糖類(lèi)與甜味劑的腸-腦軸效應(yīng)研究進(jìn)展及評(píng)估方法分析

史清照，劉富強(qiáng)，張啟東，范 武，柴國(guó)璧，毛 健,2，王煥麗，姬凌波，馮偉華，宗國(guó)浩，曹培健，盧 鵬，謝劍平,2,*

（1.中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，河南 鄭州 450001；2.北京生命科技研究院，北京 102299）

喜愛(ài)甜味是人類(lèi)的本能，人類(lèi)在嬰兒時(shí)期就表現(xiàn)出明顯的甜味偏好[1]，而甜味引發(fā)的大腦獎(jiǎng)賞區(qū)域神經(jīng)活動(dòng)和多巴胺（dopamine，DA）的釋放則闡釋了這一現(xiàn)象的深層生物學(xué)機(jī)制[2-3]。人類(lèi)文明初期，甜味主要源于鮮果、蜂蜜和其他植物中的天然小分子糖類(lèi)。隨著農(nóng)業(yè)和手工業(yè)的發(fā)展，世界各地先后以谷物、甘蔗、甜菜等為原料，創(chuàng)造性地開(kāi)發(fā)出含有較高麥芽糖（飴）、蔗糖等糖類(lèi)的甜食?！对?shī)經(jīng)》中有“周原膴膴，堇荼如飴”的詩(shī)句，以甜美的飴糖贊美周人的故土，可見(jiàn)早在周代飴糖已是生活中常見(jiàn)的食品。

隨著工業(yè)革命的發(fā)生，尤其是二戰(zhàn)后工業(yè)與農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)的結(jié)合，全球越來(lái)越多的經(jīng)濟(jì)體呈現(xiàn)食物和營(yíng)養(yǎng)供給日益過(guò)剩的趨勢(shì)；由于對(duì)甜味的本能喜愛(ài)，高糖高甜度食品備受消費(fèi)者青睞，但同時(shí)也帶來(lái)了諸如糖尿病、肥胖等健康問(wèn)題。國(guó)際糖尿病聯(lián)盟（International Diabetes Federation，IDF）2021年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全球糖尿病患病率持續(xù)增長(zhǎng)，相比于2019年，2021年全球成年糖尿病患者人數(shù)增加了16%，約占全球成年人口的10.5%[4-5]。

在這一全球健康風(fēng)險(xiǎn)背景下，許多國(guó)家開(kāi)始實(shí)施政策以降低本國(guó)居民的糖類(lèi)攝入量[6]。我國(guó)各級(jí)政府機(jī)構(gòu)已出臺(tái)多項(xiàng)政策或計(jì)劃，呼吁人們控制日常糖分?jǐn)z入、倡導(dǎo)減糖生活。在各方倡導(dǎo)下，利用甜味劑代替糖類(lèi)提供甜味感受的產(chǎn)品在食品產(chǎn)業(yè)界和消費(fèi)者群體中受到更多關(guān)注。甜味劑通常以更少的劑量提供與糖類(lèi)同等強(qiáng)度的甜味，同時(shí)不影響血糖水平，也不會(huì)導(dǎo)致肥胖、齲齒等健康問(wèn)題，滿(mǎn)足了消費(fèi)者獲取甜味享受和降低健康風(fēng)險(xiǎn)的雙重需求。目前全球范圍內(nèi)無(wú)糖或低糖類(lèi)產(chǎn)品數(shù)量迅速增加，這些產(chǎn)品都應(yīng)用了不同類(lèi)型的甜味劑。

甜味劑根據(jù)來(lái)源分為人工甜味劑和天然甜味劑兩種類(lèi)型。1879年，美國(guó)約翰·霍普金斯大學(xué)研究人員偶然品嘗了所合成的產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)其具有強(qiáng)烈的甜味并將其命名為“糖精”，這是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)并獲得大規(guī)模應(yīng)用的人工甜味劑[7]。隨后甜蜜素、安賽蜜、阿斯巴甜和三氯蔗糖等不同類(lèi)型的人工甜味劑陸續(xù)被開(kāi)發(fā)出來(lái)，且無(wú)一例外出于實(shí)驗(yàn)偶然。1979年，輝瑞公司投資開(kāi)發(fā)出阿力甜，人工甜味劑進(jìn)入更為理性的研發(fā)時(shí)代，且甜度獲得更大幅度的提升。1993年紐特公司開(kāi)發(fā)出紐甜，2008年日本味之素公司開(kāi)發(fā)出愛(ài)德萬(wàn)甜，甜度分別達(dá)到了蔗糖的8 000 倍和20 000 倍[8-9]。伴隨各類(lèi)人工甜味劑的廣泛應(yīng)用，其在消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等方面的安全性爭(zhēng)議不斷[10-12]，近期國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將阿斯巴甜列為“可能對(duì)人類(lèi)致癌的物質(zhì)”，這一報(bào)道引起了人們對(duì)甜味劑安全性的廣泛關(guān)注。另一方面，環(huán)保主義和綠色消費(fèi)理念則驅(qū)動(dòng)著以糖苷類(lèi)、糖醇類(lèi)為代表的天然甜味劑快速發(fā)展。然而，天然甜味劑甜度相對(duì)偏低，又因原料產(chǎn)能限制導(dǎo)致生產(chǎn)成本相對(duì)較高，因此常與人工甜味劑搭配使用，改良產(chǎn)品風(fēng)味。目前，人工甜味劑市場(chǎng)占有率仍顯著高于天然甜味劑。

盡管現(xiàn)有甜味劑能夠提供類(lèi)似于糖類(lèi)的風(fēng)味感受和遠(yuǎn)高于糖類(lèi)的甜味強(qiáng)度，但仍舊不能完全替代食用糖類(lèi)所帶來(lái)的滿(mǎn)足感。研究發(fā)現(xiàn)，甜味劑的攝入可能會(huì)讓人更想吃含糖的甜食[13]，孕期攝入大量的甜味劑甚至?xí)?dǎo)致胎兒出生后對(duì)糖類(lèi)食物產(chǎn)生更強(qiáng)烈的偏好，從而間接性地導(dǎo)致肥胖[14]。近二十年來(lái)，在動(dòng)物行為學(xué)表現(xiàn)、大腦獎(jiǎng)賞系統(tǒng)活動(dòng)和關(guān)鍵神經(jīng)通路激活模式等不同層面的研究中均發(fā)現(xiàn)人類(lèi)或動(dòng)物對(duì)糖類(lèi)和甜味劑的行為偏好和腸-腦軸神經(jīng)反應(yīng)存在顯著差異，明確該現(xiàn)象及其深層生物學(xué)機(jī)制，對(duì)于完善甜味劑的功能評(píng)估體系和指導(dǎo)甜味劑的創(chuàng)新發(fā)展都具有十分重要的意義。本文綜述了糖類(lèi)和甜味劑引發(fā)動(dòng)物行為偏好差異及其生物學(xué)機(jī)制方面的研究進(jìn)展；在此基礎(chǔ)上，從動(dòng)物行為學(xué)特征、腦區(qū)神經(jīng)活動(dòng)模式和關(guān)鍵受體激活能力3 個(gè)角度提出了完善當(dāng)前甜味劑功能評(píng)估體系的方法學(xué)建議，旨在為甜味劑的功能研究與創(chuàng)新發(fā)展提供參考。

1 糖類(lèi)與甜味劑的腸-腦軸效應(yīng)差異研究

1.1 糖類(lèi)與甜味劑引發(fā)的動(dòng)物行為偏好差異

大多數(shù)動(dòng)物都會(huì)被甜味吸引，然而面對(duì)糖類(lèi)和甜味劑，動(dòng)物卻展現(xiàn)出明顯的選擇傾向性。在甜味受體發(fā)現(xiàn)之前，研究者認(rèn)為味覺(jué)系統(tǒng)可能是導(dǎo)致動(dòng)物對(duì)糖類(lèi)和甜味劑產(chǎn)生偏好差異的主要原因[15-16]。然而，在針對(duì)小鼠的味覺(jué)測(cè)試中發(fā)現(xiàn)，蔗糖和非糖類(lèi)甜味成分（甘氨酸或L-絲氨酸）同時(shí)存在時(shí)小鼠表現(xiàn)出對(duì)蔗糖的明顯偏好[17]。48 h雙瓶偏好實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中小鼠消耗的葡萄糖比L-絲氨酸多[18]。在對(duì)蔗糖和三氯蔗糖的對(duì)比研究中也發(fā)現(xiàn)了小鼠對(duì)蔗糖的偏好，經(jīng)過(guò)饑餓訓(xùn)練的小鼠隨著時(shí)間推移，取食蔗糖的次數(shù)明顯增加[2]。雖然8%蔗糖溶液、0.3%甜菊糖苷溶液、10 mmol/L安賽蜜溶液、10 mmol/L三氯蔗糖溶液和10 mmol/L阿斯巴甜溶液均能引起小鼠明顯的甜味偏好，但是面對(duì)甜度相同的蔗糖和安賽蜜溶液時(shí)，相同時(shí)間內(nèi)小鼠對(duì)蔗糖的消耗量顯著高于安賽蜜[19]。這種對(duì)糖和甜味劑的顯著偏好差異在24 h內(nèi)即可出現(xiàn)，而48 h后小鼠幾乎只選擇糖溶液，從而出現(xiàn)完全的選擇傾向性[20]。

進(jìn)而有研究者推斷，這種對(duì)糖類(lèi)和非糖類(lèi)甜味物質(zhì)的行為偏好差異有可能來(lái)自不同成分與甜味受體結(jié)合能力的差異[17]。然而，甜味受體的發(fā)現(xiàn)以及甜味感知機(jī)制的相關(guān)研究成果推翻了這一假設(shè)[21-25]。人類(lèi)感知甜味的能力由異源二聚體——味覺(jué)受體第一家族成員（taste receptor family 1 member，T1R）2/T1R3介導(dǎo)，敲除T1R3能夠去除小鼠感知甜味的能力[23,26-27]。Tan等[20]發(fā)現(xiàn)盡管T1R3敲除小鼠無(wú)法嘗到糖和安賽蜜的甜味，但它們卻依然能夠在糖和安賽蜜之間傾向性地選擇糖。分別將可引起野生小鼠最大偏好濃度的蔗糖、D-葡萄糖和3 種人工甜味劑（三氯蔗糖、安賽蜜和SC45647）溶液供給T1R3敲除小鼠時(shí)，48 h內(nèi)小鼠對(duì)各溶液的行為偏好均消失；進(jìn)一步將各溶液濃度提高到最大偏好濃度的5～10 倍時(shí)，T1R3敲除小鼠出現(xiàn)對(duì)蔗糖和D-葡萄糖的偏好，而對(duì)3 種人工甜味劑依然沒(méi)有產(chǎn)生偏好；此外，在胃內(nèi)輸注蔗糖的同時(shí)，通過(guò)口腔供給小鼠風(fēng)味溶液能使小鼠對(duì)風(fēng)味溶液產(chǎn)生偏好，而將蔗糖替換為三氯蔗糖后，偏好則不能產(chǎn)生[28]。

瞬時(shí)受體電位離子通道蛋白5（transient receptor potential melastatin 5，TRPM5）、鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)蛋白（calcium homeostasis modulator，Calhm1）均是甜味信號(hào)的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)元素，敲除TRPM5、Calhm1基因同樣可以阻斷甜味信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[29]。Zhang Yifeng等[30]發(fā)現(xiàn)敲除TRPM5小鼠對(duì)安賽蜜的偏好完全消失，而對(duì)于蔗糖和葡萄糖的舔舐次數(shù)雖有所降低，但仍然表現(xiàn)出行為偏好。類(lèi)似的研究發(fā)現(xiàn)，TRPM5基因敲除小鼠保留了對(duì)蔗糖的偏好，但對(duì)三氯蔗糖的偏好消失[31]。Calhm1敲除小鼠每天消耗的蔗糖總量降低了一半，但依然形成了對(duì)蔗糖的偏好[32]。此外，以胃部灌注的方式對(duì)野生小鼠和TRPM5敲除小鼠分別進(jìn)行蔗糖或三氯蔗糖刺激后，小鼠均僅對(duì)蔗糖產(chǎn)生偏好[2]（圖1）。

圖1 糖和甜味劑的小鼠行為學(xué)差異Fig.1 Behavioral differences between sugars and sweeteners in mice

以上行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，糖類(lèi)和甜味劑均可使正常小鼠產(chǎn)生甜味偏好，但是相比于甜味劑，小鼠更偏愛(ài)糖；敲除小鼠的甜味受體基因或甜味信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因均能阻斷人工甜味劑誘發(fā)的行為偏好，但不能阻斷其對(duì)糖的行為偏好。這些現(xiàn)象說(shuō)明糖類(lèi)和甜味劑使小鼠產(chǎn)生偏好的機(jī)制并不完全相同，存在一種不需要甜味受體參與、獨(dú)立于味覺(jué)系統(tǒng)的神經(jīng)機(jī)制調(diào)控糖偏好的形成。

1.2 糖類(lèi)與甜味劑引發(fā)的動(dòng)物腦區(qū)活動(dòng)差異

早先人們認(rèn)為腸道和大腦僅通過(guò)激素進(jìn)行信號(hào)傳遞，激素信號(hào)可以獨(dú)立于甜味感受刺激動(dòng)物對(duì)糖的消費(fèi)和偏好[33]。然而后來(lái)的研究表明，對(duì)膽囊收縮素A（小腸黏膜I細(xì)胞釋放的一種肽類(lèi)激素）受體的藥理學(xué)抑制不會(huì)影響糖在胃內(nèi)輸注引發(fā)的偏好[34]。生長(zhǎng)激素釋放肽也曾被認(rèn)為參與食物獎(jiǎng)賞的過(guò)程，而Sclafani等[35]研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)激素釋放肽受體敲除同樣不會(huì)影響小鼠對(duì)糖的偏好，進(jìn)而推翻了這一假設(shè)。

多項(xiàng)研究證明，大腦中DA釋放引發(fā)的獎(jiǎng)賞效應(yīng)參與了糖類(lèi)攝入的中樞反應(yīng)[36-37]。在攝入糖后，能夠監(jiān)測(cè)到伏隔核區(qū)域DA的釋放[38-40]。DA受體（D1和D2型受體）的藥理學(xué)抑制也能抑制糖的攝入或消除胃內(nèi)輸注葡萄糖引發(fā)的條件性風(fēng)味偏好[41-46]。DA信號(hào)也參與調(diào)節(jié)糖或其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如脂肪產(chǎn)生條件風(fēng)味偏好的能力[47-49]。因此，糖引起DA獎(jiǎng)賞環(huán)路響應(yīng)是糖偏好的重要研究切入點(diǎn)。隨著相關(guān)研究的深入，糖激活大腦釋放DA的神經(jīng)環(huán)路機(jī)制逐漸明晰。Mark等[50]發(fā)現(xiàn)胃內(nèi)輸注聚糖溶液可以誘發(fā)腹側(cè)紋狀體和背側(cè)紋狀體釋放DA?？诜湍c內(nèi)輸注蔗糖的研究結(jié)果均顯示出中腦邊緣系統(tǒng)和黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)神經(jīng)元活性的增加和DA的釋放[51]。研究表明，敲除TRPM5基因小鼠依然對(duì)胃內(nèi)注射D-葡萄糖產(chǎn)生了強(qiáng)烈的偏好，并且30 min內(nèi)檢測(cè)到腹側(cè)紋狀體和背側(cè)紋狀體DA釋放量增多；在胃部注射機(jī)體不可代謝的葡萄糖類(lèi)似物同樣能檢測(cè)到DA的釋放（雖然釋放量有所降低），這種特異性偏好證明D-葡萄糖可以獨(dú)立于味覺(jué)系統(tǒng)和能量產(chǎn)生行為偏好，并具有刺激腹側(cè)紋狀體和背側(cè)紋狀體釋放DA的能力[52]。以上研究揭示了與糖信號(hào)有關(guān)的兩條DA釋放環(huán)路：第一條是中腦邊緣系統(tǒng)，從腹側(cè)被蓋區(qū)（ventral tegmental area，VTA）投射到腹側(cè)紋狀體；第二條是黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)，從黑質(zhì)致密部投射到背側(cè)紋狀體?？诜臀竷?nèi)輸注蔗糖溶液均可激活上述兩個(gè)環(huán)路神經(jīng)元，促進(jìn)DA釋放[53]。

Tellez等[3]針對(duì)糖信號(hào)引起DA釋放的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這兩條神經(jīng)環(huán)路在感知糖和甜味劑的反應(yīng)上存在差異：小鼠口腔攝入三氯蔗糖同時(shí)胃內(nèi)輸注三氯蔗糖或葡萄糖均可引起腹側(cè)紋狀體釋放DA，然而只有胃內(nèi)輸注葡萄糖時(shí)才能引起背側(cè)紋狀體釋放DA，這表明投射至背側(cè)紋狀體的DA神經(jīng)元對(duì)糖具有選擇敏感性；摻入苦味劑的三氯蔗糖溶液同時(shí)胃內(nèi)輸注葡萄糖能夠抑制腹側(cè)紋狀體釋放DA，而背側(cè)紋狀體仍有高水平的DA釋放量，這也間接說(shuō)明了黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)可能負(fù)責(zé)對(duì)糖產(chǎn)生獎(jiǎng)賞反應(yīng)，而中腦邊緣系統(tǒng)可能負(fù)責(zé)對(duì)糖和甜味劑引發(fā)的甜味產(chǎn)生獎(jiǎng)賞反應(yīng)（圖2）。Fernandes等[2]利用深腦鈣成像技術(shù)監(jiān)測(cè)胃內(nèi)VTA多巴胺能神經(jīng)元的活性，與胃內(nèi)輸注三氯蔗糖相比，胃內(nèi)輸注蔗糖可以在1～2 min內(nèi)快速誘導(dǎo)VTA的DA神經(jīng)元出現(xiàn)持續(xù)正向上調(diào)活性，這說(shuō)明蔗糖胃內(nèi)輸注引發(fā)的感覺(jué)信號(hào)從腸道到大腦的傳遞是十分迅速的，腸-腦之間可能存在一條“信息高速公路”支撐糖引發(fā)的感覺(jué)信號(hào)傳遞。

圖2 糖和甜味劑感知的多巴胺能獎(jiǎng)賞環(huán)路Fig.2 Dopaminergic reward circuits for sugar and sweetener perception

1.3 糖類(lèi)與甜味劑引發(fā)的腸-腦軸神經(jīng)激活模式差異

Bohórquez等[54]通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡觀察腸道內(nèi)分泌細(xì)胞的神經(jīng)纖維亞群時(shí)發(fā)現(xiàn)，一種特殊細(xì)胞亞群基部具有類(lèi)似于神經(jīng)元軸突的胞質(zhì)突起，這些神經(jīng)纖維亞群既可以作為吸收營(yíng)養(yǎng)的平臺(tái)，也可以作為分泌激素的啟動(dòng)平臺(tái)。這些腸道內(nèi)分泌細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為解釋腸道和大腦的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制開(kāi)辟了新的研究路徑。該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)腸道內(nèi)分泌細(xì)胞與神經(jīng)元之間的突觸存在連接，這種突觸之間的信號(hào)傳遞可能比血液中的激素釋放信號(hào)更為直接，這些含有突起的腸道內(nèi)分泌細(xì)胞被稱(chēng)為neuropod細(xì)胞；進(jìn)一步追蹤neuropod細(xì)胞的觸體發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞十分接近小腸和大腸的個(gè)別神經(jīng)纖維，同時(shí)60%的neuropod細(xì)胞會(huì)接觸感覺(jué)神經(jīng)元，因此，推測(cè)這些neuropod細(xì)胞可能參與了腸道感覺(jué)信號(hào)的傳遞；狂犬病病毒通常被用作神經(jīng)元單突觸連接的可視化工具，狂犬病病毒示蹤結(jié)果表明，結(jié)腸內(nèi)的neuropod細(xì)胞能夠被狂犬病毒成功感染，說(shuō)明該病毒可以從腸道內(nèi)腔到達(dá)神經(jīng)系統(tǒng)，因此neuropod細(xì)胞和腸道神經(jīng)元之間的確存在聯(lián)系[55]。Kaelberer等[56]對(duì)neuropod細(xì)胞進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該細(xì)胞與迷走神經(jīng)元之間形成的突觸可以傳遞蔗糖或葡萄糖引發(fā)的信號(hào)：葡萄糖能夠誘發(fā)neuropod細(xì)胞釋放谷氨酸，并且可以引發(fā)迷走神經(jīng)元的興奮性突觸后電流；沉默neuropod細(xì)胞后，葡萄糖輸注誘導(dǎo)迷走神經(jīng)在幾毫秒內(nèi)的快速放電則被完全消除。這些研究結(jié)果表明，大腦在幾毫秒內(nèi)接受來(lái)自腸道輸入的糖刺激取決于neuropod細(xì)胞的谷氨酸能信號(hào)傳遞，然而這群細(xì)胞在糖偏好中的作用及機(jī)制至此仍未明確。

腸道中最主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體是鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（sodium-glucose cotransporter 1，SGLT1），在腸上皮細(xì)胞和腸內(nèi)分泌表面均有表達(dá)。Kaelberer等[56]的研究證明SGLT1參與了葡萄糖或蔗糖刺激neuropod細(xì)胞釋放神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的過(guò)程，抑制SGLT1會(huì)阻斷谷氨酸的釋放，而SGLT1對(duì)葡萄糖具有選擇性，人工甜味劑并不能激活SGLT1。Tan等[20]從神經(jīng)元活動(dòng)的角度證明了SGLT1的激活能夠激活對(duì)葡萄糖攝入響應(yīng)的神經(jīng)元，抑制SGLT1能夠阻斷對(duì)葡萄糖攝入偏好的形成。這些研究表明糖類(lèi)攝入信號(hào)的腸-腦軸信號(hào)傳遞需要SGLT1參與。

Buchanan等[57]基于neuropod細(xì)胞和SGLT1受體深入研究了糖和人工甜味劑的偏好行為：近端小腸注入蔗糖、葡萄糖類(lèi)似物和人工甜味劑均會(huì)快速引發(fā)迷走神經(jīng)反應(yīng)，沉默neuropod細(xì)胞后迷走神經(jīng)反應(yīng)相應(yīng)消失，這表明3 類(lèi)甜味物質(zhì)引發(fā)的迷走神經(jīng)反應(yīng)均依賴(lài)于neuropod細(xì)胞。阻斷SGLT1可消除蔗糖和葡萄糖類(lèi)似物誘發(fā)的迷走神經(jīng)反應(yīng)，而阻斷T1R3僅能消除人工甜味劑誘發(fā)的迷走神經(jīng)反應(yīng)；利用活體雙光子成像和受體抑制實(shí)驗(yàn)確定了neuropod細(xì)胞分別通過(guò)釋放谷氨酸和腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）兩種不同的神經(jīng)遞質(zhì)將蔗糖和人工甜味劑的腸道刺激傳遞到迷走神經(jīng)的不同神經(jīng)元亞群；分別提供給小鼠含有三氯蔗糖溶液和同等甜度的蔗糖溶液，小鼠表現(xiàn)出對(duì)蔗糖的偏好，抑制neuropod細(xì)胞或谷氨酸受體均會(huì)導(dǎo)致小鼠對(duì)蔗糖的偏好消失。以上研究表明，小鼠的糖偏好取決于neuropod細(xì)胞，neuropod細(xì)胞分別依賴(lài)SGLT1和甜味受體T1R3分辨出糖和人工甜味劑信號(hào)。糖類(lèi)和人工甜味劑會(huì)刺激neuropod細(xì)胞分別釋放谷氨酸和ATP作為神經(jīng)遞質(zhì)，通過(guò)釋放不同的神經(jīng)遞質(zhì)激活迷走神經(jīng)的不同神經(jīng)元亞群，進(jìn)而讓大腦分辨糖和人工甜味劑。

孤束尾核（caudal portion of solitary tract nucleus，cNTS）是機(jī)體內(nèi)部感知信號(hào)向大腦傳遞的中繼器。研究表明，不同的cNTS神經(jīng)元亞群可被十二指腸或胃內(nèi)的葡萄糖或甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷激活，而糖精則無(wú)法激活cNTS[58-59]。利用腺病毒攜帶的破傷風(fēng)毒素阻斷被糖激活的cNTS神經(jīng)元突觸傳遞功能后，小鼠對(duì)于糖的偏好消失，因此可以認(rèn)為cNTS是小鼠對(duì)葡萄糖產(chǎn)生偏好的重要中繼。切斷雙側(cè)迷走神經(jīng)可阻斷cNTS神經(jīng)元被激活，這表明糖攝入信號(hào)的傳遞需要通過(guò)迷走神經(jīng)，進(jìn)而通過(guò)迷走神經(jīng)結(jié)狀神經(jīng)元傳遞信號(hào)并激活cNTS神經(jīng)元[20]。

至此，糖類(lèi)攝入信號(hào)在腸-腦軸傳遞的神經(jīng)通路基本明晰，口腔攝入的糖類(lèi)和甜味劑均能激活位于口腔的甜味受體細(xì)胞，將信息傳遞至中腦邊緣DA系統(tǒng)刺激腹側(cè)紋狀體DA的釋放。但進(jìn)入胃和近端小腸（十二指腸）后，糖類(lèi)和人工甜味劑則出現(xiàn)了明顯差異。蔗糖或葡萄糖等能夠與腸道內(nèi)neuropod細(xì)胞表面SGLT1受體結(jié)合，neuropod細(xì)胞軸突釋放谷氨酸激活迷走神經(jīng)，迷走神經(jīng)的結(jié)狀神經(jīng)元亞群通過(guò)單突觸繼續(xù)將糖攝入的信息傳遞到腦干cNTS神經(jīng)元，進(jìn)一步激活黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)背側(cè)紋狀體DA的釋放。而人工甜味劑則與neuropod細(xì)胞表面的甜味受體T1R3結(jié)合，使neuropod細(xì)胞軸突釋放神經(jīng)遞質(zhì)ATP將信息傳遞到迷走神經(jīng)，但并不引發(fā)腦干cNTS神經(jīng)元的響應(yīng)（圖3）。因此，大腦可以辨別糖和甜味劑從而使個(gè)體表現(xiàn)出行為偏好的差異。

圖3 腸道neuropod細(xì)胞識(shí)別糖和甜味劑的分子機(jī)制[53]Fig.3 Molecular mechanisms of discrimination between sugars and sweeteners by gut neuropod cells[53]

2 基于腸腦軸效應(yīng)的甜味劑功能評(píng)估和創(chuàng)新研發(fā)的新方法

甜味劑和糖類(lèi)的腸-腦軸效應(yīng)差異是決定甜味劑能否產(chǎn)生長(zhǎng)時(shí)程行為偏好的根本原因，這對(duì)于甜味劑的功能評(píng)估和創(chuàng)新研發(fā)意義重大。目前對(duì)是否所有的甜味劑都不能引發(fā)腸-腦軸效應(yīng)尚未明確，同時(shí)新一代甜味劑研發(fā)更應(yīng)該將引發(fā)腸-腦軸效應(yīng)作為重要功能指標(biāo)。因此，本文從3 個(gè)層面分別總結(jié)了甜味成分腸-腦軸效應(yīng)相關(guān)的研究手段，提出了3 種可用于甜味劑腸-腦軸效應(yīng)評(píng)估的方式，旨在為相關(guān)產(chǎn)業(yè)界開(kāi)展甜味劑創(chuàng)新研發(fā)提供參考。

2.1 利用動(dòng)物行為學(xué)表現(xiàn)的評(píng)估方式

行為學(xué)方法能夠簡(jiǎn)便且直觀地表征動(dòng)物行為偏好。雙瓶偏好實(shí)驗(yàn)是行為學(xué)研究中面對(duì)類(lèi)似問(wèn)題最常用的實(shí)驗(yàn)手段。例如利用野生小鼠、T1R3或TRPM5等基因敲除小鼠模型，并使用小鼠糖水偏好裝置，通過(guò)監(jiān)控相同時(shí)間內(nèi)小鼠對(duì)含甜味劑溶液和糖溶液的消耗量或計(jì)算動(dòng)物偏好指數(shù)（分析前100 次和后100 次動(dòng)物舔舐甜味劑占總舔舐次數(shù)的百分比），即可有效量化小鼠對(duì)甜味劑的行為偏好。

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)可以設(shè)計(jì)兩種實(shí)施策略：一種是以野生小鼠為動(dòng)物模型，監(jiān)測(cè)野生小鼠在葡萄糖和甜味劑之間的偏好選擇，如果小鼠在葡萄糖和甜味劑之間沒(méi)有行為偏好，則反映甜味劑和葡萄糖同樣具有激活腸-腦軸的能力（圖4）。另一種是以T1R3或TRPM5等基因敲除小鼠為動(dòng)物模型，監(jiān)測(cè)小鼠在水和甜味劑之間的偏好選擇。T1R3和TRPM5基因的敲除分別阻斷了甜味感知和甜味信號(hào)傳導(dǎo)的通路，小鼠依然能夠形成對(duì)糖的偏好。因此，如果基因敲除小鼠形成了對(duì)甜味劑的偏好，即可反映該甜味劑具有激活腸-腦軸的能力。

圖4 雙瓶偏好實(shí)驗(yàn)[18]Fig.4 Two-bottle preference experiment[18]

結(jié)合野生小鼠、T1R3敲除小鼠或TRPM5敲除小鼠等動(dòng)物模型，利用雙瓶偏好等行為學(xué)研究方法，能夠從功能層面有效評(píng)估新型甜味劑激活腸-腦軸的能力。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)具有設(shè)備要求低、實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)周期短等優(yōu)勢(shì)，是一種低成本高效率的甜味劑腸-腦軸激活能力評(píng)估方式。

2.2 利用腦區(qū)神經(jīng)活動(dòng)檢測(cè)的評(píng)估方式

糖類(lèi)可通過(guò)腸-腦軸激活中腦邊緣系統(tǒng)和黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)釋放DA產(chǎn)生獎(jiǎng)賞效應(yīng)；而人工甜味劑如三氯蔗糖等僅能通過(guò)口腔甜味受體激活中腦邊緣系統(tǒng)產(chǎn)生獎(jiǎng)賞效應(yīng)。因此，可以通過(guò)黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)多巴胺能神經(jīng)元的激活或DA的釋放特征評(píng)估甜味劑是否具有激活腸-腦軸的能力。目前針對(duì)DA獎(jiǎng)賞環(huán)路的研究較多，技術(shù)路線已經(jīng)較為成熟。

DA神經(jīng)元激活的研究方法常以DA受體標(biāo)記（DATCre）的轉(zhuǎn)基因小鼠為動(dòng)物模型，結(jié)合立體定位儀和微量注射裝置將能表征神經(jīng)元活動(dòng)的鈣熒光指示劑注射到黑質(zhì)致密部，將鈣熒光蛋白特異性地表達(dá)在黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元上，利用光纖記錄或雙光子鈣成像等技術(shù)手段監(jiān)控胃內(nèi)輸注甜味劑后多巴胺能神經(jīng)元（群體神經(jīng)元或單個(gè)神經(jīng)元）熒光強(qiáng)度的變化規(guī)律，從而反映甜味劑激活腸-腦軸的能力（圖5）。通過(guò)cNTS神經(jīng)元的激活也可以表征甜味劑是否具有激活腸-腦軸的能力，但孤束核位于腦干，相比于黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)操作難度較大。

圖5 以DAT-Cre小鼠為動(dòng)物模型利用光纖記錄甜味劑胃內(nèi)輸注后DA神經(jīng)元的活性[2]Fig.5 DAT-Cre mice as an animal model for fiber optic recording of DA neuron activity after intragastric infusion of sweeteners[2]

通過(guò)檢測(cè)黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)背側(cè)紋狀體區(qū)域DA的釋放是獎(jiǎng)賞環(huán)路研究另一個(gè)可選擇的技術(shù)。以C57BL/6小鼠（實(shí)驗(yàn)室最常用的小鼠品系）為動(dòng)物模型，將監(jiān)測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)釋放的DA探針表達(dá)在背側(cè)紋狀體神經(jīng)元上，利用光纖記錄手段，監(jiān)控胃內(nèi)輸注甜味劑后代表性神經(jīng)遞質(zhì)DA釋放熒光強(qiáng)度的變化規(guī)律，進(jìn)而反映甜味劑激活腸-腦軸的能力。

與行為學(xué)評(píng)估方法相比，利用腦區(qū)神經(jīng)活動(dòng)的評(píng)估方法能夠更為直觀地觀察到腦區(qū)神經(jīng)活動(dòng)，更加客觀地量化評(píng)價(jià)新型甜味劑腸-腦軸激活能力。但是，這些方法涉及到動(dòng)物手術(shù)和腦區(qū)神經(jīng)活動(dòng)監(jiān)控技術(shù)，對(duì)其及設(shè)備要求相對(duì)較高；同時(shí)，所使用的生物探針表達(dá)時(shí)間周期較長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)的時(shí)間成本也相對(duì)較高。

2.3 利用關(guān)鍵受體激活能力的評(píng)估方式

SGLT1受體是糖類(lèi)腸-腦軸信號(hào)產(chǎn)生的關(guān)鍵靶點(diǎn)，葡萄糖是SGLT1受體的特異性配體。葡萄糖通過(guò)與細(xì)胞表面的SGLT1受體結(jié)合可以引發(fā)胞內(nèi)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞活性的增加，導(dǎo)致胞內(nèi)鈣離子濃度增高。近年來(lái)，受體蛋白的高效異源表達(dá)技術(shù)取得了巨大進(jìn)步。異源表達(dá)細(xì)胞系統(tǒng)可以是人胚胎腎細(xì)胞（HEK-293）、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞（BHK）、綠猴腎細(xì)胞和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO）等[60-62]。當(dāng)前已有研究成功構(gòu)建了人胚胎腎細(xì)胞（HEK-293）SGLT家族中SGLT2基因異源表達(dá)體系[63]。因此，可以通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建SGLT1蛋白基因真核表達(dá)載體，向異源細(xì)胞系統(tǒng)插入表達(dá)SGLT1蛋白的基因，使細(xì)胞單一地表達(dá)SGLT1受體蛋白。進(jìn)一步運(yùn)用鈣離子成像技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，給予甜味劑刺激后通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞熒光變化，從而評(píng)估甜味劑對(duì)SGLT1的激活能力。

此外，腸道neuropod細(xì)胞表達(dá)SGLT1蛋白，葡萄糖可特異性地結(jié)合SGLT1蛋白激活neuropod細(xì)胞釋放谷氨酸[55,64]。因此可以通過(guò)甜味劑是否激活neuropod細(xì)胞釋放谷氨酸評(píng)估甜味劑激活腸-腦軸的能力。例如將表達(dá)谷氨酸熒光探針（iGluSnFR）的細(xì)胞（如HEK-293、BHK細(xì)胞等）和neuropod細(xì)胞共培養(yǎng)后加入甜味劑，利用激光掃描共聚焦顯微鏡可以實(shí)時(shí)觀察表達(dá)iGluSnFR細(xì)胞的熒光變化，以量化反映谷氨酸的釋放情況，從而判斷甜味劑是否具有激活腸-腦軸的能力（圖6）。

圖6 Neuropod細(xì)胞和表達(dá)谷氨酸熒光探針細(xì)胞共培養(yǎng)[55]Fig.6 The co-culture of neuropod cells and cells expressing iGluSnFR[55]

測(cè)定關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白激活能力能從更深層的角度（受體、分子）評(píng)估甜味劑激活腸-腦軸的能力，所涉及技術(shù)方法依賴(lài)于構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的異源SGLT1受體蛋白細(xì)胞株或從動(dòng)物的腸道分離出neuropod細(xì)胞。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)環(huán)境需要細(xì)胞培養(yǎng)間，并配備熒光共聚焦顯微鏡、細(xì)胞培養(yǎng)箱等一系列設(shè)備，同時(shí)要求實(shí)驗(yàn)人員具備專(zhuān)業(yè)的分子生物學(xué)技術(shù)背景和儀器操作技能。

3 結(jié)語(yǔ)

本文系統(tǒng)梳理了糖類(lèi)與甜味劑引發(fā)的動(dòng)物行為偏好差異、動(dòng)物腦區(qū)活動(dòng)差異和腸-腦軸神經(jīng)激活模式差異3 個(gè)方面的研究進(jìn)展，闡釋了大腦可以辨別糖和甜味劑使個(gè)體表現(xiàn)出行為偏好差異的根本原因?；谀c-腦軸效應(yīng)的宏觀表現(xiàn)和內(nèi)在機(jī)制，提出了利用動(dòng)物行為學(xué)表現(xiàn)、腦區(qū)神經(jīng)活動(dòng)和關(guān)鍵受體激活能力3 種技術(shù)手段完善甜味劑功能評(píng)估體系的建議。關(guān)注甜味劑的腸-腦軸效應(yīng)對(duì)于該領(lǐng)域的創(chuàng)新發(fā)展意義重大。