高壓靜電場(chǎng)對(duì)小鼠骨組織鈣沉積的影響

溫沛 張鵬翔 李成興 楊丁 原佳慧 羅小毛 劉振宇 王海東

摘要：為了探討正負(fù)高壓靜電場(chǎng)對(duì)小鼠骨骼組織的影響，將21 只健康C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正高壓靜電場(chǎng)組A、負(fù)高壓靜電場(chǎng)組B以及空白對(duì)照組C。A、B組分別置于電場(chǎng)強(qiáng)度為1.2 kV/cm的正、負(fù)高壓靜電場(chǎng)中，于7、14、21 d取小鼠兩側(cè)股骨。結(jié)果表明，正、負(fù)高壓靜電場(chǎng)組與對(duì)照組相比，骨小梁的密集程度顯著升高（P<0.01）、骨鈣濃度及血鈣濃度上升（P<0.01）。一定強(qiáng)度的高壓靜電場(chǎng)增加了骨小梁密集程度，引起骨鈣及血鈣濃度上升，對(duì)骨小梁的形成和骨組織鈣化具有促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞：高壓靜電場(chǎng);成骨細(xì)胞;骨小梁;骨鈣;血鈣

中圖分類(lèi)號(hào)： S858.91 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2021）10-0146-04

電場(chǎng)（electric field）是電荷及變化磁場(chǎng)周?chē)臻g里存在的一種特殊物質(zhì)，對(duì)放入其中的電荷有力的作用[1]。地球作為生物機(jī)體賴(lài)以生存的環(huán)境，其表面攜帶有負(fù)電荷，而大氣層則攜帶正電，使地球本身形成靜電場(chǎng)[2]，各種生物的生存繁衍、生長(zhǎng)發(fā)育均適應(yīng)于地球這一靜電場(chǎng)下[3]。自18世紀(jì)中葉靜電場(chǎng)的生物效應(yīng)被發(fā)現(xiàn)后，利用高壓靜電場(chǎng)輻照處理植物種子以提高種子活力的研究十分廣泛，在玉米、水稻、棉花等作物及瓜果蔬菜方面均有應(yīng)用[5]。

高壓靜電場(chǎng)不僅對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有利，對(duì)動(dòng)物也有一定作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)，高壓靜電場(chǎng)能影響動(dòng)物的體質(zhì)量、血壓、血糖及超氧化物歧化酶等生理指標(biāo)[9]，并對(duì)動(dòng)物機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生作用。此外，有研究表明，電能可促進(jìn)骨的生長(zhǎng)與修復(fù)，但臨床治療使用的主要方式是用直流電直接刺激骨折部位，進(jìn)而促進(jìn)骨骼的愈合[10]。而高壓靜電場(chǎng)能否促進(jìn)骨組織的生長(zhǎng)發(fā)育，目前尚無(wú)研究。骨骼作為機(jī)體的支架，也是運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的重要組成部分，骨基質(zhì)中無(wú)機(jī)成分主要是羥磷灰石結(jié)晶[Ca10（PO4）6（OH）2][11]，骨鈣的代謝將直接影響骨的質(zhì)量，從而影響機(jī)體正常生命活動(dòng)[12]。理論上，靜電場(chǎng)會(huì)對(duì)其內(nèi)所有離子產(chǎn)生力的作用，即使是體內(nèi)的Ca2+也不能例外，但目前并沒(méi)有研究報(bào)道高壓靜電場(chǎng)影響Ca2+在動(dòng)物體內(nèi)的代謝以及調(diào)節(jié)骨基質(zhì)中羥磷灰石結(jié)晶形成的作用。

本試驗(yàn)主要研究高壓靜電場(chǎng)作用下對(duì)小鼠骨組織骨鈣沉積和血鈣變化在成骨過(guò)程的影響，證明高壓靜電場(chǎng)對(duì)小鼠骨組織的影響，以期為進(jìn)一步探究高壓靜電場(chǎng)對(duì)骨性疾病治療作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試劑與儀器 鈣試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司）;蘇木精、伊紅染液及中性樹(shù)脂（北京索萊寶科技有限公司）;斯瑪特全自動(dòng)生化分析儀（成都斯瑪特科技有限公司）;高壓直流電源[東文高壓電源（天津）股份有限公司]。

脫鈣液由100 g EDTA-Na2（乙二胺四乙酸二鈉）溶于1 L 磷酸緩沖鹽溶液中，加入NaOH攪拌溶解后用HCl調(diào)節(jié)溶液pH值至7.2制成。骨固定液由8 mL 3%戊二醛和8 mL 4%多聚甲醛混合，加入 4 mL 4%組織固定液制成。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 選用C57BL/6的5周齡雄性小鼠，購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)系統(tǒng) 試驗(yàn)地點(diǎn)位于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，小鼠每日給予光照、黑暗各12 h，飼養(yǎng)環(huán)境溫度保持在（25±0.5） ℃，濕度為50%～60%，自由飲水和采食。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為3組，其中2組分別置于正高壓靜電場(chǎng)、負(fù)高壓靜電場(chǎng)下繼續(xù)飼養(yǎng)3周，每日輻照12 h后正常飼養(yǎng)，另1組設(shè)為對(duì)照組。正、負(fù)電場(chǎng)場(chǎng)強(qiáng)均穩(wěn)定在1.2 kV/cm。試驗(yàn)時(shí)間為2019年10月至2020年1月。

1.2.2 取樣與固定 分別于試驗(yàn)7、14、21 d從3組中隨機(jī)選取3只小鼠，摘取眼球采集血液，后脫頸處死，取其兩側(cè)股骨。血樣以4 000 r/min、4 ℃離心10 min后分離血清，置于-20 ℃保存，用于血鈣測(cè)定。將一側(cè)股骨置于4%多聚甲醛固定24 h后，置于10% 脫鈣液中，脫鈣3周，定期更換脫鈣液直至骨組織變軟，截取2/3遠(yuǎn)端股骨做石蠟包埋切片。另一側(cè)股骨于-80 ℃保存，用于骨鈣含量測(cè)定。

1.2.3 脫鈣組織的制片和觀察 取1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的脫鈣骨骼組織，以大頭針順利插入骨骼組織作為脫鈣終點(diǎn)的判斷依據(jù)，流水沖洗8 h。梯度乙醇脫水（70% 2 h，80% 2 h，90% 1 h，95% 1 h，100% 45 min）、二甲苯透明（45 min），浸蠟3 h后包埋，以7 μm厚度切片，50 ℃烤片機(jī)烘干。組織切片依次用二甲苯、梯度乙醇、蘇木精、伊紅染液、中性樹(shù)脂，對(duì)組織脫脂、染色、封片。顯微鏡下觀察骨組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，使用Image-Pro Plus統(tǒng)計(jì)骨小梁的面積占比。

1.2.4 骨鈣濃度的測(cè)定 將保存于-80 ℃的骨組織取出稱(chēng)質(zhì)量，加入生理鹽水，研缽研磨，靜置5 min后，以2 500 r/min的速度4 ℃離心10 min，取上清液待測(cè)。在96孔板中加入對(duì)應(yīng)試劑和樣本，混勻后，靜置5 min，在酶標(biāo)儀610 nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算濃度。

1.2.5 血鈣濃度的測(cè)定 將保存于-20 ℃的血清取出，取100 μL血清加入試劑盒中，置于全自動(dòng)血液生化分析儀，測(cè)量并計(jì)算分析血鈣含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 正高壓靜電場(chǎng)造成骨小梁比例增加

正高壓靜電場(chǎng)處理下的小鼠，骨組織HE（蘇木精伊紅染色）結(jié)果表明，對(duì)照組骨小梁分布均勻，密集程度較低。正高壓靜電場(chǎng)組深處可見(jiàn)骨髓腔中充滿(mǎn)大量的髓質(zhì)骨小梁。正高壓靜電場(chǎng)組的骨小梁密集度較高、骨小梁周?chē)晒羌?xì)胞較多（圖1-A）。對(duì)骨組織形態(tài)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，正高壓靜電場(chǎng)組與對(duì)照組相比有顯著差異（圖1-B）。結(jié)果表明，正高壓靜電場(chǎng)組可增加骨骼內(nèi)骨小梁和成骨細(xì)胞數(shù)量，從而促進(jìn)成骨過(guò)程。

2.2 負(fù)高壓靜電場(chǎng)促進(jìn)成骨發(fā)育

負(fù)高壓靜電場(chǎng)處理下的小鼠骨組織HE結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，負(fù)高壓靜電場(chǎng)組的骨小梁密集度較高、其周?chē)晒羌?xì)胞較多（圖2-A）。同樣對(duì)負(fù)高壓靜電場(chǎng)組進(jìn)行骨組織形態(tài)統(tǒng)計(jì)，分析發(fā)現(xiàn)負(fù)高壓靜電場(chǎng)組與對(duì)照組相比具有顯著差異（圖2-B）。結(jié)果表明，負(fù)高壓靜電場(chǎng)處理會(huì)造成骨骼內(nèi)骨小梁增加，促進(jìn)成骨過(guò)程。

2.3 高壓靜電場(chǎng)引起骨鈣沉積

通過(guò)使用鈣試劑盒測(cè)量骨鈣濃度，結(jié)果（圖3）表明，與對(duì)照組相比，正、負(fù)高壓靜電場(chǎng)處理的小鼠骨鈣濃度均表現(xiàn)為顯著性升高。隨著正高壓靜電場(chǎng)處理時(shí)間的增加，骨鈣濃度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。負(fù)高壓靜電場(chǎng)則表現(xiàn)相反趨勢(shì)，即隨著處理時(shí)間的增加，骨鈣濃度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。結(jié)果表明，正高壓靜電場(chǎng)的長(zhǎng)時(shí)間作用會(huì)導(dǎo)致骨鈣沉積增多，負(fù)高壓靜電場(chǎng)的長(zhǎng)時(shí)間作用會(huì)導(dǎo)致骨鈣沉積量下降;但與對(duì)照組相比，正、負(fù)高壓靜電場(chǎng)處理均引起骨鈣沉積。

2.4 高壓靜電場(chǎng)影響血鈣濃度

由圖4可知，與對(duì)照組相比，高壓靜電場(chǎng)處理的小鼠血鈣濃度均有所升高。在正高壓靜電場(chǎng)處理時(shí)，不同時(shí)長(zhǎng)下（7、14、21 d）均比對(duì)照組有微量升高趨勢(shì)，在21 d時(shí)濃度提升具有顯著性差異。負(fù)高壓靜電場(chǎng)處理結(jié)果與正高壓靜電場(chǎng)處理結(jié)果相似，血鈣濃度在21 d時(shí)表達(dá)升高，具有顯著性差異。用正高壓靜電場(chǎng)或負(fù)高壓靜電場(chǎng)處理組中，處理7 d和14 d小鼠的血鈣濃度均沒(méi)有表現(xiàn)出顯著的差異，但在21 d時(shí)顯著提高。高壓靜電場(chǎng)長(zhǎng)時(shí)間作用對(duì)小鼠血鈣濃度的升高有一定的影響，而正高壓靜電場(chǎng)與負(fù)高壓靜電場(chǎng)在促進(jìn)血鈣濃度方面沒(méi)有顯著區(qū)別。

3 討論與結(jié)論

骨小梁是由針狀或片狀的骨板及骨細(xì)胞構(gòu)成的，對(duì)骨質(zhì)的強(qiáng)度和硬度有重要的影響，是成骨過(guò)程重要的一環(huán)[11]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)骨小梁進(jìn)行切片觀察及形態(tài)計(jì)量學(xué)統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)高壓靜電場(chǎng)處理顯著導(dǎo)致了骨小梁增加，說(shuō)明在高壓靜電場(chǎng)的作用下會(huì)促使成骨細(xì)胞的增殖及其在骨鈣沉積中的作用。

細(xì)胞生物電是機(jī)體新陳代謝的物質(zhì)基礎(chǔ)，高壓靜電場(chǎng)作為環(huán)境物理因素對(duì)生物體的影響實(shí)質(zhì)上是外加電環(huán)境對(duì)細(xì)胞生物電轉(zhuǎn)變過(guò)程的影響[12]，細(xì)胞正是由于這些影響導(dǎo)致了一系列復(fù)雜的生理變化，最終致使其生命運(yùn)動(dòng)做出相應(yīng)的調(diào)整[13]。有研究表明，外加高壓靜電場(chǎng)下影響細(xì)胞膜電位，使膜兩側(cè)離子濃度發(fā)生變化[14]。電壓門(mén)控的離子通道的活化對(duì)膜電位具有強(qiáng)烈的依賴(lài)性，在電場(chǎng)作用下，門(mén)控電流引起孔洞的構(gòu)象變化，從而活化離子通道[15-16]。

人體內(nèi)的血鈣會(huì)在成骨細(xì)胞的作用下，沉積在骨骼上形成骨鈣;骨鈣則會(huì)在破骨細(xì)胞的作用下，從骨鈣轉(zhuǎn)變?yōu)檠}[17]。因此，血鈣濃度可以在一定程度上改變骨鈣沉積。本研究表明，與對(duì)照組相比，高壓靜電場(chǎng)處理組血鈣濃度普遍升高，這在一定程度上促進(jìn)了骨鈣濃度的上升，試驗(yàn)數(shù)據(jù)也表明了這一點(diǎn)，但短時(shí)間的處理未造成血鈣濃度的顯著性提升，說(shuō)明高壓靜電場(chǎng)對(duì)血鈣濃度的變化需要長(zhǎng)時(shí)間的作用。本次試驗(yàn)說(shuō)明高壓靜電場(chǎng)可以促進(jìn)血鈣上升、骨鈣沉積。但短時(shí)間的高壓靜電場(chǎng)處理對(duì)血鈣濃度效果不顯著的原因可能是電場(chǎng)刺激過(guò)程中產(chǎn)生的低濃度臭氧影響了作用效果[18];長(zhǎng)時(shí)間的負(fù)高壓靜電場(chǎng)處理下骨鈣濃度效果反而下降的主要原因可能是自然界通常處于低壓正靜電場(chǎng)狀態(tài)，外加負(fù)高壓靜電場(chǎng)會(huì)阻礙生物機(jī)體中原有的生理過(guò)程。本研究還有很多不足之處，首先不確定高壓靜電場(chǎng)是否會(huì)對(duì)動(dòng)物其他生理指標(biāo)產(chǎn)生影響，其次對(duì)高壓靜電場(chǎng)對(duì)成骨的影響機(jī)制也不清楚。整體來(lái)說(shuō)，高壓靜電場(chǎng)在骨鈣沉積以及血鈣濃度的影響上有一定的作用，可以促進(jìn)成骨分化，但須要控制適當(dāng)?shù)臅r(shí)間和適當(dāng)?shù)膱?chǎng)強(qiáng)，有望成為在治愈骨折過(guò)程中重要的一個(gè)輔助手段。

本研究表明，高壓靜電場(chǎng)處理可以提高骨小梁的形成和骨鈣沉積，以及促進(jìn)血鈣濃度上調(diào)，從而導(dǎo)致成骨分化和骨骼強(qiáng)度的增加。

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