有機(jī)種植對茶園土壤微生物群落組成與多樣性的影響

摘要：為揭示有機(jī)種植對土壤微生物群落組成和多樣性的影響，以云南省勐臘縣3座代表性古茶山（蠻磚、易武、攸樂）的古茶園、現(xiàn)代茶園、橡膠園、荒地4種類型土壤為研究對象，采用Illumina MiSeq PE300高通量測序技術(shù)測定其細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)，分析有機(jī)種植及種植年限對土壤理化性質(zhì)、微生物群落結(jié)構(gòu)特征與多樣性的影響。結(jié)果表明，有機(jī)種植可促進(jìn)土壤有機(jī)質(zhì)積累和氮磷鉀養(yǎng)分含量提高。3座茶山土壤細(xì)菌共有運算分類單元（Operational taxonomic unit，OTU）數(shù)目為381個，其中，易武荒地特有OTU最多（293個），蠻磚橡膠園特有OTU最少（28個）；而真菌共有OTU數(shù)目僅為24個，蠻磚古茶園特有OTU最多（337個），易武現(xiàn)代茶園特有OTU最少（55個）。細(xì)菌的Shannon多樣性指數(shù)達(dá)5.88～6.62，明顯高于真菌的2.71～4.30。茶園土壤優(yōu)勢細(xì)菌和真菌門與非茶園土壤基本相似，但酸微菌目（Acidimicrobiales）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、Varibacter屬、黃色桿菌科（Xanthobacteraceae）、硝化螺菌屬（Nitrospira）、Bryobacter屬、Acidibacter屬、浮霉菌科（Planctomycetaceae）等在不同茶山和土地利用方式間的相對豐度差異顯著；與荒地和橡膠園相比，茶園土壤真菌群落的毛殼菌科（Chaetomiaceae）、青霉菌屬（Penicillium）、鐮刀菌屬（Fusarium）、木霉屬（Trichoderma）、被孢霉屬（Mortierella）、傘菌目（Agaricales）和散囊菌綱（Eurotiomycetes）等的相對豐度較高。細(xì)菌群落豐度指數(shù)Chao1與土壤全氮和全磷呈顯著正相關(guān)，3座茶山的細(xì)菌群落組成較真菌群落更為穩(wěn)定。除個別茶園土壤外，有機(jī)種植下土壤細(xì)菌豐度隨年限增加而上升，真菌豐度隨年限增加先降低后升高，現(xiàn)代茶園和古茶園細(xì)菌與真菌的多樣性水平則隨種植年限增加而下降。

關(guān)鍵詞：茶園；土壤微生物；群落結(jié)構(gòu)組成；多樣性；高通量測序

中圖分類號：S517.1 " " " " " " " " nbsp; "文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A " " " " " " " " " "文章編號：1000-369X（2024）02-246-15

Influence of Organic Planting on Soil Microbial Community Composition and Diversity in Tea Gardens

YAN Yuxiao1， ZHOU Dapeng1， YANG Yanfen1， Xie Jin1，

Lü Caiyou1， YANG Guangrong1， WEN Qinshu2*

1. College of Tea Science of Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China;

2. Dehong Prefecture Tea Technology Promotion station， Mangshi 678400， China

Abstract： To reveal the influence of organic planting on the community composition and diversity of soil microbial community， 4 types of soils （ancient tea gardens， modern tea gardens， rubber fields， wastelands） were used as the research objects in 3 representative ancient tea mountains （Manzhuan， Yiwu and Youle） in Mengla County， Yunnan Province. The community composition of bacteria and fungi were identified using Illumina MiSeq PE300 high-throughput sequencing technology. The effects of organic planting and planting years on soil physical and chemical properties， microbial community composition characteristics and diversity were analyzed. The results show that organic planting could promote soil organic matter accumulation and increase the contents of nitrogen， phosphorus and potassium nutrients. The common number of bacteria OTUs in the soils of three tea gardens and non-tea gardens was 381. Among them， Yiwu Wasteland had highest number of unique OTUs （293）， while the Rubber Land of Manzhuan had the lowest number of unique OTUs （28）. The total number of fungi OTUs was only 24， with the highest number of fungi OTUs unique to Manzhuan ancient tea garden （337） and the lowest number of OTUs unique to Yiwu Modern Tea Garden （55）. In addition， The Shannon diversity index of bacteria reached 5.88-6.62， which was significantly higher than that of fungi （2.71-4.30）. The dominant bacteria and fungi in tea garden soils were basically similar to those in non-tea garden soil. However， there were significant differences in relative abundance among identified Acidimicrobiales， Bradyrhizobium， Varibacter， Xanthobacteraceae， Nitrospira， Bryobacter， Acidibacter and Planomyceteaceae among different tea mountains and land use modes. Compared with wasteland and rubber land， the relative abundance of Chaetomiaceae， Penicillium， Fusarium， Trichoderma， Mortierella， Agaricales and Eurotiomycetes in tea garden soil fungal communities were significantly higher than those in other soils. The abundance index of bacterial community Chao1 was significantly and positively correlated with soil TN and TP， and the bacterial community composition was more stable than the fungal community composition of the three mountains with ancient tea plants. Except for some tea garden soils， the abundance of soil bacteria increased with the increase of organic planting and planting years， while the abundance of fungi decreased and then increased with the beginning of organic planting. The diversity level of bacteria and fungi in modern and ancient tea gardens decreased with the increase of organic planting and planting years.

Keywords： tea garden， soil microorganisms， community composition， diversity， high-throughput sequencing

微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，一方面，其群落結(jié)構(gòu)和多樣性受植物種類和土壤理化性質(zhì)的影響，另一方面，土壤微生物參與了諸多土壤化學(xué)反應(yīng)過程，對植物生長及土壤微環(huán)境具有重要調(diào)節(jié)作用[1]。前人研究表明，土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)、活性及多樣性在土壤有機(jī)質(zhì)分解、腐殖質(zhì)形成、養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和循環(huán)、有毒物質(zhì)降解及凈化等過程中起著極其重要的作用，是評價土壤環(huán)境質(zhì)量及反映土壤肥力水平的重要生物學(xué)指標(biāo)[2]。

茶樹[Camellia sinensis（L.）O. Kuntze]是一種多年生木本常綠植物，是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物。茶樹長期連作的特點使茶園土壤隨著茶樹凋落物和修剪枝葉的還田、根系分泌物酸性物質(zhì)的積累、肥料的偏銨利用等因素而形成獨特的生態(tài)環(huán)境特征，如土壤Al、Fe和多酚類物質(zhì)富集，pH明顯下降，Ca、Mg等鹽基離子淋失和微量元素相對缺乏[3-4]，并形成了茶園土壤獨特的微生物群落結(jié)構(gòu)[5]，同時土壤微生物絕對豐度降低、多樣性減少、有機(jī)質(zhì)積累下降等導(dǎo)致茶園土壤肥力減弱，直接制約著茶園生產(chǎn)綠色健康發(fā)展[6-8]。種植年限對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響研究表明，隨著種植年限的增加，茶園土壤微生物群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)單一化的趨勢[9]。相關(guān)研究表明，由于茶樹生長發(fā)育對土壤理化和營養(yǎng)元素的特殊需求，形成了茶園土壤有別于其他農(nóng)田土壤的特性[10-12]。然而，對林下栽培的古茶園土壤細(xì)菌群落研究則發(fā)現(xiàn)，古茶園土壤細(xì)菌的豐度高于現(xiàn)代茶園及森林，古茶園土壤細(xì)菌多樣性有升高趨勢[13]。

近年來，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)手段的快速發(fā)展與應(yīng)用，直接從環(huán)境樣品中提取全部微生物的DNA并在測序后分析環(huán)境中微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能（序列驅(qū)動），或構(gòu)建宏基因組文庫，篩選新的基因或生物活性物質(zhì)（功能驅(qū)動），克服了傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)研究方法的缺陷，有效挖掘微生物群落演變規(guī)律、多樣性和功能與茶園土壤養(yǎng)分的相互作用關(guān)系，為全面揭示茶園土壤微生物資源提供了新途徑[14-15]。本研究基于MiSeq PE300高通量測序平臺，對云南勐臘縣3座代表性古茶山的古茶園、現(xiàn)代茶園、橡膠園、荒地4種不同土地利用方式的土壤養(yǎng)分狀況、微生物種群組成與多樣性進(jìn)行研究，旨在闡明有機(jī)種植及年限長短對土壤理化性質(zhì)和微生物群落組成與多樣性的影響，為探明茶園土壤微生物群落的演變特征及其與茶園土壤環(huán)境因子的關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣地概況

試驗土壤樣本采集于2022年7月，采樣位點位于云南省西雙版納州勐臘縣（21°08′～22°25′ N、101°06′～100°50′ E，海拔789.40～1 405.40 m）的代表性古茶山蠻磚、易武、攸樂的古茶園、現(xiàn)代茶園以及其附近的荒地或橡膠園。采樣茶山土壤均為紅壤，均采取有機(jī)茶園管理模式，實施免耕耕作方式，不施化肥、不噴農(nóng)藥。橡膠園為單一種橡膠連作5年以上，荒地為連續(xù)5年以上未開墾耕作土地。樣本土壤信息概況見表1。

1.2 土壤樣品采集與處理

1.2.1 土壤樣本采集

根據(jù)采樣茶園的地形條件，在選定的20 m×20 m區(qū)域內(nèi)，采用3～5點混合取樣法，每個采樣點沿著茶樹樹冠邊緣垂直投影取樣，采樣工具及其他物品事先滅菌，使用前采用75%酒精再次滅菌，并用采樣處土壤擦拭。適當(dāng)清除地表的枯枝落葉，用土鉆采集0～20 cm表層土壤，使用無菌取樣勺多點采集重量相當(dāng)?shù)耐寥肋M(jìn)行混勻，剔除雜質(zhì)，取5 g土壤裝入無菌袋，形成1個土壤樣品，用液氮冷凍后于﹣86 ℃保存，用大體積干冰運輸。每一茶園重復(fù)取3個土壤樣品，共計27個樣本，用于微生物測序。另取500 g土壤裝入塑封袋中，密封運輸回實驗室。

1.2.2 土壤樣本處理

土壤樣品分為2份。一份土壤樣品（約500 g）于實驗室內(nèi)自然風(fēng)干，過2 mm、0.149 mm篩用于測定有機(jī)質(zhì)（Soil organic matter，SOM）、全氮（Total nitrogen，TN）、全磷（Total phosphorous，TP）、全鉀（Total potassium，TK）、堿解氮（Alkali-hydrolyzable nitrogen，AN）、速效鉀（Available potassium，AK）。另一份土壤樣品（約5 g）送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行分子生物學(xué)研究。

1.3 土壤化學(xué)指標(biāo)測定方法

土壤基本理化性質(zhì)測定參照《土壤農(nóng)化分析》[16]的相關(guān)方法。其中，土壤pH采用玻璃復(fù)合電極法測定，土水比（m∶m）采用1∶2.5；SOM用重鉻酸鉀容量法—外加熱法測定；TN用濃硫酸-雙氧水消煮—凱氏定氮法測定，TP用硫酸-雙氧水消煮—鉬銻抗比色法測定，TK用濃硫酸-雙氧水消煮—火焰光度法測定；AN用1 mol·L-1 NaOH堿解擴(kuò)散法測定，AK用乙酸銨浸提—火焰光度法測定。

1.4 土壤微生物分子生物學(xué)鑒定

1.4.1 土壤微生物總DNA提取

土壤微生物總DNA提取采用SDS-GITC-PEG法[13]，并作適當(dāng)修改。稱取0.5 g土壤樣品于2 mL離心管中，所加試劑均按照比例縮小20倍，加入氯仿-異戊醇后15 000 g離心10 min。其他操作步驟不變。

1.4.2 DNA擴(kuò)增與測序

以樣品DNA為模板，土壤真菌采用引物ITS3F（5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′）、ITS4R（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），土壤細(xì)菌通用引物341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）、806R（5'-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3'）用帶有barcode的特異引物擴(kuò)增樣本18 S rDNA和16 S rDNA特定區(qū)域，擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共27個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR反應(yīng)體系為：5×TransStart FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mmol·L-1 dNTPs 2 μL，上下游引物（5 μmol·L-1）各0.8 μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化后利用Illumina公司Miseq PE300平臺進(jìn)行高通量測序。

1.4.3 測序數(shù)據(jù)處理與分子生物信息學(xué)分析

使用fastp v0.20.0軟件（https：//github.

com/OpenGene/fastp）對原始測序序列進(jìn)行質(zhì)控，使用FLASH 1.2.7軟件（www.cbcb.umd.edu/software/flash）進(jìn)行拼接：（1）過濾reads尾部質(zhì)量值20以下的堿基，設(shè)置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，過濾質(zhì)控后50 bp以下的reads，去除含N堿基的reads；（2）根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對reads拼接（merge）成一條序列，最小overlap長度為10 bp；（3）拼接序列的overlap區(qū)允許的最大錯配比率為0.2，篩選不符合序列；（4）根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物區(qū)分樣品，并調(diào)整序列方向，barcode允許的錯配數(shù)為0，最大引物錯配數(shù)為2。

使用UPARSE 7.1軟件（http：//drive5.com/

uparse），根據(jù)97%的相似度對序列進(jìn)行運算分類單元（Operational taxonomic unit，OTU）聚類并剔除嵌合體。利用RDP classifier（http：//rdp.cme.msu.edu，version 2.2）對每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對Silva和Unite數(shù)據(jù)庫，設(shè)置比對閾值為70%。在OTU水平上對土壤樣品進(jìn)行微生物物種數(shù)量與相對豐度、α多樣性、物種聚類及差異等分析。

1.5 統(tǒng)計分析

土壤常規(guī)養(yǎng)分指標(biāo)利用Excel、SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（mean±SD），主成分分析（Principal component analysis，PCA）用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行。

土壤微生物數(shù)據(jù)分析中的所有數(shù)據(jù)按照最小樣本數(shù)抽平計算，根據(jù)抽平后微生物數(shù)據(jù)進(jìn)行堆疊圖分析、聚類分析、韋恩圖分析、冗余分析等分析，均在美吉生物云平臺上進(jìn)行（https：//cloud.majorbio.com）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同土壤理化性質(zhì)

茶園與非茶園土壤基本理化測定結(jié)果如表2所示，各類土壤的pH在4.44～5.77，非茶園土壤與茶園土壤的pH存在差異，總體表現(xiàn)為橡膠園＜古茶園＜現(xiàn)代茶園＜荒地；有機(jī)質(zhì)含量范圍在23.41～62.63 g·kg-1，同一座古茶山不同土地利用方式土壤有機(jī)質(zhì)含量差異達(dá)顯著水平（P＜0.05），古茶園和橡膠園（RG、RJ、SG、TG）＞現(xiàn)代茶園（RX、SX、TX）＞荒地（SH、TH）；全氮、全磷、全鉀、堿解氮和有效鉀含量范圍分別在1.21～3.62、0.28～0.64、4.51～12.7 g·kg-1和110.05～308.3、75.69～228 mg·kg-1。總體上，不同土地利用方式間的氮磷（TN、TP和AN）和有效鉀養(yǎng)分水平差異呈現(xiàn)橡膠園＞茶園＞荒地，而總鉀（TK）的含量變化與之相反。在古茶園和現(xiàn)代茶園之間，除蠻磚古茶園土壤的有效氮與鉀的含量顯著高于現(xiàn)代茶園外，其他兩座茶山的氮磷鉀養(yǎng)分均表現(xiàn)為現(xiàn)代茶園高于古茶園。

基于土壤理化性質(zhì)的PCA結(jié)果表明（圖1），相同茶山不同利用方式土壤間的pH和碳氮磷鉀養(yǎng)分水平間存在明顯的差異，但不同茶山相同類型土壤如TG、SG和RG與TH、SH之間的差異較小。說明茶園土壤和非茶園土壤、現(xiàn)代茶園與古茶園土壤理化性質(zhì)有顯著差異。

2.2 不同土壤的微生物群落組成及多樣性

通過Miseq PE300高通量測序共獲得4 303個細(xì)菌OTU，隸屬于33門、79綱、168目、313科、538屬和1 161種；真菌OTU為3 183個，隸屬于8門、27綱、86目、201科、439屬和715種。樣本文庫的覆蓋率細(xì)菌達(dá)97.57%～98.37%，真菌達(dá)99.31%以上（表3），說明所建立的文庫可有效反映樣本微生物的真實情況。3座茶山9個土壤樣品微生物群落統(tǒng)計表明（圖2），細(xì)菌OTU數(shù)目呈現(xiàn)古茶園（1 871～2 949）＞現(xiàn)代茶園（1 830～2 133）＞橡膠園（1 840）＞荒地（1 767～2 175）。真菌OTU數(shù)目則與茶山地理分布關(guān)系密切，同時各土地利用方式間差異明顯，總體為蠻磚古茶山＞攸樂古茶山＞易武古茶山，以蠻磚古茶園（1 249）最豐富，其次是攸樂荒地（999），易武現(xiàn)代茶園（375）最少。

由圖2所示，3座茶山9個土壤樣品細(xì)菌群落共有OTU數(shù)目為381個，易武古茶山荒地特有群落最多，為293個，蠻磚古茶山橡膠園最少，為28個；真菌群落共有OTU數(shù)目僅為24個，以蠻磚古茶園特有OTU數(shù)目最多，為337個，易武現(xiàn)代茶園最少，為55個。結(jié)合表3，土壤樣品的細(xì)菌和真菌的α多樣性指數(shù)表明，細(xì)菌的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)均高于真菌；與之相似，細(xì)菌的多樣性香濃指數(shù)高達(dá)5.88～6.62，也明顯高于真菌2.71～4.30。表3和圖2均表明，3座茶山的細(xì)菌群落組成比真菌穩(wěn)定。

2.3 不同土壤門水平上的微生物群落組成

根據(jù)物種注釋結(jié)果，在門水平上統(tǒng)計各樣本的物種組成，將豐度小于0.01%的物種歸為其他（Others），生成物種相對豐度柱狀累積圖（圖3）。相同茶山不同茶園土壤細(xì)菌群落相似度較高，但組成群落的類群的相對豐度差異明顯。9個不同土壤樣品的優(yōu)勢細(xì)菌門依次為變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、放線菌門（Actinobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和疣微菌門（Verrucomicrobia），其中，變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門和硝化螺旋菌門這4個類群的總豐度占比達(dá)80%以上。而匿桿菌門（Latescibacteria）、藍(lán)菌門（Cyanobacteria）、GAL15、WS6的相對豐度較低，且WS6為易武茶山麻黑村古茶園所特有的菌門。茶園土壤主要優(yōu)勢細(xì)菌變形菌門、綠彎菌門和硝化螺旋菌門的相對豐度與荒地或橡膠園非茶園土壤有顯著差異。

各土壤樣本主要真菌群落組成為子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota）、球囊菌門（Glomeromycota），以及一個未知菌門（unclassified_k__Fungi）。其中未知菌門在易武古茶山現(xiàn)代茶園土壤中的相對豐度最高，達(dá)66.53%，除SX土壤外，其他土壤的子囊菌門和擔(dān)子菌門的總豐度達(dá)到52.01%以上。與細(xì)菌相似，5個門類真菌的相對豐度在茶園和非茶園土壤間差異顯著。

2.4 屬水平上不同土壤微生物的群落組成及聚類分析

選取屬分類水平上細(xì)菌豐度前30的物種繪制相對豐度熱圖及聚類分析（圖4）。由圖4可知，3座古茶山不同土壤樣品細(xì)菌群落基本聚類為兩大類，其中攸樂古茶山3個土壤（TX、TG、TH）、易武茶園土壤和蠻磚古茶園土壤聚為一類，易武荒地、蠻磚現(xiàn)代茶園和橡膠園土壤樣品聚為一類，表明不同地理分布茶山土壤和茶園土壤與非茶園土壤的細(xì)菌群落物種組成有明顯的差異。攸樂古茶山的土壤細(xì)菌群落組成與蠻磚和易武古茶山差異較大，且其細(xì)菌物種組成和豐度與多樣性差異低于其他兩座古茶山的土壤，與表3的結(jié)果基本一致，尤其是古茶園土壤與非茶園土壤之間，蠻磚古茶園土壤與蠻磚橡膠園和易武古茶園與易武荒地聚類均被分為兩類。酸桿菌屬（Acidobacterium）和JG37-AG-4屬為9個土壤樣品的優(yōu)勢菌屬，除蠻磚現(xiàn)代茶園外，酸桿菌科的Subgroup_1屬（Acidobacteriaceae_Subgroup_1）、熱酸菌屬（Acidothermus）和DA111等屬為5個茶園土壤及攸樂荒地優(yōu)勢細(xì)菌屬。

此外，除優(yōu)勢細(xì)菌群落外，已知細(xì)菌屬中，硝化螺菌屬（Nitrospira）、Gaiellales、H16、土微菌屬（Pedomicrobium）、Varibacter、黃色桿菌科（Xanthobacteraceae）和慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）在蠻磚橡膠園中分布也較廣泛；易武荒地的Nitrospira、Gaiellales、H16、玫瑰彎菌屬（Roseiflexus）、芽單孢菌科（Gemmatimonadaceae）、Subgroup 7、厭氧繩菌科（Anaerolineaceae）和亞硝化單胞菌科（Nitrosomonadaceae）等豐度較高。與易武荒地相比，攸樂荒地細(xì)菌的多樣性則與茶園土壤更接近，以HSB_OF53-F07、酸微菌目（Acidimicrobiales）、慢生根瘤菌屬、Candidatus_Solibacter、Varibacter、黃色桿菌科、Bryobacter、Acidibacter、浮霉菌科（Planctomycetaceae）分布較豐富，其中，多樣性指數(shù)最高的蠻磚現(xiàn)代茶園還包括Rhizomicrobium、TK10、YNPFFP1、Haliangium和小單胞菌科（Micromonosporaceae）等類群?？傮w上看，3座茶山不同土壤細(xì)菌屬水平物種相對豐度差異顯著，表現(xiàn)為現(xiàn)代茶園＞古茶園＞荒地或橡膠園。

屬分類水平上真菌群落優(yōu)勢屬相對豐度熱圖與聚類分析表明（圖5），蠻磚現(xiàn)代茶園與其余8個土壤樣品的物種組成差異最大，獨自聚為一類。茶園土壤（TX、RG）與非茶園土壤（TH、RJ）則相似初步聚為一個類，另外3個茶園土壤（SX、TG、SG）則與易武荒地相似聚為另一類。在屬水平上，隱球菌屬（Cryptococcus）和兩個未知真菌屬（Ascomycota和Fungi）為9個樣本的優(yōu)勢菌屬，蠻磚現(xiàn)代茶園的優(yōu)勢菌屬還包括蠟殼耳科（Sebacinaceae）、擬鎖瑚菌屬（Clavulinopsis）、革菌科（Thelephoraceae）、斜蓋傘屬（Clitopilus）、糙孢孔目（Trechisporales）。蠻磚橡膠園則以青霉菌屬（Penicillium）、鐮刀菌屬（Fusarium）、淡紫紫胞菌屬（Purpureocillium）、鬼筆菌科（Phallaceae）、Myriodontium、小囊菌科（Microascaceae）豐度較高。攸樂荒地的青霉菌、木霉屬（Trichoderma）、被孢霉屬（Mortierella）、糙孢孔目（Trechisporales）、粗糙孔菌屬（Trechispora）和蠟殼耳科（Sebacinaceae）豐度較高，與之相比，易武荒地真菌群落的組成差異較大，豐度較高類群為傘菌目（Agaricales）、Agaricomcetes和散囊菌（Eurotiomycetes）、Venturiales、Herpotrichiellaceae等菌綱?，F(xiàn)代茶園土壤的特有豐度真菌類群最少，易武現(xiàn)代茶園僅為隔指孢屬（Dactylella），攸樂現(xiàn)代茶園為青霉菌屬、鐮刀菌屬、濕傘屬（Hygrocybe）、被孢霉屬和毛殼菌科（Chaetomiaceae）的類群。3個古茶園土壤真菌的多樣性比現(xiàn)代茶園有所增加，其中攸樂古茶園有傘菌目、散囊菌綱（Eurotiomycetes）和Herpotrichiellaceae菌綱；蠻磚古茶園有鐮刀菌屬、被孢霉屬、青霉菌屬、木霉屬和毛殼菌科；易武古茶園最多有Agaricomcetes和Venturiales菌綱、傘菌目、青霉菌屬、鐮刀菌屬、木霉屬和被孢霉屬。綜上所述，攸樂荒地和蠻磚橡膠園與古茶園的真菌多樣性明顯高于其他類型土壤，與表3結(jié)果基本一致。

2.5 土壤環(huán)境因子對微生物群落組成與多樣性的影響

土壤微生物群落與所處環(huán)境存在著密不可分的關(guān)系。本研究對微生物多樣性指數(shù)與土壤養(yǎng)分含量進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，結(jié)果表明（表4），細(xì)菌豐度（Chao1指數(shù)）與土壤pH和TK呈負(fù)相關(guān)，與TN、TP和AK呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。細(xì)菌的多樣性（Shannon指數(shù)）與SOM、TK和AN呈負(fù)相關(guān)，與pH、TN、TP和AK呈正相關(guān)，但均不顯著。真菌群落的豐度（Chao1指數(shù)）與土壤環(huán)境因子關(guān)系與細(xì)菌相似，多樣性則與pH、SOM、TP和TK負(fù)相關(guān)，與TN、AN和AK正相關(guān)，但均不顯著。

為闡明土壤環(huán)境因子對微生物群落的影響，在門水平上以細(xì)菌和真菌相對豐度前5的群落作為響應(yīng)變量，土壤理化性質(zhì)作為環(huán)境解釋變量進(jìn)行冗余分析（RDA）。從圖6可知，影響細(xì)菌群落的主要環(huán)境因子依次為TK、pH、AN、TN、SOM、AK和TP。荒地（SH、TH）及現(xiàn)代茶園（SX）土壤的硝化螺旋菌門（Nitrospirae）豐度與TK、pH為正相關(guān)關(guān)系，與SOM、AN、TN、AK、TP則呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。RG、RX、RJ和SG的變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和放線菌門（Actinobacteria）與SOM、AN、TN、AK、TP呈正相關(guān)而與TK和pH呈負(fù)相關(guān)；另外，TX和TG土壤的酸桿菌門（Acidobacteria）與pH和TK呈正相關(guān)關(guān)系與其他環(huán)境因子呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。影響真菌群落的主要環(huán)境因子主次依次為TK、SOM、TP、TN、AK和AN?，F(xiàn)代茶園（SX、TX）真菌與所有的7個環(huán)境因子存在一定正相關(guān)性。而TH、SG和RJ的子囊菌門（Ascomycota）與所有環(huán)境環(huán)境因子呈負(fù)相關(guān)；RX和RG的擔(dān)子菌門（Basidiomycota）與TK存在顯著的負(fù)相關(guān)性。

3 討論

3.1 有機(jī)種植對土壤理化性質(zhì)的影響

不同的土地利用方式會對土壤理化性質(zhì)產(chǎn)生較大影響，如農(nóng)田和菜地土壤重金屬有效性、有效磷、堿解氮、有機(jī)碳含量和電導(dǎo)率均高于林地，而pH低于林地[17]。茶園和橡膠園隨著地表枯枝落葉層的積累、分解和礦化，參與園地生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動使土壤的理化含量產(chǎn)生顯著的變化，養(yǎng)分積累更快[18]。而荒地僅存在少量草本植物，養(yǎng)分循環(huán)代謝較低，因此養(yǎng)分含量相對較低。梁名志等[19]研究發(fā)現(xiàn)，古茶園每年均有大量的落葉、枯草腐爛，形成較高的土壤有機(jī)質(zhì)含量，本研究中茶園和橡膠園的土壤有機(jī)質(zhì)含量均高于荒地（表2），并且，古茶園的土壤有機(jī)質(zhì)顯著高于現(xiàn)代茶園（P＜0.05）。適宜茶樹生長的pH為4.0～6.5，本研究茶園土壤的pH范圍為4.44～5.45，總體上低于同一茶山的荒地土壤；古茶園的pH均低于現(xiàn)代茶園。茶樹種植年限的增加導(dǎo)致土壤持續(xù)酸化，不利于茶葉生產(chǎn)[20]。同時各土壤樣品的養(yǎng)分差異顯著，但同一茶山不同土地利用方式間變化規(guī)律不一致，可能是由于茶山土壤母質(zhì)差異較大、橡膠與茶樹根系對土壤環(huán)境影響的差異及種植年限差異太大等原因[21]。除個別茶山（易武）和個別因子（TK）外，土壤養(yǎng)分的綜合指標(biāo)表現(xiàn)為橡膠園＞古茶園＞現(xiàn)代茶園＞荒地，表明茶樹種植年限對土壤養(yǎng)分具有重要的影響。

3.2 有機(jī)種植對土壤微生物群落組成與多樣性的影響

土壤微生物作為土壤重要的活性成分，其群落組成及多樣性是反映土壤環(huán)境的重要指標(biāo)，對生態(tài)系統(tǒng)的平衡有著不可替代的作用[22-23]。不同的土地利用方式會對微生物的群落組成及多樣性產(chǎn)生影響，研究表明蔬菜、谷物、豆科植物等作物的種植對土壤微生物群落豐度以及結(jié)構(gòu)造成顯著影響[24-25]。本研究通過高通量測序與微生物分子學(xué)鑒定能夠較為準(zhǔn)確地反映土壤微生物的群落特征，本研究中細(xì)菌的OTU數(shù)目依次為現(xiàn)代茶園＞古茶園＞橡膠園或荒地（圖2），細(xì)菌群落多樣性表現(xiàn)為現(xiàn)代茶園或古茶園＞橡膠園＞荒地，伴隨茶園有機(jī)種植細(xì)菌群落多樣性呈現(xiàn)上升趨勢，多樣性指數(shù)隨有機(jī)種植年限增加呈下降趨勢（表3）。土壤微生物群落多樣性能反映土壤健康與質(zhì)量的動態(tài)，古茶園長期種植導(dǎo)致多樣性下降可能對農(nóng)田土壤的可持續(xù)利用有負(fù)面影響[26]。在群落組成方面，本研究不同類型土壤以變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、硝化螺旋菌門、放線菌門5個門為優(yōu)勢菌群，同時一些未知的酸桿菌屬、熱酸菌屬和玫瑰彎菌屬相對豐度較高，各土壤樣本群落組成相似度較高，但群落豐度差異明顯（圖3和圖4），與前人的研究結(jié)果具有一致性[27]。另外，本研究中，各土壤的放線菌豐度也較高，有利于土壤纖維素、木質(zhì)素等植物有機(jī)殘體的分解[28]，促進(jìn)茶園枝葉凋落物的分解利用。

本研究真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性與茶山地理分布關(guān)系最密切，其次與土地利用方式有關(guān)，有機(jī)種植使土壤真菌群落數(shù)量下降，但隨種植年限增加有的古茶園有所上升（圖2），與王秀青等[29]結(jié)果相似。也有研究表明，茶樹的修剪、采摘、季節(jié)變化、土壤酸度和養(yǎng)分都會影響真菌的群落的變化[30-32]。本研究真菌群落多樣性變化趨勢為橡膠園或荒地＞現(xiàn)代茶園＞古茶園?？赡芘c茶樹有機(jī)種植前期不耐酸的真菌類群減少有關(guān)（表3），隨著種植年限增長真菌群落豐度增加則與耐酸真菌不斷適應(yīng)茶園土壤特性而數(shù)量增加有關(guān)（圖2）。本研究各類型土壤真菌以子囊菌門、擔(dān)子菌門、接合菌門、球囊菌門為優(yōu)勢菌門，隱球菌屬和兩個未知的菌屬（unclassified_p_Ascomycota和unclassified_k__Fungi）為優(yōu)勢菌屬（圖3和圖5）。在已知真菌屬中，茶園土壤的青霉菌屬、鐮刀菌屬、木霉屬和被孢霉屬等豐度較高，與前人的研究結(jié)果基本一致[30-31]。子囊菌門多數(shù)為腐生菌，是土壤有機(jī)質(zhì)降解的過程中的關(guān)鍵微生物[33]，接合菌門能分解土壤中的糖類和簡單多糖物質(zhì)，是土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分含量豐富的標(biāo)志[34]。此外，本研究中發(fā)現(xiàn)豐度較高的未知優(yōu)勢細(xì)菌和真菌類群，需要改進(jìn)研究手段與方法，進(jìn)一步發(fā)掘其生物學(xué)信息與功能。

3.3 土壤微生物群落與環(huán)境因子間的關(guān)系

土壤溫度、濕度、pH、養(yǎng)分等是影響土壤微生物群落的關(guān)鍵因素[35]。本研究表明，土壤pH與細(xì)菌多樣性呈正相關(guān)，與真菌呈負(fù)相關(guān)，說明真菌更適宜在酸性土壤中生存，這與大多數(shù)研究結(jié)果吻合[36-37]。除TK外，細(xì)菌和真菌的豐度與有機(jī)質(zhì)和氮磷鉀養(yǎng)分呈正相關(guān)，且細(xì)菌與SOM、TN、TP和AK的相關(guān)系數(shù)高于真菌，與TN和TP呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），表明土壤肥力對細(xì)菌數(shù)量影響極為重要。細(xì)菌和真菌多樣性與環(huán)境因子相關(guān)系數(shù)均不及豐度高，表明土壤碳氮磷鉀肥力指標(biāo)微生物數(shù)量的影響要高于種群結(jié)構(gòu)。冗余分析表明影響細(xì)菌群落的主要環(huán)境因子是pH和TK，其中，浮霉菌、硝化螺旋菌和酸桿菌與pH和TK呈正相關(guān)，與SOM、AN、TN、AK、TP均呈負(fù)相關(guān)，而變形菌門、綠彎菌門和放線菌門則與之相反；另外，影響真菌群落的主要環(huán)境因子為TK和SOM，擔(dān)子菌門和大量未知的真菌與TK存在很強(qiáng)的相關(guān)性。已有研究表明，鉀肥的施加會增加微生物數(shù)量，特別是真菌數(shù)量[38]，本研究中的酸桿菌門、硝化螺旋菌門等均與TK顯著正相關(guān)。

4 結(jié)論

古茶園長期種植茶樹會增加土壤酸度，提高土壤有機(jī)質(zhì)積累和氮磷鉀養(yǎng)分含量。除個別土壤外，茶園土壤細(xì)菌數(shù)目隨有機(jī)種植及年限增加而上升，多樣性水平則隨有機(jī)種植及年限延續(xù)而下降；真菌數(shù)目隨有機(jī)種植年限增加先下降后升高，多樣性水平隨有機(jī)種植年限增加而下降。

茶園土壤優(yōu)勢細(xì)菌門類與非茶園土壤基本相似，但硝化螺菌屬等13個科及屬物種的相對豐度在不同茶山的現(xiàn)代茶園、古茶園和非茶園土壤間差異較明顯。與荒地和橡膠園相比，茶園土壤真菌中的毛殼菌科、青霉菌屬、鐮刀菌屬、木霉屬、和被孢霉屬、傘菌目、散囊菌綱等的豐度明顯高于其他類型土壤。細(xì)菌與SOM、TN、TP和AK的相關(guān)系數(shù)高于真菌，并與TN和TP呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），表明土壤肥力對細(xì)菌豐度影響極為重要。細(xì)菌和真菌多樣性與環(huán)境因子相關(guān)系數(shù)均不顯著，表明土壤碳氮磷鉀肥力指標(biāo)微生物數(shù)量的影響高于種群結(jié)構(gòu)。

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