一種功能性奶粉對生長期大鼠骨健康的影響

于夢淇,黃淑貞,劉雨菲,曹莉,劉艷,張立實,馮昊天*,陳錦瑤*

1(四川大學 華西公共衛(wèi)生學院/華西第四醫(yī)院,四川 成都,610041)2(四川省食品安全監(jiān)測與風險評估重點實驗室,四川 成都,610041)3(國家乳業(yè)技術創(chuàng)新中心,內(nèi)蒙古 呼和浩特,010080)

骨骼在體內(nèi)起著維持機體運動功能、保護內(nèi)臟、調(diào)節(jié)礦物質穩(wěn)態(tài)等重要作用,維持骨骼健康對于機體健康至關重要[1]。骨健康與基因、年齡、激素、膳食等多種因素有關[2]。合理膳食對維持骨健康至關重要[3]。鈣、維生素D和維生素K的攝入已被證實有利于骨骼發(fā)育,缺乏會減慢兒童青少年期的骨量增加,影響峰值骨量,并導致中老年人骨質疏松風險升高[4-7]。兒童青少年期的高峰值骨量能夠提供更大的骨量儲備,有效降低老年期骨質疏松癥和骨折的發(fā)生風險[8]。目前我國兒童鈣攝入不足的情況依然嚴峻[9-10],因此提高兒童期鈣攝入量及其生物利用度是改善全年齡周期人群骨健康的有效途徑。

骨碎補(DrynariaeRhizoma)是植物槲蕨Drynariafortunei(Kunze) J.Sm.的干燥根莖,主要活性成分包括黃酮類、甾體類、苯丙素類、三萜類、酚酸類等,其中柚皮苷是主要活性物質,具有抗骨質疏松、抗炎、抗氧化應激、抗細胞凋亡等作用[11-12]。動物研究結果表明,骨碎補可有效抑制大鼠的骨質流失[13]、促進骨折愈合[14-16]、治療糖皮質激素引起的骨質疏松癥[17-18]、預防骨質疏松癥的發(fā)生[19-20]。骨碎補屬于可用于保健食品的中藥之一,但尚無添加了骨碎補的奶粉對于骨骼健康的促進作用的研究。奶粉是鈣的良好來源,是日常促進骨健康的重點關注食品種類,將骨碎補加入其中有望更好的提高鈣的生物利用度,更有效地促進骨骼健康。

因此,本研究參考《保健食品功能檢驗與評價方法(2023年版)》中有助于改善骨密度檢驗方法中的方案一,以低鈣飼料為基礎飼料,采用碳酸鈣作為陽性對照,同時給予不同劑量的添加了骨碎補的奶粉,初步探索強化了鈣、維生素D和維生素K2且添加了骨碎補的奶粉對生長期大鼠骨健康的影響,為骨碎補在奶粉中的應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試物

碳酸鈣,分析純,成都科隆化工有限公司;受試奶粉,國家乳業(yè)技術創(chuàng)新中心提供,每100 g奶粉含有鈣960～1 440 mg,維生素D 16～24 μg,維生素K280～120 μg,骨碎補提取物0.5～1.0 g,人體推薦劑量為每日50 g奶粉。

1.2 實驗動物

50只出生4周左右的斷乳SPF級雌性SD大鼠,體重60～80 g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,許可證號為SCXK(京)2021—0011。大鼠飼養(yǎng)于四川大學華西公共衛(wèi)生學院屏障級動物房[許可證號為SYXK(川)2023—0011]。飼養(yǎng)環(huán)境:20～26 ℃,相對濕度40%～70%,明暗交替周期為12 h,自由飲水(去離子水)和攝食。本研究采用的基礎低鈣飼料參照《保健食品功能檢驗與評價方法(2023年版)》中有助于改善骨密度檢驗方法中的方案一的基礎飼料配制,鈣的含量為150 mg/100 g飼料,購自四川省醫(yī)學科學院。本研究經(jīng)四川大學華西第四醫(yī)院/華西公共衛(wèi)生學院倫理委員會批準(批件號:Gwll2023002)。

1.3 實驗動物分組及處理

適應性喂養(yǎng)1周后,50只大鼠按照體重水平隨機分為5組,每組10只,分別為低鈣對照組、碳酸鈣對照組、奶粉低劑量組(人體推薦量的2.5倍)、奶粉中劑量組(人體推薦量的5倍)和奶粉高劑量組(人體推薦量的10倍)。受試奶粉的人體推薦劑量為每日50 g,成人體重以60 kg計,則每日推薦劑量為0.833 g/kg BW,即奶粉低、中、高劑量組對應的劑量分別為2.083 g/kg BW、4.167 g/kg BW和8.333 g/kg BW。碳酸鈣對照組的鈣含量等同于奶粉高劑量組的鈣含量,而奶粉高劑量組每只大鼠每日從奶粉中攝入的鈣含量為84.497 mg/kg BW,換算成碳酸鈣為211.243 mg/kg BW,因此碳酸鈣對照組的干預劑量設定為211.243 mg/kg BW。各組受試物溶于純水配制,經(jīng)口灌胃給予受試物,灌胃量為1.5 mL/100 g BW,低鈣對照組灌胃給予相同體積純水,連續(xù)90 d。

1.4 主要儀器與試劑

BSA224S分析天平,德國賽多利斯公司;5424R高速冷凍離心機,德國艾本德Eppendorf公司;FZ366電熱恒溫鼓風干燥箱,黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司;discovery QDR雙能X射線骨密度儀,美國豪洛捷公司;5100電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀,美國安捷倫公司;SkyScan 1276型Micro-CT儀,德國布魯克公司;RT-6100全自動酶標儀,美國杜雷公司;Contr AA700型原子吸收分光光度儀,德國耶拿ZEEnit公司;Pannoramic 250數(shù)字切片掃描儀,匈牙利3DHISTECH公司。

4%多聚甲醛溶液,Biosharp公司;生理鹽水,四川科倫藥業(yè)股份有限公司;體積分數(shù)為75%的酒精,成都金山化學試劑有限公司;硝酸、鹽酸,均為分析純,成都科隆化工有限公司;ELISA試劑盒,上海酶聯(lián)生物科技有限公司;抗酒石酸堿性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)染色試劑盒,武漢塞維爾生物科技有限公司。

1.5 實驗方法

1.5.1 體重和一般情況

記錄大鼠初始體重和干預結束后的空腹體重,干預期內(nèi)每隔7 d稱量1次體重。每天觀察大鼠的軀體運動、食欲、毛色等一般情況。

1.5.2 股骨常規(guī)指標

處死大鼠后,分離右側股骨,去除表面附著的肌肉和軟組織等,置于105 ℃干燥箱中烘干,用游標卡尺測量股骨長并稱量股骨干重。

1.5.3 骨密度和骨鈣測定

取右側股骨于雙能X射線骨密度儀中測量股骨中點及遠心端的骨密度值(bone mineral density, BMD),濕法消化后,用原子吸收法測定骨鈣含量。

1.5.4 鈣代謝實驗

干預期結束前3 d,每組隨機選取8只大鼠進行鈣代謝實驗。每只大鼠單獨飼養(yǎng)于代謝籠中,記錄3 d的進食量,收集尿液和糞便并記錄排出量。濕法消化后,采用原子吸收法測定飼料、尿液和糞便中的鈣含量,并按公式(1)和公式(2)計算大鼠的鈣吸收率和鈣儲留率:

(1)

(2)

1.5.5 血清骨代謝標志物檢測

大鼠腹主動脈采血,于4 ℃、3 500 r/min離心15 min后分離血清,采用ELISA試劑盒檢測血清中Ⅰ型膠原C端交聯(lián)肽(C-telopeptide of type Ⅰ collagen, CTX-Ⅰ)、Ⅰ型前膠原氨基端原肽(procollagen type Ⅰ amino-terminal peptide, PINP)和骨鈣素(osteocalcin, BGP)的水平。

1.5.6 股骨TRAP染色

取掃描后的左側股骨用150 g/L EDTA脫鈣,脫鈣后脫水、石蠟包埋、切片、TRAP染色,在顯微鏡下觀察切片染色情況并用數(shù)字切片掃描儀進行圖像采集,分析破骨細胞數(shù)量。酸性磷酸酶活性處呈酒紅色為陽性表達。

1.5.7 股骨Micro-CT檢測

處死后,取大鼠左側股骨,剔除肌肉和軟組織后置于4%多聚甲醛溶液中固定,4 ℃冰箱保存。每組隨機選取5只大鼠的左側股骨進行掃描,具體分析參數(shù)包括BMD、骨體積分數(shù)(bone volume fraction, BV/TV)、骨表面積骨體積比(specific bone surface, BS/BV)、骨表面積組織體積比(bone surface density, BS/TV)、骨小梁模型因子(trabecular pattern factor, Tb.Pf)、結構模型指數(shù)(structure model index, SMI)、骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)、骨小梁數(shù)目(trabecular number, Tb.N)和骨小梁分離度(trabecular separation, Tb.Sp)。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 26.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析,采用GraphPad Prism 8.0.1軟件進行圖像繪制,結果以均數(shù)±標準差表示。數(shù)據(jù)先進行正態(tài)性和方差齊性檢驗,采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD檢驗進行組間差異比較,不服從方差齊性的數(shù)據(jù)采用Tamhane’s T2法進行分析,檢驗水準α=0.05。

2 結果與分析

2.1 大鼠體重及一般情況

灌胃90 d期間,除低鈣對照組外,各組大鼠的一般情況良好,食欲、毛發(fā)、對外界反應等均正常,奶粉組大鼠更活潑好動。低鈣對照組在灌胃2周后出現(xiàn)明顯的脫毛現(xiàn)象,但未見其他不良反應。各組大鼠大體解剖未見異常。各組大鼠體重變化曲線如圖1所示,灌胃期間,各組大鼠體重穩(wěn)步增加,低鈣對照組大鼠的體重整體增長較少,從灌胃14 d起,奶粉各劑量組大鼠的體重均顯著高于低鈣對照組(P<0.05或P<0.01)。從灌胃28 d起,奶粉各劑量組大鼠的體重均顯著高于碳酸鈣對照組(P<0.05或P<0.01)。提示低鈣攝入不利于生長期大鼠體重增長,而補充受試奶粉可有效促進生長期大鼠的體重增長。

圖1 各組大鼠體重變化曲線(n=10)Fig.1 Body weight change curve of rats in each group (n=10)

2.2 股骨常規(guī)指標

各組大鼠的股骨常規(guī)指標結果如圖2所示。與低鈣對照組相比,碳酸鈣對照組與奶粉各劑量組的股骨干重均顯著增加(P<0.01);與碳酸鈣對照組相比,奶粉中劑量組(P<0.05)和高劑量組(P<0.01)的股骨干重顯著增加,且奶粉各劑量組的股骨干重隨著劑量升高而逐漸增加(P<0.05)。碳酸鈣對照組(P<0.05)和奶粉各劑量組(P<0.01)的股骨長均顯著高于低鈣對照組,奶粉中劑量組(P<0.01)和高劑量組(P<0.05)的股骨長顯著高于碳酸鈣對照組,表明低鈣攝入不利于生長期大鼠股骨正常發(fā)育,而受試奶粉可彌補低鈣導致的不良影響,且中和高劑量時的效果優(yōu)于與高劑量組同等劑量碳酸鈣的效果。

a-股骨干重;b-股骨長

2.3 BMD和骨鈣

如圖3所示,碳酸鈣對照組和奶粉各劑量組大鼠的股骨遠心端BMD和股骨中點BMD均顯著高于低鈣對照組(P<0.01);奶粉高劑量組的BMD均顯著高于碳酸鈣對照組(P<0.01);奶粉各劑量組的骨密度隨著劑量升高而逐漸增加(P<0.01)。奶粉各劑量組的骨鈣含量均顯著高于低鈣對照組(P<0.01),奶粉高劑量組的骨鈣含量顯著高于碳酸鈣對照組(P<0.01),表明碳酸鈣和受試奶粉可有效減輕低鈣攝入對生長期大鼠股骨骨量和骨鈣含量的負面影響,且高劑量組奶粉的效果最優(yōu)。

a-股骨遠心端BMD;b-股骨中點BMD;c-股骨骨鈣

2.4 鈣代謝實驗

如圖4所示,奶粉低和中劑量組的鈣吸收率和鈣儲留率顯著高于碳酸鈣對照組(P<0.01)。碳酸鈣對照組和奶粉高劑量組的鈣吸收率和鈣儲留率顯著低于低鈣對照組(P<0.05,P<0.01),提示在實驗末期兩組體內(nèi)鈣負荷可能已較飽和。

圖4 各組大鼠的鈣吸收率和鈣儲留率情況(n=8)Fig.4 Calcium absorption rate and calcium retention rate of rats in each group (n=8)

2.5 奶粉對大鼠血清骨代謝標志物的影響

如圖5所示,碳酸鈣對照組和奶粉各劑量組的CTX-Ⅰ水平均顯著高于低鈣對照組(P<0.01),奶粉中和高劑量組的CTX-Ⅰ水平顯著高于碳酸鈣對照組(P<0.01)。碳酸鈣對照組和奶粉各劑量組的PINP水平均顯著高于低鈣對照組(P<0.01),奶粉中劑量組的PINP水平顯著高于碳酸鈣對照組(P<0.01)。奶粉高劑量組的PINP/CTX-Ⅰ比值顯著低于低鈣對照組(P<0.01)。碳酸鈣對照組和奶粉各劑量組的BGP水平均顯著高于低鈣對照組(P<0.01),奶粉中劑量組和高劑量組的BGP水平顯著高于碳酸鈣對照組(P<0.05,P<0.01)。上述結果表明,受試奶粉可同時促進大鼠骨形成和骨吸收,即骨代謝加速,但更顯著地促進骨形成。

a-CTX-Ⅰ水平;b-PINP水平;c-PINP/CTX-Ⅰ比值;d-BGP水平

2.6 奶粉對大鼠股骨TRAP染色結果的影響

如圖6所示,碳酸鈣對照組、奶粉中和高劑量組的破骨細胞數(shù)量均顯著低于低鈣對照組(P<0.05或P<0.01),奶粉高劑量組的破骨細胞數(shù)量顯著低于碳酸鈣對照組(P<0.01),且奶粉中和高劑量組的破骨細胞數(shù)量顯著低于低劑量組(P<0.01)。

圖6 各組大鼠的破骨細胞數(shù)量(n=5)Fig.6 The number of osteoclasts of rats in each group (n=5)

各組TRAP染色典型示意圖顯示(圖7),低鈣對照組呈現(xiàn)酒紅色的破骨細胞數(shù)量明顯更多,其余各組酒紅色的破骨細胞數(shù)量均有不同程度地減少。

圖7 各組大鼠的TRAP染色典型示意圖(×400)Fig.7 Typical diagram of TRAP staining of rats in each group (×400)

2.7 奶粉對大鼠股骨Micro-CT結果的影響

各組Micro-CT典型示意圖(圖8)結果顯示,低鈣對照組明顯骨小梁更加稀疏,數(shù)量較少,而碳酸鈣對照組和奶粉各組骨小梁數(shù)量均有不同程度地增加,其中高劑量組尤為顯著。

a-Micro-CT的感興趣區(qū)域(region of interest, ROI)及各部位指示圖;b-各組大鼠股骨Micro-CT典型示意圖(第一行-股骨矢狀位3D重建圖,第二行-股骨縱切面掃描圖)

如表1所示,碳酸鈣對照組、奶粉中和高劑量組大鼠的BMD顯著高于低鈣對照組(P<0.01),奶粉高劑量組的BMD顯著高于碳酸鈣對照組(P<0.01)。奶粉中和高劑量組的BV/TV顯著高于低鈣對照組(P<0.05,P<0.01)且奶粉高劑量組的BV/TV顯著高于碳酸鈣對照組(P<0.01)。碳酸鈣對照組、奶粉中和高劑量組大鼠的BS/BV顯著低于低鈣對照組(P<0.01),奶粉低和中劑量組的BS/BV顯著高于碳酸鈣對照組(P<0.01,P<0.05)。奶粉高劑量組的BS/TV顯著高于低鈣對照組和碳酸鈣對照組(P<0.01)。碳酸鈣對照組、奶粉中和高劑量組大鼠的Tb.Pf顯著低于低鈣對照組(P<0.01),奶粉低劑量組的Tb.Pf顯著高于碳酸鈣對照組(P<0.05)。碳酸鈣對照組和奶粉高劑量組的SMI顯著低于低鈣對照組(P<0.05,P<0.01)且奶粉高劑量組的SMI顯著低于碳酸鈣對照組(P<0.05)。奶粉高劑量組的Tb.N顯著高于低鈣對照組和碳酸鈣對照組(P<0.01)。各組大鼠的Tb.Th和Tb.Sp之間的差異無統(tǒng)計學意義。

表1 各組大鼠股骨骨微結構參數(shù)結果(n=5)Table 1 Results of the bone microarchitecture of the femur in rats of each group (n=5)

3 結論與討論

本研究參考《保健食品功能檢驗與評價方法(2023年版)》中有助于改善骨密度檢驗方法,對受試奶粉促進生長期大鼠骨骼發(fā)育的作用進行了評價。本研究采用低鈣飼料作為基礎飼料構建大鼠低鈣模型。

在本研究中,碳酸鈣對照組和奶粉各劑量組的股骨干重和股骨長均顯著高于低鈣對照組,且奶粉中和高劑量組的股骨干重和股骨長顯著高于碳酸鈣對照組,說明補充碳酸鈣和奶粉可有效彌補低鈣對大鼠股骨發(fā)育的不良影響。骨密度可反映骨骼堅硬程度,是診斷骨質疏松癥的主要參數(shù),也是評價干預措施對骨組織骨健康改善程度的主要指標[21]。當機體鈣攝入量持續(xù)不足時,骨吸收增加,骨鈣含量下降,骨鈣被釋放入血以維持循環(huán)鈣濃度[3]。本研究結果顯示,碳酸鈣對照組和奶粉各劑量組的股骨遠心端和中點骨密度以及骨鈣含量均顯著高于低鈣對照組,且奶粉高劑量組的骨密度和骨鈣含量均顯著高于碳酸鈣對照組,表明補充受試奶粉有利于低鈣攝入的生長期大鼠的骨骼健康,且奶粉劑量越高增加骨密度的效果越明顯,且效果優(yōu)于同等劑量的碳酸鈣。

當機體鈣攝入不足時,血鈣濃度下降,甲狀旁腺激素的合成和釋放增加,代償性地提高機體對鈣的吸收和利用,包括促進腎小管對鈣的重吸收、增加腸道的鈣吸收以及釋放骨鈣入血,導致鈣的吸收率高于正常水平[3, 22-23],且研究表明,鈣攝入劑量過高反而會降低機體對鈣的吸收率和儲留率[24]。鈣代謝實驗結果顯示,低鈣對照組的糞鈣和尿鈣排出量均下降而鈣吸收率和鈣儲留率均上升,說明低鈣攝入代償性地增加了大鼠對鈣的吸收利用率,這與本課題組此前的研究結果一致[25],且碳酸鈣對照組和奶粉高劑量組的鈣吸收率和鈣儲留率顯著低于低鈣對照組,符合上述研究結果。此外,王燦楠等[26]的結果表明,攝入鈣與骨密度和骨鈣含量呈正相關,而與鈣吸收率和儲留率呈負相關。在本研究中,碳酸鈣對照組和奶粉各劑量組大鼠的攝入鈣均顯著高于低鈣對照組,而碳酸鈣對照組和奶粉高劑量組的鈣吸收率和鈣儲留率顯著低于低鈣對照組,且奶粉低和中劑量組的鈣吸收率和鈣儲留率顯著高于碳酸鈣對照組,與前述結果相符。

血清PINP是在I型膠原蛋白合成過程中產(chǎn)生的,其水平與骨形成的組織形態(tài)計量學指標顯著相關[27],BGP是骨骼中最豐富的非膠原蛋白,在成骨細胞中特異性表達[28],兩者均為骨形成標志物,可反映成骨細胞活性及骨轉換情況。血清CTX-Ⅰ水平與骨吸收的組織形態(tài)計量學指標顯著相關,是骨吸收的標志物,反映破骨細胞活性[27, 29]。本研究結果表明,碳酸鈣對照組和奶粉各劑量組的CTX-Ⅰ、PINP及BGP水平均顯著高于低鈣對照組,提示受試奶粉對大鼠的骨形成和骨吸收均有促進作用。PINP/CTX比值被稱為骨形成指數(shù)[30],該值升高與老年女性骨質疏松椎體骨折發(fā)生有關[31]。在本研究中,奶粉高劑量組的PINP/CTX-Ⅰ顯著低于其余各組,提示受試奶粉更傾向于促進大鼠的骨形成。

TRAP染色可反映各組破骨細胞的數(shù)量。本研究結果表明,碳酸鈣對照組、奶粉中和高劑量組的破骨細胞數(shù)量均顯著低于低鈣對照組,且奶粉各劑量組的破骨細胞數(shù)量隨著劑量增加而減少,說明受試奶粉可抑制大鼠破骨細胞的生成,這與前人對骨碎補的研究結果一致[32]。結合血清生化指標可進一步說明受試奶粉通過促進大鼠骨形成和抑制破骨細胞生成發(fā)揮促進大鼠骨健康的作用。

Micro-CT可在不損傷樣本的情況下將骨微結構參數(shù)準確、快速地定量,已被廣泛應用于骨微結構的評價中[33]。BV/TV表示骨體積與ROI總體積的比值,可反映骨量變化,該值增高說明骨量增加。BS/BV和BS/TV分別表示單位體積骨組織的面積大小以及骨表面積與感興趣區(qū)域總體積的比值,均可間接反映骨量。Tb.Pf和SMI分別用于衡量骨小梁的表面凹凸程度和反映骨小梁結構中板層結構和桿狀結構的比例,共同反映骨小梁的結構變化,當發(fā)生骨質疏松時,骨小梁結構由板狀轉為桿狀,Tb.Pf和SMI均上升。Tb.Th和Tb.N分別表示骨小梁的平均厚度以及單位長度的平均骨小梁數(shù),當骨健康受損時,Tb.Th和Tb.N均下降[34-35]。在本研究中,與低鈣對照組相比,奶粉中劑量組的BV/TV顯著升高,BS/BV、Tb.Pf顯著降低,奶粉高劑量組的BV/TV、BS/TV、Tb.N顯著升高,BS/BV、Tb.Pf、SMI顯著降低,直觀表明受試奶粉有助于低鈣攝入生長期大鼠的骨量累積,增加骨小梁數(shù)量,有利于骨骼健康。

綜上所述,添加了骨碎補的受試奶粉可促進生長期大鼠股骨發(fā)育,增加股骨骨密度和骨鈣,促進大鼠對鈣的吸收和利用,效果優(yōu)于同等劑量碳酸鈣。依據(jù)《保健食品功能檢驗與評價方法(2023年版)》中有助于改善骨密度檢驗方法中的方案一的結果判定,可認為該受試奶粉具有有助于改善骨密度的作用,且受試物可直觀改善低鈣導致的骨微結構的破壞,促進生長期大鼠骨健康,其機制可能與促進骨形成有關。