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    基于靜電相互作用的卵白蛋白與巖藻多糖相行為分析及流變學(xué)分析

    2024-05-20 07:17:06袁一心嵇競弘龔泠靈吳昕玲劉靜波尚曉敏
    食品科學(xué) 2024年9期
    關(guān)鍵詞:等電點(diǎn)鹽濃度濁度

    張 婷,袁一心,嵇競弘,龔泠靈,吳昕玲,劉靜波,尚曉敏

    (吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林省營養(yǎng)與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林 長春 130062)

    蛋白質(zhì)和多糖是食物中的兩種重要生物大分子,二者的相互作用可以調(diào)控食物結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定乳液、制備脂肪替代物和設(shè)計(jì)微膠囊等[1–4]。在水溶液中,蛋白質(zhì)與多糖通過靜電力驅(qū)動形成復(fù)合凝聚體[5-6]。靜電相互作用強(qiáng)度主要取決于蛋白質(zhì)和多糖的種類、電荷密度、分子質(zhì)量,以及溶液體系pH值、溫度、離子強(qiáng)度、蛋白質(zhì)/多糖復(fù)配比和生物聚合物濃度等[7-8],通過調(diào)節(jié)這些因素可以有效獲得多尺度的復(fù)合凝聚體。濁度滴定法常用于監(jiān)測不同pH值條件下蛋白質(zhì)/多糖復(fù)合凝聚相行為變化過程。隨著pH值降低,復(fù)合體系會經(jīng)歷3 個臨界pH值,對應(yīng)4 種不同的相行為:當(dāng)pH>pHc時,復(fù)合體系共溶;當(dāng)pHc<pH<pHφ1時,可溶性復(fù)合凝聚體形成;當(dāng)pHφ2<pH<pHφ1時,不溶性復(fù)合凝聚體發(fā)生宏觀相分離;當(dāng)pH<pHφ2時,復(fù)合凝聚體完全解離回到共溶狀態(tài)[5,9]。雖然蛋白質(zhì)和多糖之間的相互作用機(jī)制已被廣泛研究,但對于特定來源的蛋白質(zhì)和多糖,其復(fù)合凝聚相行為和凝聚體的結(jié)構(gòu)變化仍有較大差異。

    卵白蛋白(ovalbumin,OVA)是蛋清蛋白中含量最高的蛋白質(zhì)(約占54%)[10],由385 個氨基酸組成(分子質(zhì)量為45 kDa),是影響蛋清蛋白加工特性的主要物質(zhì)。研究者們針對不同種類的OVA/多糖復(fù)合體系開展了系統(tǒng)研究,闡明了復(fù)合體系的相行為及物性變化[9,11-12]。Niu Fuge等[13]發(fā)現(xiàn)添加阿拉伯膠顯著改善了OVA溶液的乳化穩(wěn)定性,這是由于OVA與阿拉伯膠相互作用產(chǎn)生了高電荷的表面層,靜電排斥減少了液滴之間的相互作用。Xiong Wenfei等[14]發(fā)現(xiàn)電荷密度較高的羧甲基纖維素可以增強(qiáng)復(fù)合體系的網(wǎng)絡(luò)交聯(lián)和黏彈性。綜上所述,蛋白質(zhì)和多糖之間的相互作用強(qiáng)度可以調(diào)控復(fù)合體系的結(jié)構(gòu),進(jìn)而影響復(fù)合體系的透明度、穩(wěn)定性和凝膠特性[15-16]。有研究發(fā)現(xiàn),硫酸化多糖(如硫酸葡聚糖和κ-卡拉膠等)可以調(diào)控蛋清蛋白分子的電荷密度和構(gòu)象,從而調(diào)節(jié)其加工特性[17-18]。但這些硫酸化多糖在食品加工的實(shí)際應(yīng)用中存在一定的問題,如硫酸葡聚糖不能用于食品加工;κ-卡拉膠是一種凝膠化多糖,在食品熱加工過程中會先于蛋白質(zhì)形成凝膠阻礙食品結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)。巖藻多糖(fucoidan,F(xiàn)UC)是一種天然的硫酸化多糖,具有無毒和高生物相容性的特點(diǎn),其碳鏈結(jié)構(gòu)主要由含有硫酸基團(tuán)的巖藻糖殘基組成[19]。FUC是一種高電荷的水溶性陰離子聚合物,在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[20-21],如抗傳染性非典型肺炎病毒、降血脂、抗動脈粥樣硬化等[22-23]。因此,OVA/FUC不僅可作為安全、大容量的載體用于靶向給藥,還可作為具有生物活性的營養(yǎng)物質(zhì)使用,在制備蛋白質(zhì)納米顆粒方面表現(xiàn)出充足的潛力[24]。目前針對FUC的研究仍局限于分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定、活性檢測等方面,而關(guān)于FUC調(diào)控蛋白質(zhì)物性變化的研究較少。

    目前針對OVA/FUC的相行為變化及相互作用機(jī)制鮮有研究,嚴(yán)重限制了OVA/FUC復(fù)合體系在食品加工中的應(yīng)用。因此,本研究采用濁度滴定法、Zeta電位測量等分析方法,測定OVA/FUC復(fù)合體系在不同蛋白質(zhì)/多糖復(fù)配比和鹽濃度下的相行為變化,明確二者復(fù)合凝聚的臨界pH值;利用圓二色光譜(circular dichroism,CD)、熒光光譜和流變學(xué)等手段,解析FUC對蛋白構(gòu)象和物性的影響,闡釋OVA和FUC相互作用的機(jī)制。以期為理解硫酸化多糖與蛋白質(zhì)相互作用機(jī)制奠定良好理論基礎(chǔ),并為開發(fā)基于硫酸化多糖/蛋白質(zhì)復(fù)合凝聚體的功能性食品提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    OVA(純度≥98%)美國Sigma-Aldrich公司;FUC(純度85%)北京源葉生物科技有限公司。其他試劑均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    UV-2550紫外-可見分光光度計(jì)、F-7000熒光分光光度計(jì) 日本島津公司;Discovery HR-1流變儀 美國TA儀器公司;MOS-450 CD儀 法國Bio-Logic公司;Starter2C pH計(jì) 奧豪斯儀器(上海)有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 OVA和FUC儲備液的制備

    準(zhǔn)確稱取適量OVA和FUC樣品分別溶解于去離子水中,制備得到質(zhì)量濃度為1 mg/mL的儲備液,在室溫條件下攪拌2 h后,置于4 ℃冰箱中過夜以保證樣品充分水合。添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%的疊氮化鈉溶液避免細(xì)菌生長。

    1.3.2 OVA/FUC復(fù)合物的制備

    將OVA與FUC的儲備液按不同質(zhì)量比(1∶1、5∶1、10∶1、20∶1和50∶1)進(jìn)行混合得到OVA/FUC復(fù)合溶液,同時保證復(fù)合溶液中生物聚合物的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%,此時溶液中的pH值為6.0。為了研究離子強(qiáng)度對OVA/FUC復(fù)合物形成的影響,向OVA/FUC復(fù)合溶液(20∶1)中添加不同質(zhì)量的NaCl得到不同鹽離子濃度(c(NaCl)=0、50、100、200、400 mmol/L)的OVA/FUC復(fù)合溶液。

    1.3.3 濁度測定

    利用濁度滴定法觀察樣品溶液復(fù)合凝聚過程中的濁度與pH值的關(guān)系。參照Yang Lan等[25]的方法,利用紫外-可見分光光度計(jì)在600 nm波長處對OVA/FUC復(fù)合溶液的濁度進(jìn)行表征,比色皿的夾縫寬度為1 cm。用HCl溶液(0.1、0.5、1.0 mol/L)將OVA/FUC復(fù)合物的pH值從6.0調(diào)整到2.0,溶液的pH值每變化0.25時,取樣進(jìn)行濁度測定,并記錄其對應(yīng)pH值。

    1.3.4 Zeta電位測定

    參考Liu Jingbo等[9]的方法,將OVA儲備液、FUC儲備液、不同質(zhì)量比(1∶1、5∶1、10∶1、20∶1和50∶1)的OVA/FUC復(fù)合溶液和不同鹽離子濃度(c(NaCl)=0、50、100、200、400 mmol/L)的OVA/FUC復(fù)合溶液稀釋10 倍后,利用激光納米粒度儀測定酸化過程中復(fù)合凝聚物表面的Zeta電位,平衡時間為120 s。

    1.3.5 內(nèi)源熒光光譜測定

    參照Antonov等[26]的方法,將不同pH值(4.5和6.0)樣品中的蛋白質(zhì)量濃度稀釋至0.5 mg/mL,在室溫條件下測定復(fù)合溶液熒光光譜。發(fā)射光譜范圍為300~450 nm,激發(fā)波長為270 nm,激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為3 nm,狹縫寬度為5 nm,激發(fā)電壓為400 V。

    1.3.6 CD測定

    根據(jù)Greenfield[27]的方法。將不同pH值(4.5和6.0)樣品中的蛋白質(zhì)量濃度稀釋到0.5 mg/mL,在室溫條件下用CD儀測定樣品溶液在200~250 nm范圍的CD。用不含蛋白質(zhì)溶液的光譜進(jìn)行校正。使用BESTSEL軟件(https://bestsel.elte.hu/index.php)分析光譜并對樣品二級結(jié)構(gòu)含量進(jìn)行計(jì)算。

    1.3.7 流變特性測定

    參照Wang Chenying等[28]的方法,使用配備直徑40 mm夾具的流變儀進(jìn)行流變測試。將大約1.5 mL樣品置于旋轉(zhuǎn)流變儀樣品盤上,夾具與樣品盤之間的間隙為1 mm,25 ℃穩(wěn)定30 min,以1%的應(yīng)變從0.1 rad/s到100 rad/s進(jìn)行頻率掃描得到樣品的儲能模量(G’)。

    1.4 數(shù)據(jù)處理和分析

    2 結(jié)果與分析

    2.1 OVA/FUC復(fù)合凝聚相行為分析

    2.1.1 pH值對OVA/FUC復(fù)合凝聚的影響

    多糖和蛋白質(zhì)之間產(chǎn)生復(fù)合凝聚現(xiàn)象是由于帶相反電荷的生物聚合物之間的靜電引力驅(qū)動[29]。復(fù)合體系的pH值是決定生物聚合物表面電荷密度的關(guān)鍵。如圖1所示,在酸性滴定過程中,OVA/FUC復(fù)合物的濁度明顯高于OVA或FUC單一溶液,這主要?dú)w因于靜電引力作用促進(jìn)了蛋白質(zhì)和多糖之間形成復(fù)合凝聚體。在酸滴定過程中單一的FUC溶液相對澄清,其濁度低且相對恒定,這歸因于FUC分子表面的硫酸基團(tuán)產(chǎn)生了抑制多糖分子間聚集的強(qiáng)靜電斥力[30]。OVA的濁度取決于pH值,在OVA的等電點(diǎn)(pH 4.72)附近達(dá)到最大。對于OVA/FUC復(fù)合物,有4 個關(guān)鍵的pH值臨界點(diǎn)(pHc、pHφ1、pHmax和pHφ2),pHc為濁度曲線斜率初次變化時的pH值,pHφ1是濁度曲線斜率突然增大時的pH值,pHmax是濁度達(dá)到峰值時的pH值,而pHφ2值是濁度曲線下降至穩(wěn)定時的pH值[5]。當(dāng)pH>pHc時,OVA與FUC在溶液中都帶負(fù)電,由于復(fù)合物之間的靜電排斥作用,OVA和FUC之間無法形成復(fù)合物(共溶區(qū))。當(dāng)pHφ1<pH<pHc時,復(fù)合溶液濁度開始增加,表明溶液中OVA和FUC形成了具有一定散射光線能力的可溶性復(fù)合物[31]。當(dāng)pH值高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時,依然可以通過靜電相互作用形成可溶性復(fù)合物,這主要是蛋白質(zhì)表面少量帶正電的氨基酸與聚陰離子多糖帶負(fù)電的硫酸基團(tuán)相互作用的結(jié)果,也稱之為“正電補(bǔ)丁”效應(yīng)[9]。隨著進(jìn)一步滴定,濁度急劇上升,當(dāng)pH<pHφ1時,出現(xiàn)明顯的相分離,形成不溶性復(fù)合凝聚體。OVA和FUC之間的靜電相互作用在pHmax時達(dá)到最強(qiáng),導(dǎo)致不溶性O(shè)VA/FUC復(fù)合凝聚體的積累量達(dá)到最大。而后,隨著pH值的不斷降低,由于多糖的質(zhì)子化,OVA/FUC復(fù)合凝聚物開始出現(xiàn)解離,乳濁液逐漸變澄清。但并未觀察到OVA/FUC復(fù)合凝聚物完全解離(即未出現(xiàn)pHφ2)[32]。主要原因在于含有硫酸基團(tuán)的FUC酸解離常數(shù)(pKa)較低,在強(qiáng)酸條件下仍然未被全部質(zhì)子化,因此即便在較低pH值時,OVA與FUC仍然存在強(qiáng)靜電吸引力,較難解離。OVA/硫酸葡聚糖互作體系及OVA/果膠體系在酸化過程中均存在類似現(xiàn)象[9,33]。

    圖1 OVA、FUC和OVA-FUC復(fù)合溶液濁度隨pH值的變化Fig.1 pH-Dependent changes in turbidity of OVA,FUC and OVA-FUC mixed solutions

    2.1.2 蛋白質(zhì)/多糖復(fù)配比對復(fù)合凝聚相行為的影響

    蛋白質(zhì)/多糖復(fù)配比是影響復(fù)合物形成的關(guān)鍵因素之一,對復(fù)合體系的臨界pH值影響顯著[34]。本研究進(jìn)一步探討了無鹽添加條件下OVA/FUC復(fù)配比對復(fù)合凝聚體形成的影響。如圖2所示,隨著OVA/FUC質(zhì)量比的增加(從1∶1增加至50∶1),OVA/FUC復(fù)合體系的濁度曲線逐漸趨于正態(tài)分布(圖2a),臨界pH值向更高pH值遷移(圖2b)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)/多糖質(zhì)量比為1∶1時,復(fù)合溶液濁度較低,表明FUC處于過量狀態(tài),體系內(nèi)蛋白分子可完全結(jié)合到糖鏈上,此時體系靜電斥力較強(qiáng),進(jìn)一步抑制了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)分子相互作用。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)/多糖質(zhì)量比從5∶1增加到50∶1時,復(fù)合溶液的濁度曲線逐漸呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,表明在較高蛋白質(zhì)濃度條件下促進(jìn)了復(fù)合凝聚體的形成,此時FUC糖鏈可結(jié)合多個OVA分子。圖2c為不同蛋白質(zhì)/多糖復(fù)配比復(fù)合凝聚物的外觀,質(zhì)量比為50∶1與20∶1的樣品隨著pH值降低出現(xiàn)了明顯的宏觀相分離,而在5∶1的體系中未觀測到類似現(xiàn)象。相分離由熱力學(xué)不相容而產(chǎn)生的排除體積效應(yīng)影響,而非絮凝作用[35]。綜上所述,當(dāng)OVA/FUC質(zhì)量比為20∶1時,OVA和FUC的結(jié)合達(dá)到飽和,二者在復(fù)合凝聚過程中形成最穩(wěn)定的復(fù)合凝聚體。

    圖2 不同生物聚合物質(zhì)量比OVA-FUC復(fù)合溶液的濁度(a)、臨界pH值(b)和外觀(c)隨pH值的變化Fig.2 pH-Dependent changes in turbidity (a),critical pH (b) and appearance (c) of OVA-FUC mixed solutions with different mass ratios

    2.1.3 離子強(qiáng)度對OVA/FUC復(fù)合凝聚的影響

    鹽離子可通過靜電屏蔽作用調(diào)控生物聚合物之間的相互作用。本實(shí)驗(yàn)以O(shè)VA/FUC質(zhì)量比20∶1為條件制備復(fù)合溶液,分析NaCl濃度對OVA與FUC復(fù)合凝聚過程的影響。如圖3a所示,隨著NaCl濃度的增加,復(fù)合體系的濁度曲線在pH<pHmax后逐漸趨于平緩。特別是當(dāng)鹽濃度大于50 mmol/L時,復(fù)合溶液的濁度曲線有一個較寬的平臺期。當(dāng)鹽濃度大于200 mmol/L時,濁度由于強(qiáng)靜電屏蔽效應(yīng)而顯著提升,溶液的表觀形貌進(jìn)一步證明了該變化趨勢(圖3a、c)。如圖3b所示,隨著鹽濃度的增加,pHc與pHφ1均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,而pHmax在鹽濃度提升至100 mmol/L時消失。這一現(xiàn)象可解釋為在低鹽濃度(0~100 mmol/L)條件下,鹽離子可在一定程度上提高生物聚合物的溶解度,促進(jìn)形成生物聚合物之間的靜電引力,誘導(dǎo)凝聚體形成。在高鹽濃度下,NaCl的競爭性吸附抑制了OVA和FUC之間的靜電引力,導(dǎo)致臨界pH值的降低。Liu Jingbo等[9]對OVA/硫酸葡聚糖的相行為研究中同樣觀測到類似變化趨勢。

    圖3 不同NaCl濃度OVA-FUC復(fù)合溶液的濁度(a)、臨界pH值(b)和外觀(c)隨pH值的變化Fig.3 pH-Dependent changes in turbidity (a),critical pH (b) and appearance (c) of OVA-FUC mixed solutions with different NaCl concentrations

    2.2 OVA/FUC復(fù)合凝聚物的Zeta電位分析

    靜電引力是水溶液中復(fù)合凝聚體形成的主要驅(qū)動力[36]。此外,蛋白質(zhì)和多糖的表面電荷種類與大小受溶液中環(huán)境條件的影響。通過測定OVA、FUC和OVA/FUC復(fù)合物的Zeta電位解析OVA/FUC復(fù)合物在復(fù)合凝聚過程中的靜電復(fù)合機(jī)理。如圖4a所示,在酸滴定過程中所有樣品的Zeta電位均逐漸增加。本研究中測得OVA的等電點(diǎn)為4.58,與之前的研究結(jié)果接近(等電點(diǎn)為4.5)[37]。當(dāng)溶液的pH值大于OVA的等電點(diǎn)時,OVA分子帶負(fù)電,溶液pH值小于OVA等電點(diǎn)時則帶正電。FUC的pKa值極低,因此FUC溶液在整個酸性滴定過程中帶較高的負(fù)電荷[24]。當(dāng)溶液pH值小于OVA等電點(diǎn)時,二者帶相反電荷,可在靜電引力的驅(qū)動下形成復(fù)合凝聚體。當(dāng)pH值從6.0降至5.0時,所有樣品的Zeta電位均未發(fā)生明顯變化,且?guī)в幸欢康呢?fù)電荷(Zeta電位<-20 mV),結(jié)合濁度滴定結(jié)果可知,可溶性復(fù)合物形成時(pH=pHφ1)體系的凈電荷相對較高。此外,當(dāng)溶液pH<5.0時,OVA/FUC復(fù)合物(質(zhì)量比為20∶1和50∶1)的表面電位迅速增加,在酸滴定過程中經(jīng)歷了從帶負(fù)電到帶正電的過程。同時,OVA/FUC復(fù)合物(質(zhì)量比為20∶1和50∶1)的等電點(diǎn)與pHmax幾乎相同(圖2a),表明當(dāng)OVA/FUC復(fù)合物的凈電荷接近0時,凝聚體的堆積量達(dá)到最大。另外,當(dāng)質(zhì)量比<20∶1時,過量的FUC導(dǎo)致復(fù)合物的Zeta電位增加幅度變小,在整個pH值范圍內(nèi)帶凈負(fù)電荷。這與2.1.2節(jié)的結(jié)果相吻合,在比例小于20∶1時沒有檢測到濁度的最大值。

    圖4 不同質(zhì)量比(a)和不同NaCl濃度(b)OVA/FUC復(fù)合物的Zeta電位變化Fig.4 Changes in zeta potential of OVA/FUC mixtures with different ratios (a) and different NaCl concentrations (b)

    不同鹽濃度的OVA/FUC溶液(質(zhì)量比為20∶1)中Zeta電位與pH值的關(guān)系如圖4b所示。在不含NaCl的溶液中,OVA/FUC的等電點(diǎn)為4.07。鹽離子的添加使復(fù)合物的等電點(diǎn)發(fā)生了輕微的左移,并且復(fù)合物的等電點(diǎn)隨著溶液中NaCl的濃度升高而降低,這是由于NaCl的靜電屏蔽作用[38]。在較高的離子強(qiáng)度下(c(NaCl)≥100 mmol/L),過量的離子屏蔽了聚合物的帶電活性位點(diǎn),OVA和FUC之間的靜電引力減少,這導(dǎo)致過多的硫酸基團(tuán)無法與陽離子氨基基團(tuán)結(jié)合。因此高NaCl濃度(c(NaCl)≥100 mmol/L)的復(fù)合溶液濁度在pH值小于OVA等電點(diǎn)時較高,且在低pH值時出現(xiàn)平臺期。此外,在整個pH值范圍內(nèi),OVA/FUC復(fù)合物Zeta電位絕對值與溶液中鹽濃度的變化趨勢相反。Zeta電位絕對的大小與系統(tǒng)的穩(wěn)定性有關(guān)[39],因此高鹽濃度會導(dǎo)致體系的穩(wěn)定性降低。Ding Lan等[40]也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果,NaCl的加入導(dǎo)致殼聚糖/酪蛋白混合物Zeta電位的降低,促進(jìn)了復(fù)合物聚集的形成,降低了復(fù)合物的穩(wěn)定性。綜上,靜電相互作用為OVA/FUC凝聚體形成的主導(dǎo)力,且當(dāng)復(fù)合物的濁度達(dá)到峰值(pHmax)時,OVA與FUC帶有相反電荷。

    2.3 OVA/FUC復(fù)合體內(nèi)蛋白質(zhì)構(gòu)象解析

    2.3.1 內(nèi)源熒光光譜分析

    在蛋白質(zhì)/多糖復(fù)合體系中,蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)變化與二者的復(fù)合凝聚過程密切相關(guān)。本研究進(jìn)一步分析OVA與FUC在共溶區(qū)間(pH 6.0)和靜電復(fù)合凝聚區(qū)間(pH 4.5)條件下的熒光光譜。由圖5a可知,pH 6.0條件下復(fù)合物的熒光強(qiáng)度峰值改變,表明OVA分子的內(nèi)部構(gòu)象發(fā)生了變化。與單一OVA溶液相比,少量FUC加入(質(zhì)量比為10∶1、20∶1、50∶1)使OVA熒光光譜出現(xiàn)一定程度的猝滅。然而,當(dāng)復(fù)合體系中的FUC過量時(質(zhì)量比為5∶1、1∶1),OVA的熒光強(qiáng)度峰值顯著提高,這表明蛋白質(zhì)內(nèi)部熒光基團(tuán)周圍微環(huán)境的極性增加和疏水性降低[41]。在pH 4.5時,OVA及OVA/FUC復(fù)合物的熒光強(qiáng)度顯著提升(圖5b),這與酸性條件下蛋白質(zhì)分子展開導(dǎo)致熒光基團(tuán)暴露有關(guān)[42]。值得注意的是,當(dāng)OVA/FUC的質(zhì)量比為5∶1和1∶1時,OVA熒光強(qiáng)度的最大值提升了5 倍。由相行為和Zeta電位結(jié)果可知,pH 4.5條件下質(zhì)量比為5∶1和1∶1的OVA/FUC復(fù)合物處于可溶性復(fù)合凝聚體區(qū),此時復(fù)合體系中過量的聚陰離子抑制了OVA的聚集,使OVA分子在酸性條件下充分展開,熒光基團(tuán)大量暴露[43],從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度顯著提高。此外,在共溶區(qū)間內(nèi)FUC所有比例的復(fù)合均使OVA熒光峰值發(fā)生了明顯的紅移,這是由于OVA/FUC復(fù)合物的形成可能改變了OVA內(nèi)部色氨酸殘基所處的極性疏水微環(huán)境[44],說明疏水相互作用也參與了OVA/FUC復(fù)合物的形成。

    圖5 不同生物聚合物比例下OVA/FUC復(fù)合物在pH 6.0(a)與pH 4.5(b)條件下的熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectra of OVA/FUC mixtures with different ratios at pH 6.0 (a) and pH 4.5 (b)

    2.3.2 CD分析

    為進(jìn)一步分析OVA與FUC復(fù)合凝聚過程中二者之間相互作用的分子機(jī)制,測定在pH 6.0與pH 4.5條件下不同比例OVA/FUC復(fù)合物的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化,結(jié)果如圖6所示。蛋白質(zhì)中α-螺旋的特征峰位于約208 nm和222 nm波長處,β-折疊和β-轉(zhuǎn)角的特征峰位于約216 nm和206 nm波長處[27]。如圖6a、b所示,單一OVA的光譜峰值位于約222 nm,F(xiàn)UC的加入使所有樣品的光譜峰發(fā)生了不同程度的藍(lán)移,表明OVA/FUC復(fù)合物中蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。在pH 6.0的復(fù)合溶液中,少量FUC的加入降低了OVA光譜峰的強(qiáng)度(質(zhì)量比≥10∶1)。相反,過量的FUC會導(dǎo)致OVA光譜的峰值增大(質(zhì)量比<10∶1)。而當(dāng)復(fù)合溶液的pH值為4.5時,任何添加量的FUC均會使OVA光譜峰的強(qiáng)度降低,此時OVA的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化。由此可見,F(xiàn)UC的復(fù)合凝聚改變了OVA的二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象(α-螺旋與β-折疊)[45]。

    圖6 OVA和OVA/FUC復(fù)合溶液在pH 6.0(a、c)和pH 4.5(b、d)時的CD及其二級結(jié)構(gòu)的相對含量Fig.6 Circular dichrogram spectra and relative contents ofsecondary structure of OVA and OVA/FUC mixtures at pH 6.0 (a and c) and pH 4.5 (b and d)

    為了進(jìn)一步量化FUC復(fù)合對OVA二級結(jié)構(gòu)的影響,使用BESTSEL軟件分析了蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的含量,結(jié)果如圖6c、d所示。當(dāng)pH 6.0時,F(xiàn)UC的添加對OVA的二級結(jié)構(gòu)的影響不顯著。當(dāng)pH 4.5時,F(xiàn)UC的存在使OVA的α-螺旋含量下降而β-折疊含量上升,這表明添加FUC后OVA分子發(fā)生了一定程度的解螺旋。此外,F(xiàn)UC對OVA的解螺旋效應(yīng)在50∶1時達(dá)到最大值,而在1∶1時達(dá)到最小值,該變化歸因于溶液中過量的陰離子對OVA二級結(jié)構(gòu)變化的抑制作用。Zhang Ting等[43]在蛋清蛋白與硫酸葡聚糖的相互作用研究中也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象。Tang Honggang等[46]同樣發(fā)現(xiàn)帶有硫酸基團(tuán)卡拉膠的復(fù)合作用促進(jìn)了蛋清蛋白分子α-螺旋向β-折疊的轉(zhuǎn)變。然而大量研究表明,除硫酸化多糖外的其他陰離子多糖(如羧甲基纖維素)與蛋白質(zhì)的靜電復(fù)合對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)無顯著影響,這一現(xiàn)象可能與多糖中的硫酸基團(tuán)有關(guān)。

    2.4 OVA/FUC復(fù)合凝聚體流變學(xué)特性分析

    為更深入地了解OVA/FUC凝聚體的宏觀特性,利用頻率掃描進(jìn)一步探究了在pH 4.5條件下NaCl濃度和OVA/FUC質(zhì)量比對凝聚體黏彈性的影響。儲能模量(G’)反映復(fù)合體系的黏彈性,是溶液中大分子相互交聯(lián)形成大尺寸聚集體的結(jié)果[47]。如圖7a所示,復(fù)合溶液的G’隨著FUC的添加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,且在OVA/FUC質(zhì)量比為20∶1時達(dá)到最大值,表明在該條件下復(fù)合溶液中蛋白質(zhì)分子間的交聯(lián)程度達(dá)到最大,聚集體的尺寸達(dá)到最大。相反,當(dāng)質(zhì)量比為5∶1或1∶1時,OVA/FUC復(fù)合物的G’遠(yuǎn)低于OVA,這一結(jié)果與相行為結(jié)果基本相符,此條件下的OVA/FUC復(fù)合物處于可溶性復(fù)合凝聚階段和共溶階段,體系中大量的聚陰離子阻礙了蛋白質(zhì)分子的進(jìn)一步聚集。Niu Fuge等[48]研究表明,由于空間位阻效應(yīng),高度支化的多糖在混合體系中比線性大分子難以形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)。因此,過多的FUC削弱了復(fù)合體的復(fù)合凝聚過程中的聚集行為。不同鹽濃度下的流變結(jié)果表明,隨著鹽濃度的增加,樣品的G’呈現(xiàn)先減小后增加的趨勢(圖7b)。這可能是由于在pH 4.5溶液體系中少量鹽的加入會抑制OVA與FUC之間的相互作用,削弱復(fù)合物的相互交聯(lián)。在50 mmol/L的NaCl濃度下,體系的G’最低。然而,當(dāng)NaCl濃度達(dá)到400 mmol/L時,OVA/FUC凝聚體的G’達(dá)到最大值。這可能是由于高鹽促進(jìn)了OVA分子的變性,從而促進(jìn)了OVA分子間的聚集。這些結(jié)果與濁度和Zeta電位隨離子強(qiáng)度的變化基本一致。綜上所述,體系中過量蛋白質(zhì)或多糖的存在影響凝聚體的G’,這歸因于體系的排斥力和空間位阻效應(yīng)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)/多糖結(jié)合接近飽和時,復(fù)合體系作為一個電中性的整體,分子間排斥力最小,導(dǎo)致OVA/FUC質(zhì)量比為20∶1的復(fù)合物表現(xiàn)出最高的G’。

    圖7 pH 4.5條件下不同質(zhì)量比(a)和NaCl濃度(b)的OVA/FUC復(fù)合溶液的G’Fig.7 G’ of OVA/FUC mixtures with different mass ratios (a) and NaCl concentrations (b) at pH 4.5

    3 結(jié)論

    本實(shí)驗(yàn)探究了pH值、離子強(qiáng)度和生物聚合物質(zhì)量比對OVA和FUC復(fù)凝聚相行為的影響。隨著OVA/FUC復(fù)配比的增加,可以與FUC結(jié)合的OVA分子數(shù)量增加,復(fù)合物的臨界pH值(pHc和pHφ1)向高pH值方向移動。當(dāng)OVA/FUC的質(zhì)量比從1∶1增加到5∶1時,由于OVA和FUC之間強(qiáng)烈的靜電相互作用,沒有出現(xiàn)明顯的pHmax。形成復(fù)合物的最佳OVA/FUC質(zhì)量比是20∶1,它表現(xiàn)出最高的濁度,且具有較高的儲能模量。OVA和FUC之間的靜電相互作用具有顯著的鹽離子依賴性。當(dāng)鹽的濃度小于100 mmol/L時,復(fù)合物的臨界pH值向更高的pH值方向移動,表明低鹽離子濃度可促進(jìn)復(fù)合凝聚體的形成。然而當(dāng)鹽濃度大于100 mmol/L時,靜電屏蔽效應(yīng)會改變OVA與FUC之間的靜電復(fù)合狀態(tài),臨界pH值顯著下降。同時,F(xiàn)UC的加入改變了OVA蛋白質(zhì)的分子構(gòu)象,促進(jìn)了OVA的解螺旋和三級結(jié)構(gòu)的展開。綜上所述,通過改變OVA和FUC溶液的復(fù)合條件可以調(diào)控二者的復(fù)合凝聚特性,本研究可為設(shè)計(jì)基于OVA/FUC復(fù)合物的新型水凝膠和功能性納米載體奠定理論基礎(chǔ)。

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