依賴于自動調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄/翻譯反饋環(huán)，包括晝夜運(yùn)動輸出周期（circadian locomotor output cycles kaput，Clock）基因、腦和肌肉芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)樣蛋白1（brain and muscle-arnt-like 1，Bmal1）基因、周期（periods，Pers）基因、隱花色素（cryptochromes，Crys）基因、維甲酸相關(guān)孤兒受體（retinoic acid-related orphan receptors，Rors）基因和孤兒核激素受體（reverse erythroblastosis virus α/β，Reverbα/β）基因等[4]。

目前許多研究表明，生物鐘系統(tǒng)可參與調(diào)控機(jī)體的晝夜節(jié)律，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)各系統(tǒng)的生理生化反應(yīng)，預(yù)防與代謝紊亂相關(guān)疾病的發(fā)生與發(fā)展[5-6]。而由基因和環(huán)境變化所造成的晝夜節(jié)律紊亂也會引發(fā)宿主脂質(zhì)代謝異常并加速肥胖的發(fā)展[7]。生物鐘系統(tǒng)已被證明可以通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝中合成與分解的關(guān)鍵步驟發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用[8]。例如，Clock或Bmal1敲除小鼠都表現(xiàn)出葡萄糖耐受不良、胰島素分泌減少、對高脂肪飲食喂養(yǎng)的敏感性增加、食欲亢進(jìn)和超重等現(xiàn)象[9]。此外，在外周組織（骨骼肌、胰島β細(xì)胞和肝臟）特異性Bmal1敲除動物模型中，機(jī)體的葡萄糖穩(wěn)態(tài)也出現(xiàn)失調(diào)的現(xiàn)象。因此，脂質(zhì)代謝的晝夜節(jié)律振蕩受到核心生物鐘基因Bmal1的調(diào)節(jié)，同時受到REVERBs、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptor-gamma，PPARγ）和ROR所介導(dǎo)的一系列生物鐘調(diào)節(jié)元件的反饋?zhàn)饔谩?/p>

胡椒堿（1-piperoylpiperidine，PIP）來源于胡椒（PipernigrumLinn.）和蓽撥（PiperlongumLinn.）等胡椒屬植物，是胡椒發(fā)揮活性作用的主要生物成分[10]。據(jù)報道，PIP具有抗肥胖、抗炎、保護(hù)肝臟、調(diào)節(jié)機(jī)體代謝等生物功效[11-12]。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)PIP以Bmal1/Clock依賴的方式調(diào)節(jié)HepG2肝細(xì)胞的脂質(zhì)代謝，表明生物鐘基因在PIP調(diào)節(jié)代謝過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。然而，PIP對高脂飲食（high fat diet，HFD）大鼠脂代謝的晝夜節(jié)律、脂質(zhì)組成及其相關(guān)代謝途徑的影響尚不明確。因此，本研究通過建立HFD誘導(dǎo)的肥胖大鼠模型，在明確PIP減脂效果的基礎(chǔ)上，采用余弦函數(shù)擬合分析PIP對肥胖大鼠肝臟中生物鐘基因和脂代謝相關(guān)基因的晝夜節(jié)律恢復(fù)作用，并結(jié)合脂質(zhì)組學(xué)探究PIP干預(yù)后肥胖大鼠的肝臟脂質(zhì)代謝物變化，基于生物鐘基因的節(jié)律性表達(dá)探究PIP對大鼠減肥降脂作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SD大鼠（使用許可證號：SYXK（粵）2019-0136）購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料和45%脂肪供能高脂飼料購于江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司。

PIP（純度98%）西安天豐生物科技股份有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（highdensity lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aminotransferase aspartate，AST）測試盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）測試盒南京建成生物工程研究所；TRIzol試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green qPCR試劑盒 北京全式金生物技術(shù)股份有限公司。其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

冷凍離心機(jī)、Vanquish液相色譜儀、QE質(zhì)譜儀 美國賽默飛世爾科技公司；RM2135輪轉(zhuǎn)式切片機(jī) 德國Leica公司；CFX96型實(shí)時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）儀 美國伯樂公司；MB-96高通量組織研磨器 浙江美壁儀器有限公司；BE-2600混勻儀 海門其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動物飼喂及分組

選取72 只4 周齡的雄性SD大鼠（100～150 g）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在溫度（25±2）℃、相對濕度（65±5）%條件下飼養(yǎng)所有大鼠。光-暗循環(huán)周期為12 h，用授時時間（zeitgeber time，ZT）表示，ZT0為開燈時間（早8時），ZT12為關(guān)燈時間（晚20時）。適應(yīng)1 周，將所有大鼠隨機(jī)分為3 組（每組24 只大鼠），分別為飼喂標(biāo)準(zhǔn)飼料組（記為ND組）、飼喂高脂飼料組（記為HFD組）、飼喂高脂飼料并同時灌胃30 mg/kgmbPIP組（記為PIP組）。所有大鼠均自由飲水，每周測量體質(zhì)量、攝食量和飲水量。喂養(yǎng)9 周后，在ZT0、ZT6、ZT12和ZT18收集糞便樣本。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，所有大鼠均用戊巴比妥鈉（45 mg/kgmb）麻醉，并在禁食12 h后，從ZT0開始，每隔6 h處死一批大鼠（每組n＝6）。

1.3.2 血液及組織樣品的采集和生化指標(biāo)的測定

考慮到教材中的內(nèi)容滯后于時事，所以遙感課程的教師密切關(guān)注國內(nèi)外遙感領(lǐng)域的最新發(fā)展動態(tài)，選取與遙感課程相關(guān)的時事熱點(diǎn)、趣聞軼事，使其貫穿于教學(xué)始末，并適當(dāng)?shù)匮a(bǔ)充能夠反映最新遙感技術(shù)及其應(yīng)用成果的內(nèi)容。比如介紹在我國遙感發(fā)展歷程中具有里程碑意義的“三大戰(zhàn)役”等。

采用大鼠活體心臟穿刺采血法取血于真空采血管中，將采集的大鼠血液靜置4 h，在4 ℃、3 500 r/min條件下冷凍離心15 min，取上層血清轉(zhuǎn)入離心管中，按照試劑盒說明書測定血清中的ALT、AST、TC、TG、HDL-C和LDL-C的水平。采集大鼠肝臟并稱取總質(zhì)量后，放入生理鹽水中漂去雜質(zhì)，精確剪取肝臟和附睪脂肪相同部位組織稱質(zhì)量，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。在相同部位剪取部分肝臟組織放入體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定液中，制作石蠟組織切片。

1.3.3 肝臟病理學(xué)分析

將肝臟用磷酸鹽緩沖液洗滌，固定在4%多聚甲醛溶液中，進(jìn)行修剪、脫水、包埋、切片、染色（蘇木精-伊紅染色法）、封片制片。在光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟的病理切片結(jié)果。

1.3.4 脂質(zhì)組學(xué)肝臟樣本處理

取適量樣本于2 mL管中，加入750 μL氯仿-甲醇混合溶液（體積比為2∶1），渦旋振蕩30 s，加入2 顆鋼珠于高通量組織研磨器中，50 Hz研磨60 s，重復(fù)2 次。取研磨后的樣本在冰上放置40 min，加入190 μL H2O，混勻振蕩30 s，在冰上靜置10 min，12 000 r/min室溫離心5 min，取下層液300 μL于新的2 mL離心管中，再加入500 μL氯仿-甲醇混合溶液（體積比2∶1），混勻振蕩30 s，在12 000 r/min室溫離心5 min，取下層液400 μL轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中，樣品用真空濃縮儀濃縮。取200 μL異丙醇溶解樣品，用0.22 μm濾膜過濾后得到待測樣本，每個待測樣本各取20 μL混合成為質(zhì)控（quality control，QC）樣品，剩余待測樣本采用液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）聯(lián)用儀檢測。

1.3.5 LC-MS檢測

LC條件：使用ACQUITY UPLC?BEH C181.7 μm（2.1 mm×100 mm）色譜柱，自動進(jìn)樣器溫度為8 ℃，流速為0.25 mL/min，柱溫為50 ℃，進(jìn)樣量2 μL，進(jìn)行梯度洗脫。流動相A為乙腈-水（體積比60∶40）（內(nèi)含0.1%甲酸+10 mmol/L甲酸銨），流動相B為異丙醇-乙腈（體積比90∶10）（內(nèi)含0.1%甲酸+10 mmol/L甲酸銨）。梯度洗脫程序：0～5 min，70%～57% A、30%～43% B；5～5.1 min，57%～50% A、43%～50% B；5.1～14 min，50%～30% A、50%～70% B；14～14.1 min，30% A、70% B；14.1～21 min，30%～1% A、70%～99% B；21～24 min，1% A、99% B；24～24.1 min，1%～70% A、99%～30% B；24.1～28 min，70% A、30% B。

MS條件：使用電噴霧離子源，正負(fù)離子噴霧電壓分別為3.50 kV和2.50 kV，鞘氣體積流量30 arb，輔助氣體積流量10 arb。毛細(xì)管溫度325 ℃，以分辨率35 000進(jìn)行全掃描，掃描范圍m/z150～2 000，采用高能碰撞裂解進(jìn)行二級裂解，碰撞電壓為30 eV，同時動態(tài)排除非必要的MS/MS信息。

1.3.6 反轉(zhuǎn)錄real-time PCR檢測mRNA表達(dá)

在肝臟樣品中加入TRIzol試劑提取組織內(nèi)總RNA，使用微量紫外分光光度計(jì)測定其純度和濃度，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板加入SYBR Green qPCR試劑，于real-time PCR儀中反應(yīng)得到各樣品的Ct值，運(yùn)用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 目標(biāo)基因和內(nèi)參引物序列Table 1 Primer sequences used for amplification of target genes and internal reference genes

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS Statistics 21和Origin 2022軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，用單因素方差分析（One-way ANOVA）確定組間其他數(shù)據(jù)的顯著性，結(jié)果以±s表示。用Python軟件進(jìn)行余弦分析，擬合余弦方程為f（t）＝M+Acos（tπ/12-φ）；其中f（t）為時間對應(yīng)的基因表達(dá)水平；M為波動變化的中線稱為中值；A為振幅；φ為峰值相位，是振蕩達(dá)到峰值的時刻。

2 結(jié)果與分析

2.1 PIP對大鼠飲食、體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的影響

如表2所示，在9 周的喂養(yǎng)結(jié)束后，HFD組大鼠體質(zhì)量增長率高度顯著高于ND組（P＜0.001），其肝質(zhì)量比顯著高于ND組（P＜0.05）；而PIP組的大鼠體質(zhì)量增長率高度顯著低于HFD組（P＜0.001），其肝質(zhì)量比顯著低于HFD組（P＜0.05）。這表明PIP可以抑制HFD喂養(yǎng)大鼠體質(zhì)量增長和肝臟增大。同時，3 組間的攝食量無顯著差異，表明PIP并不是通過減少能量攝入發(fā)揮降脂效果。

表2 PIP對HFD大鼠飲食、體質(zhì)量和肝質(zhì)量比的影響Table 2 Effect of PIP on food intake,body mass and liver index of HFD-induced rats

2.2 PIP對肥胖大鼠血脂水平的影響

AST和ALT是反映肝臟細(xì)胞損傷和細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo)，當(dāng)肝臟受損時，細(xì)胞中轉(zhuǎn)氨酶被釋放到血液中，血清中的AST和ALT水平顯著升高[14-15]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過檢測血清中ALT、AST、TC、TG、HDL-C和LDL-C的水平，評估PIP對HFD誘導(dǎo)脂肪肝和高脂血癥的預(yù)防作用。如圖1A、B所示，與ND組相比，HFD組的血清ALT水平（P＜0.01）和AST水平明顯升高（P＜0.05），表明長期攝入高脂食物造成了肝臟損傷；與HFD組相比，PIP組大鼠的ALT和AST水平顯著下降（P＜0.05），表明PIP對HFD誘導(dǎo)肥胖大鼠的肝臟損傷具有防護(hù)作用。如圖1C～F所示，與ND組相比，HFD組的血清TC和TG水平高度顯著升高（P＜0.001）、LDL-C水平極顯著升高（P＜0.01）、HDL-C的水平顯著降低（P＜0.05）；與HFD組相比，PIP組的血清TC、TG、LDL-C水平顯著降低（P＜0.05），這些結(jié)果表明PIP緩解了HFD引起的大鼠血脂水平紊亂。綜上，PIP改善了長期攝入HFD引起的大鼠肝臟損傷和血脂水平紊亂。

圖1 PIP對HFD大鼠生理指標(biāo)的影響Fig.1 Effect of PIP on physiological indexes of HFD-induced rats

2.3 PIP對大鼠肝臟生物鐘基因晝夜節(jié)律紊亂的影響

最近的研究表明，HFD可以影響哺乳動物體內(nèi)的生物鐘系統(tǒng)，干擾神經(jīng)、體液和激素等信號的傳遞過程，導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂[16-17]。肝臟作為機(jī)體重要的代謝器官，也是外周生物鐘系統(tǒng)最重要的組成部分，在調(diào)節(jié)能量代謝和維持生物體的正常生理功能方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[18-21]。同時，許多植物化學(xué)物質(zhì)已被證明可以通過影響生物鐘的振幅或相位等調(diào)節(jié)生物鐘系統(tǒng)，緩解由晝夜節(jié)律紊亂引起的代謝綜合征[22-23]。為了研究PIP對HFD誘發(fā)晝夜節(jié)律紊亂的影響，本實(shí)驗(yàn)測定了不同時間點(diǎn)肝臟中生物鐘基因Bmal1、Clock、Cry1、Per2、Reverbα和Sirt1的mRNA表達(dá)水平，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行余弦分析（圖2、表3）。如表3所示，各組中除HFD組中Per2未呈現(xiàn)出節(jié)律性表達(dá)（P＞0.05），其他生物鐘基因均呈現(xiàn)出節(jié)律性表達(dá)（P＜0.01）。與ND組相比，HFD誘發(fā)了肝臟的晝夜節(jié)律紊亂，具體表現(xiàn)為Clock表達(dá)的振幅極顯著減小且峰值相位出現(xiàn)延遲（P＜0.01），Cry1表達(dá)的振幅極顯著增大且峰值相位出現(xiàn)提前（P＜0.01），Reverbα表達(dá)的峰值相位出現(xiàn)延遲（P＜0.01）。與HFD組相比，PIP組大鼠Clock（P＜0.05）和Per2（P＜0.01）表達(dá)的振幅顯著增大，Cry1表達(dá)的振幅顯著減?。≒＜0.01），Bmal1、Clock、Cry1和Sirt1的峰值相位出現(xiàn)回復(fù)（P＜0.01）。這些結(jié)果表明，PIP可以削弱HFD引起的大鼠肝臟生物鐘基因表達(dá)的晝夜節(jié)律紊亂。

圖2 PIP對HFD大鼠肝臟生物鐘基因晝夜節(jié)律的影響Fig.2 Effect of PIP on the expression of hepatic circadian clock genes in HFD rats

表3 肝臟生物鐘基因的晝夜節(jié)律參數(shù)Table 3 Circadian rhythm parameters of liver circadian clock genes

2.4 大鼠肝臟脂質(zhì)代謝物的多元統(tǒng)計(jì)分析

為了進(jìn)一步研究PIP對HFD引起的肝臟脂代謝紊亂的影響，本實(shí)驗(yàn)基于脂質(zhì)組學(xué)方法分析了與脂代謝相關(guān)的潛在脂質(zhì)生物標(biāo)志物的變化。如圖3A、B所示，正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）和偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）結(jié)果表明，各組內(nèi)樣本聚集較好，組間有所離散，表明HFD和PIP處理都影響了大鼠脂代謝模式。從圖3C可以看出，ND vs HFD組存在160 種差異脂質(zhì)代謝物，HFD vs PIP組存在78 種差異脂質(zhì)代謝物，ND vs PIP組存在187 種差異脂質(zhì)代謝物，表明各組之間脂質(zhì)代謝物存在一定程度的差異。

圖3 PIP對HFD大鼠肝臟脂代謝分子的影響Fig.3 Effect of PIP on liver lipid metabolism in HFD-induced rats

通過對比兩組間P＜0.05、變量重要性預(yù)測（variable importance projection，VIP）≥1、變化倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）≥1.5或≤0.67的化合物，生成兩組間差異脂質(zhì)種類聚類熱圖。如圖3D、E所示，與ND組相比，HFD組中26 個代謝物上調(diào)和23 個代謝物下調(diào)；與HFD組相比，PIP組中34 個代謝物上調(diào)和15 個代謝物下調(diào)。值得注意的是，PIP可以逆轉(zhuǎn)HFD條件下晝夜節(jié)律紊亂引起的差異脂質(zhì)代謝物水平變化，如圖3F、表4所示，PIP下調(diào)了HFD引起的TG（20:2e_18:1_18:2）、TG（20:3e_18:1_18:3）和TG（18:0_16:0_18:2）水平變化，上調(diào)了溶血磷脂酸（lysobisphosphatidic acids，LBPA）（16:0_18:1）、雙甲基磷脂酸（bis-methyl phosphatidic acid，BisMePA）（38:8e）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）（16:0p_22:6）和甲基磷膽堿（methylphosphocholine，MePC）（3 2:4 e）的水平。因此，這些結(jié)果表明，L B PA（16:0_18:1）、TG（18:0_16:0_18:2）、BisMePA（38:8e）、PE（16:0p_22:6）、MePC（32:4e）、TG（20:2e_18:1_18:2）、TG（20:3e_18:1_18:3）可能是PIP發(fā)揮降脂作用的潛在生物標(biāo)志物。

表4 肝臟差異脂質(zhì)信息Table 4 Information of differential liver lipids of ND vs HFD and HFD vs PIP groups

2.5 PIP對大鼠肝臟脂代謝基因晝夜節(jié)律的影響

目前的研究表明，長期攝入高脂食物會導(dǎo)致能量攝入和消耗不平衡、擾亂生物鐘，導(dǎo)致脂代謝紊亂[24-25]。江芷晴等[26]的研究表明，在高脂飼喂條件下，肝臟生物鐘基因節(jié)律性表達(dá)異常，肝臟脂肪分解減少，內(nèi)源性脂肪合成異常增加，脂代謝基因的晝夜節(jié)律出現(xiàn)紊亂。本研究采用余弦擬合分析了PIP對HFD條件下肝臟脂代謝基因的晝夜節(jié)律的影響，結(jié)果如圖4、表5所示。與ND組相比，HFD處理誘發(fā)了乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，Acc）mRNA表達(dá)的節(jié)律性表達(dá)缺失，PparγmRNA表達(dá)的振幅增大（P＜0.01），肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1（carnitine palmitoyl transferase，Cpt-1）、肝臟X受體α（liver X receptor α，Lxrα）和腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，Ampk）mRNA表達(dá)的振幅減小（P＜0.01），Pparγ（P＜0.05）、膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（sterol regulatory element binding protein-1c，Srebp-1c）（P＜0.01）mRNA表達(dá)的峰值相位出現(xiàn)延遲，CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β（CCAAT enhancer binding proteins β，Cebpb）mRNA表達(dá)的峰值相位出現(xiàn)提前（P＜0.01），表明HFD誘發(fā)了脂代謝相關(guān)基因的節(jié)律性表達(dá)紊亂。與HFD組相比，PIP組中Pparγ、Srebp-1c、Cpt-1和LxrαmRNA表達(dá)的振幅趨近ND組（P＜0.01），F(xiàn)as（P＜0.05）、Pparγ、Srebp-1c和Cebpb（P＜0.01）的峰值相位也出現(xiàn)回復(fù)，表明PIP可改善由HFD引起的肝臟脂代謝相關(guān)基因晝夜節(jié)律的改變，部分恢復(fù)機(jī)體正常的晝夜節(jié)律。

圖4 PIP對HFD大鼠肝臟脂代謝基因晝夜節(jié)律的影響Fig.4 Effect of PIP on circadian rhythm-mediated liver lipid metabolism genes in HFD-induced rats

表5 肝臟脂代謝基因的晝夜節(jié)律參數(shù)Table 5 Circadian rhythm parameters of liver lipid metabolism genes

2.6 脂質(zhì)標(biāo)志物、生物鐘基因和脂質(zhì)代謝基因之間的相關(guān)性分析

采用Spearman相關(guān)性分析和方差分析評估生物鐘基因表達(dá)水平、肝臟中潛在脂質(zhì)標(biāo)志物和脂質(zhì)代謝基因之間的相關(guān)性。如圖5所示，TG（20:3e_18:1_18:3）、TG（20:2e_18:1_18:2）和TG（18:0_16:0_18:2）與Fas、Pparγ、Acc、Srebp-1c、Sirt1和Cebpb基因的表達(dá)水平呈正相關(guān)，與Clock、Cpt-1、Ampk、Per2、Bmal1、Lxrα、Cry1和Reverbα基因的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。相反，LBPA（16:0_18:1）、BisMePA（38:8e）、PE（16:0p_22:6）和MePC（32:4e）與Fas、Srebp-1c、Sirt1、Acc和Pparγ基因的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，與Lxrα、Clock、Reverbα和Bmal1基因的表達(dá)水平呈正相關(guān)。結(jié)果表明生物鐘基因在LBPA（16:0_18:1）、BisMePA（38:8e）、PE（16:0p_22:6）和MePC（32:4e）的含量變化中起到重要的作用，而且LBPA（16:0_18:1）、BisMePA（38:8e）、PE（16:0p_22:6）和MePC（32:4e）有可能是PIP調(diào)節(jié)HFD引起晝夜節(jié)律紊亂的重要靶點(diǎn)。

圖5 脂質(zhì)標(biāo)志物與肥胖相關(guān)的生物鐘基因和脂質(zhì)代謝基因之間的Spearman相關(guān)性Fig.5 Spearman correlation between biological clock genes and lipid metabolism genes associated with lipid biomarkers and obesity

3 討論

研究表明，HFD可改變晝夜節(jié)律和能量代謝。同時，晝夜節(jié)律和新陳代謝之間的相互作用在維持機(jī)體的代謝穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要的作用[27]。本研究通過設(shè)置不同的時間點(diǎn)進(jìn)行取樣檢測，證明了PIP對肝臟生物鐘和脂代謝基因晝夜節(jié)律的影響，并探討了其可能的作用機(jī)制。

PIP是黑胡椒中的主要刺激性生物堿成分，在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均顯示出顯著的降脂活性。Shah等[28]發(fā)現(xiàn)，在HFD誘導(dǎo)的雄性SD大鼠中，灌胃劑量為40 mg/kgmb的PIP具有降脂和抗肥胖的功效。Brahmanaidu等[29]發(fā)現(xiàn)灌胃不同劑量（20、30 mg/kgmb和40 mg/kgmb）的PIP均能逆轉(zhuǎn)HFD引起的動物體質(zhì)量增加，改善了血漿和組織中脂質(zhì)水平，增強(qiáng)了肝臟抗氧化能力，而且存在明顯的量效關(guān)系。在本研究中，HFD大鼠在長期經(jīng)口攝入30 mg/kgmbPIP后，其血清TC、TG和LDL-C水平顯著降低，此結(jié)果與前人的研究結(jié)果[29]相一致，證實(shí)了PIP能夠顯著改善HFD大鼠的血脂水平。

隨著研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)生物鐘系統(tǒng)可參與調(diào)控機(jī)體的糖脂代謝節(jié)律，從而干預(yù)與代謝紊亂相關(guān)的疾病[30]。已有研究指出，大約1/3的基因在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出晝夜節(jié)律振蕩，但是晝夜節(jié)律控制的基因在不同組織中的表達(dá)水平存在差異，表明晝夜節(jié)律的轉(zhuǎn)錄過程具有組織特異性[31]。Hans等[32]研究發(fā)現(xiàn)肝臟中的脂質(zhì)代謝基因存在節(jié)律振蕩，并與肥胖的發(fā)展密切相關(guān)。在本研究中，HFD條件下大鼠肝臟的脂質(zhì)代謝基因（Acc、Pparγ、Cpt-1、Lxrα、Ampk、Srebp-1c、Cebpb）的節(jié)律性振蕩均產(chǎn)生了不同程度的紊亂，表明HFD破壞了肝臟脂質(zhì)代謝基因表達(dá)水平的晝夜節(jié)律，這與Hans等[32]的研究結(jié)果相一致。有研究指出，Per2基因通過直接調(diào)節(jié)Pparγ的表達(dá)控制脂質(zhì)代謝。Wang Tao等[33]發(fā)現(xiàn)在Per1敲除小鼠中，Pparγ及其與TG合成相關(guān)的靶基因振幅出現(xiàn)紊亂，表明機(jī)體的脂代謝晝夜節(jié)律由內(nèi)源性生物鐘系統(tǒng)驅(qū)動。Pparγ和Lxrα可增強(qiáng)肝細(xì)胞中的Srebp-1c表達(dá)水平，且Srebp-1c可促進(jìn)Fas和Acc等脂肪酸合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，在脂肪生成中起著核心作用[34]。在攝入PIP后，HFD大鼠肝臟中Pparγ、Srebp-1c、Cpt-1和Lxrα的節(jié)律性近似于ND組，同時肝臟損傷和血脂水平也顯著降低，證實(shí)PIP通過改善HFD引起的肝臟脂質(zhì)代謝基因表達(dá)水平的晝夜節(jié)律紊亂，減少了肝臟損傷并降低了血脂，說明PIP通過調(diào)整肝臟脂質(zhì)代謝基因的節(jié)律振蕩發(fā)揮減肥降脂功效，與川芨素、白藜蘆醇、辣椒素等活性物質(zhì)的降脂機(jī)制一致[35]。經(jīng)過脂質(zhì)組學(xué)分析和相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)LBPA（16:0_18:1）、BisMePA（38:8e）、PE（16:0p_22:6）和MePC（32:4e）與脂質(zhì)代謝基因表達(dá)密切相關(guān)，這說明上述脂質(zhì)代謝物可能是PIP調(diào)節(jié)HFD引起脂質(zhì)代謝晝夜節(jié)律紊亂的重要靶點(diǎn)。這個發(fā)現(xiàn)為研究脂質(zhì)代謝相關(guān)基因晝夜節(jié)律表達(dá)水平的改變對脂質(zhì)代謝物產(chǎn)生影響的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。未來仍需進(jìn)一步探究PIP調(diào)控脂質(zhì)代謝相關(guān)基因節(jié)律性表達(dá)的作用機(jī)制。

4 結(jié)論

本研究首先構(gòu)建了高脂飼料誘發(fā)的大鼠肥胖模型，探究了PIP對肥胖大鼠脂代謝晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PIP可以減輕HFD誘導(dǎo)的肝臟損傷，降低血脂水平，緩解肝臟生物鐘和脂代謝基因表達(dá)的晝夜節(jié)律紊亂。此外，對大鼠肝臟脂質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)PIP處理恢復(fù)了HFD引起的TG（20:2e_18:1_18:2）、TG（20:3e_18:1_18:3）、TG（18:0_16:0_18:2）、LBPA（16:0_18:1）、BisMePA（38:8e）、PE（16:0p_22:6）和MePC（32:4e）的水平變化，且LBPA（16:0_18:1）、BisMePA（38:8e）、PE（16:0p_22:6）和MePC（32:4e）與肝臟生物鐘基因的表達(dá)水平具有顯著相關(guān)性，表明其可能是PIP通過生物鐘基因調(diào)節(jié)肝臟脂代謝的關(guān)鍵脂質(zhì)組分。綜上所述，PIP作為一種多功能性的植物化學(xué)物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)高能量飲食誘發(fā)的脂質(zhì)代謝晝夜節(jié)律紊亂的潛力。在未來研究中，采用特定器官生物鐘基因敲除鼠將更有利于闡明PIP調(diào)控肝臟脂代謝晝夜節(jié)律的作用機(jī)制。