湖北巴東縣野生茶樹種質(zhì)資源遺傳多樣性及種群結(jié)構(gòu)親緣關(guān)系分析

摘要：野生茶樹種質(zhì)資源具有較高的遺傳多樣性，是開展茶樹品種選育的優(yōu)質(zhì)基因庫。收集了來自湖北省巴東縣的26份野生茶樹資源，利用簡單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR）分子標(biāo)記并結(jié)合對照栽培型茶樹品種對野生茶樹資源的遺傳多樣性及種群結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分析。結(jié)果如下：（1）16對引物在供試材料中共擴(kuò)增得到82個等位位點(diǎn)，每對引物擴(kuò)增所得的等位基因范圍為3～8個，平均檢測出等位位點(diǎn)5.12個，有效位點(diǎn)數(shù)量3.65個，香農(nóng)多樣性指數(shù)平均值1.378。（2）從16對引物中篩選出6個核心引物位點(diǎn)，可對26份野生茶樹進(jìn)行有效檢測并鑒別。（3）UPGMA進(jìn)化樹將48份材料分為7個類別，野生茶樹與栽培型茶樹能通過SSR標(biāo)記進(jìn)行有效劃分；進(jìn)一步種群遺傳結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)26份野生茶樹可分為2個亞群。（4）依據(jù)生化成分含量，篩選得出2份高EGCG含量的茶樹種質(zhì)資源及2份適制紅茶的茶樹種質(zhì)資源。研究結(jié)果顯示，巴東野生茶樹多樣性豐富，種群內(nèi)部遺傳變異高，為進(jìn)一步保護(hù)、開發(fā)和利用巴東野生茶樹種質(zhì)資源奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：野生茶樹；多樣性；簡單重復(fù)序列；親緣關(guān)系

中圖分類號：S571.1；S324 " " " " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A " " " " " " "文章編號：1000-369X（2024）02-193-14

Genetic Diversity and Population Structure Relationship Analysis of Wild Tea Germplasm Resources in Badong County， Hubei Province

CUI Qingmei1， LIANG Jinbo1， MA Huijie1， HU Shuangling1， CHEN Qinghua1， WU Liyun2，

HE Mengdi2， WANG Liubin2， TAN Licai3， ZHANG Qiang1*， WANG Liyuan2*

1. Enshi Tujia and Miao Autonomous Prefecture Academy of Agricultural Sciences， Enshi 445000， China;

2. Tea Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou 310008， China;

3. Hubei Zhengshantang Badong Black Tea Co.， Ltd.， Hubei Province， Badong 444300， China

Abstract： Wild tea germplasm resources have high genetic diversity and are also a high-quality source for the breeding and utilization of local tea cultivars. In this study， 26 resources of wild tea plants from Badong County， Hubei Province， were collected and the genetic diversity and population structure of wild tea plants were analyzed using SSR molecular markers with the normal tea cultivars as the control. The results are as follows： （1） 16 pairs of primers detected an average of 5.12 alleles and 3.65 effective loci in the test materials. A total of 82 alleles were amplified， with each pair of primers amplifying a range of 3-8 labeled alleles. The average Shannon diversity index was 1.378. （2） Six core primer sites were selected from 16 pairs of primers， which can effectively detect and identify 26 materials in this study. （3） UPGMA evolutionary map of individual samples could divide all 48 materials into 7 categories. Wild tea plants and cultivated tea plants could be effectively divided through SSR detection. Population genetic structure analysis suggests that 26 wild tea samples could be divided into 2 subgroups. （4） Based on biochemical components， two samples with high EGCG content and two tea germplasms suitable for making black tea were selected. Results of this research show that diversity level of wild tea resources in Badong was high， with high genetic variation within the population. This study laid a foundation for further protection， development and utilization of wild tea germplasm resources in Badong.

Keywords： wild tea plant， diversity， SSR， genetic relationship

巴東縣位于湖北省西南部，臨近我國西南地區(qū)茶樹起源地[1]。巴東茶樹種植歷史悠久[2-3]，當(dāng)?shù)噩F(xiàn)存的野生茶樹種質(zhì)資源豐富[4-5]。野生古樹具有重要的文化、生態(tài)及保護(hù)與開發(fā)等多方面研究價值[6]。野生茶樹擁有豐富的遺傳多樣性[7]，具有重要的開發(fā)利用價值[8-10]，是重要的初級種質(zhì)資源[11-12]。開展茶樹種質(zhì)資源遺傳多樣性研究，對野生茶樹鑒定與評價等具有重要意義。同時也是開展地方茶樹種質(zhì)資源普查評價、篩選開發(fā)利用茶樹新品種，以及發(fā)掘與地方茶葉生產(chǎn)緊密相關(guān)優(yōu)異品種資源的重要基礎(chǔ)。

簡單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR）分子標(biāo)記作為一種優(yōu)良的共顯性遺傳檢測工具，一般包含2～6個寡聚核苷酸，長度在200 bp以下，具有試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好、多態(tài)性高[13]，適用于整個基因組等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于茶樹及其他物種的遺傳分析研究[14-16]。

本研究從湖北省巴東縣境內(nèi)考察采集了26份野生茶樹樣本，以來源廣泛的22份栽培型茶樹品種為對照，采用SSR分子標(biāo)記手段檢測分析巴東縣境內(nèi)野生茶樹的遺傳資源多樣性及種群間與種群內(nèi)變異情況，并對野生茶樹的生化成分差異進(jìn)行分析評價，從而闡明巴東縣野生茶樹的遺傳多樣性和地理分布特點(diǎn)，以期為巴東縣野生茶樹種質(zhì)資源的保護(hù)及開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

在湖北省恩施州巴東縣自然保護(hù)區(qū)天然林區(qū)（Pop-a）、沿渡河鎮(zhèn)（Pop-b）、信陵鎮(zhèn)（Pop-c）、野三關(guān)鎮(zhèn)（Pop-d）4個野生茶樹分布集中區(qū)域進(jìn)行考察，共采集26份野生茶樹樣本，分別編號1～26。樣本采集時間為2022年5月和6月，灌木型茶樹采集嫩葉新梢，喬木型茶樹采集成熟葉片。野外樣本采集后，立即放入便攜式低溫冰箱保存，返回實(shí)驗(yàn)室后立即置于﹣80 ℃冰箱保存，樣本具體信息見表1。另選取22個種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所嵊州基地的無性系栽培茶樹品種作為對照，編號為101～122，所有供試樣本品種及信息詳見表1。

1.2 DNA提取及檢測

DNA的提取使用植物基因組提取試劑盒[DP350天根生化科技（北京）有限公司]，提取方法及操作參照說明書?；蚪M提取后，使用超微量分光光度計(jì)（NanoDrop 1000，賽默飛世爾）測定DNA的濃度和純度。根據(jù)樣本DNA的濃度，將每個樣品DNA稀釋到20 ng·μL-1，﹣20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 候選SSR引物的PCR擴(kuò)增

參考文獻(xiàn)[17]，本研究從中挑選多態(tài)性"高、條帶清晰的16對SSR引物（表2）用于試驗(yàn)。

PCR反應(yīng)體系參照徐禮羿等[18]的方法并稍作修改：Reaction Mix（含DNA Polymerase、2×PCR Buffer、MgCl2和dNTP）5.0 μL，模板DNA 4.0 μL，正反向引物（10 ng·μL-1）各0.2 μL，加ddH2O至10 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共計(jì)35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的PAGE電泳和銀染顯色

擴(kuò)增產(chǎn)物加入1.5 μL 6×Loading Buffer混勻，進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyac-rylamide gel electrophoresis，PAGE），每100 mL的10% PAGE按如下比例配制：46 mL ddH2O、20 mL 5×TBE、33 mL 30% A/B溶液、1 mL10%過硫酸銨和100 μL TEMED溶液。電泳在CBS MGV-202-33型垂直電泳儀上進(jìn)行，電泳結(jié)束后進(jìn)行銀染顯色，并用Bio-Rad Gel Doc2000凝膠成像儀拍照，然后用保鮮膜將凝膠置于冰箱保存。

1.5 生化成分檢測

咖啡堿檢測采用GB/T 8312—2013高效液相色譜（High performance liquid chrom-atography，HPLC）法，氨基酸組分、兒茶素組分含量檢測分別按照GB/T 30987—2014和GB/T 8313—2018的HPLC法。

1.6 數(shù)據(jù)處理

SSR試驗(yàn)結(jié)果采用人工讀帶的方法，將電泳圖上的目的片段范圍內(nèi)清晰的條帶按照分子量大小，從大到小依次記作A、B、C、D……，單一條帶為純合基因型，兩條條帶為雜合基因型，因條帶的大小不同分別記錄為AA、AB、BB、AC、AD、CD等，條帶缺失記為“0”。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel，建立起原始基因型數(shù)據(jù)矩陣。茶葉生化成分統(tǒng)計(jì)分析用Excel 2010分析，適制性茶類采用茶多酚與氨基酸比值進(jìn)行評價篩選，酚氨比小于8的預(yù)判適宜制綠茶，酚氨比大于8的預(yù)判適宜制紅茶等類別[19]。

SSR結(jié)果分析時，先將26個巴東野生茶樹樣本和22個無性系栽培種茶樹樣本分為2個種群。采用GenAlEx 6.5.0.3軟件[20]進(jìn)行一系列標(biāo)記鑒別力、雜合度、基因頻率、遺傳多態(tài)信息量和香農(nóng)指數(shù)等參數(shù)的運(yùn)算。將原始基因型數(shù)據(jù)矩陣轉(zhuǎn)換為軟件所需的格式，Excel的第一行分別填寫位點(diǎn)數(shù)、樣本數(shù)、種群數(shù)及各個種群所含有的樣本數(shù)；Excel第一列為樣本編號，第二列為樣本對應(yīng)的種群名，第3列起為標(biāo)記列，每個標(biāo)記占2列，將等位位點(diǎn)分列，并將基因型A、B、C…替換為數(shù)字形式的1、2、3…，缺失位點(diǎn)用“0”表示。按照供試樣本的基因型數(shù)據(jù)，將其轉(zhuǎn)換成PowerMarker v3.25軟件[21]要求的數(shù)據(jù)格式?；凇癗ei.1983”計(jì)算樣本間的遺傳距離并進(jìn)行非加權(quán)組平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）進(jìn)化樹構(gòu)建。供試樣本按照鄰接法（Neighbor-joining）得到結(jié)果并導(dǎo)入在線工具ITOL（https：//itol.embl.de）進(jìn)行進(jìn)化樹美化。種群結(jié)構(gòu)分析使用Structure軟件[22]，Structure軟件采用馬爾科夫鏈蒙特卡洛方法（Markov Chain Monte Carlo，MCMC）開始的不作數(shù)迭代（Length of burn-in period），參數(shù)設(shè)置為10 000，迭代后的MCMC重復(fù)數(shù)次為50 000；K值范圍：1～7，每個K值重復(fù)驗(yàn)算5次，結(jié)果導(dǎo)出至在線分析工具Structure Harvester[23]確定最佳K值，并依據(jù)最佳K值作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記遺傳多態(tài)性

由表3可知，本研究使用的16對引物在26份巴東野生茶樹種質(zhì)資源樣本表現(xiàn)出較高水平的多態(tài)性。16對SSR引物共得到等位位點(diǎn)（Na）數(shù)量為82個，擴(kuò)增得到的等位基因范圍3～8個，平均每個引物擴(kuò)增出等位位點(diǎn)5.12個，平均有效位點(diǎn)（Ne）數(shù)量3.65個。有5對引物（CsFM1715、CsFM1622、CsFM1585、CsFM1125、CsFM1131）得到的有效位點(diǎn)數(shù)量超過4個；觀測雜合度（Ho）范圍為0.385～0.885，平均觀測雜合度為0.650；期望雜合度（He）范圍為0.557～0.830，平均值期望雜合度為0.707，說明這些引物在26個巴東野生茶樹中擴(kuò)增多態(tài)性較好。結(jié)合香農(nóng)多樣性指數(shù)（I）來看，16對SSR引物香農(nóng)多樣性指數(shù)范圍為1.023～1.903，香農(nóng)多樣性指數(shù)平均值達(dá)到1.378，說明本研究選用的SSR引物多態(tài)性較好。

2.2 標(biāo)記引物的鑒別能力

將基因型數(shù)據(jù)導(dǎo)入到GenAlEx軟件，進(jìn)行16對引物復(fù)合位點(diǎn)組合增加同一性概率（Probability of identity at a locus，PI）和PIsibs（Probability of identity for sibs at a locus）值分析，得出16對試驗(yàn)標(biāo)記引物非同一概率值如表4所示。16個SSR位點(diǎn)的PI值范圍在0.049 9～0.246 8，平均值為0.140 9。所有位點(diǎn)獨(dú)立分離的情況下，16個SSR位點(diǎn)組合后2個隨機(jī)樣本存在同一種基因型組合的概率（PI for increasing locus combinations）為4.8×10-15。所有位點(diǎn)未獨(dú)立分離的情況下，從群體中找到2個具有同一種基因型組合的概率（PIsibs for increasing locus combinations）為1.3×10-6。PI值最小為0.049 9，PIsibs值最小的為0.347 7，對應(yīng)引物均為CsFM1715，說明該引物對任意2個樣本鑒定為同一基因型的概率值最小，表明該引物鑒別能力最強(qiáng)。

16對SSR標(biāo)記對26份野生茶樹擴(kuò)增位點(diǎn)的非同一概率值作圖，如圖1所示，隨著SSR位點(diǎn)從1個增加到16個，樣本組隨機(jī)2個個體具有同一種基因型組合的概率PI從0.2降到4.8×10-15，PIsibs從0.48降到1.3×10-6。選用6個引物組合時，在這26份巴東野生茶樹資源中任意兩份資源具有相同基因型的概率幾乎為零，當(dāng)選擇6個核心SSR標(biāo)記組合時，PI和PIsibs分別為1.0×10-5和7.7×10-3（圖1）。結(jié)合表4中16對引物PI和PIsibs的最小值，可以選取CsFM1715、CsFM1131、CsFM1585、CsFM1125、CsFM1622、CsFM1390這6個核心引物作為后期構(gòu)建26份巴東野生茶樹品種的分子指紋圖譜。

2.3 48份茶樹種質(zhì)樣本個體間的聚類分析

近年來，野生茶樹種質(zhì)資源在多個產(chǎn)茶區(qū)受到關(guān)注[24-26]，為探究巴東縣野生茶樹與常見栽培型茶樹的區(qū)別，以及推測巴東縣境內(nèi)野生茶樹遺傳進(jìn)化途徑，將26份巴東野生茶樹種質(zhì)作為試驗(yàn)群體，以22個栽培型茶樹品種作為對照，基于Nei’s遺傳距離，采用UPGMA法聚類得到48份茶樹種質(zhì)個體間聚類圖（圖2）。結(jié)果表明，48份茶樹資源大致分為7個類群。類群1共5個樣本，包含2個巴東野生茶樹和3個無性系茶樹種質(zhì)；類群2的3個樣本均為巴東縣野生茶樹，分別為巴東縣信陵鎮(zhèn)和沿渡河鎮(zhèn)的野生茶樹。類群3共10個樣本，除了中茶108、桂林3號2個栽培種茶樹，另外8個為巴東縣沿渡河鎮(zhèn)和信陵鎮(zhèn)樣本。類群4共有7個樣本，主要為巴東野生茶樹種質(zhì)，僅有1個栽培種保靖黃金茶1號，推測該6個巴東野生茶樹與湖南保靖黃金茶遺傳進(jìn)化來源相近，結(jié)合地理位置分析，保靖黃金茶1號屬于湖南省湘西州，與巴東縣所屬恩施州毗鄰，因此這6個巴東野生茶樹與保靖黃金茶栽培種的來源接近。類群5包含3個栽培種茶樹，1個來自安徽的農(nóng)抗早和2個來自浙江的白葉1號和中黃1號。類群6共9個樣本，其中鄂茶4號、鄂茶10號2個栽培型茶樹品種與其余7個巴東野生茶樹聚類一類，推測這7個野生茶樹種質(zhì)與湖北省栽培型茶樹品種遺傳背景較為相近；類群7全部11個樣本均為栽培型茶樹品種。

2.4 巴東縣野生茶樹種群結(jié)構(gòu)及親緣關(guān)系分析

為進(jìn)一步了解巴東縣野生茶樹種群內(nèi)部遺傳結(jié)構(gòu)及親緣距離，以地理位置為種群劃分，基于種群間遺傳距離，得出巴東野生茶樹與栽培種茶樹種群之間的聚類結(jié)果如圖3所示。栽培型茶樹種群、野三關(guān)鎮(zhèn)種群各自為一個類別，沿渡河鎮(zhèn)種群與巴東自然保護(hù)區(qū)天然林區(qū)種群、信陵鎮(zhèn)種群遺傳距離較為接近聚為一類。種群間遺傳距離指數(shù)表明（表5），巴東野生茶樹中，巴東自然保護(hù)區(qū)天然林區(qū)與沿渡河鎮(zhèn)、信陵鎮(zhèn)之間種群距離分別達(dá)到0.379和0.391，小于巴東自然保護(hù)區(qū)天然林區(qū)與栽培型茶樹種群遺傳距離（0.543），遠(yuǎn)小于與野三關(guān)鎮(zhèn)的遺傳距離（0.889）。沿渡河鎮(zhèn)與信陵鎮(zhèn)種群之間遺傳距離（0.183）小于其與栽培型茶樹種群之間的遺傳距離（0.216），也小于與野三關(guān)鎮(zhèn)的遺傳距離（0.288）。信陵鎮(zhèn)與栽培型茶樹群體和野三關(guān)鎮(zhèn)的遺傳距離與上述結(jié)果相同。這說明巴東自然保護(hù)區(qū)天然林區(qū)與沿渡河鎮(zhèn)、信陵鎮(zhèn)這3個組合的親緣關(guān)系相比于它們與栽培型茶樹品種種群要更為接近。而野三關(guān)鎮(zhèn)茶樹種群與其他3個種群的遺傳距離甚至超過與栽培型茶樹種群的遺傳距離。

為有效區(qū)分26份野生茶樹資源內(nèi)部之間種群，首先根據(jù)巴東野生茶樹和栽培型茶樹分為2個類群進(jìn)行分子方差分析（Analysis of molecular variance，AMOVA），結(jié)果顯示（圖4），16個SSR位點(diǎn)的基因型頻率在樣本中的分子變異表現(xiàn)出組間（4%）＜組內(nèi)（8%）＜個體間（88%）。說明初步按照野生茶樹和栽培型茶樹2個類群進(jìn)行樣本分群劃分，48份供試樣本的分子遺傳變異主要源于個體間，根據(jù)2種不同類型茶樹種群進(jìn)行分組的方式僅能解釋4%的組間變異。表明巴東縣26份野生茶樹種質(zhì)資源的分子變異主要源于個體變異，不能單獨(dú)作為1個巴東野生茶樹群體進(jìn)行亞型分類。基于此，利用Structure軟件開展26份巴東野生茶樹種群遺傳結(jié)構(gòu)分析，當(dāng)K值等于2時，L（K）值達(dá)到峰值，選取該點(diǎn)為最佳分群的K值，即表示來自4個鄉(xiāng)鎮(zhèn)區(qū)域的26份巴東野生茶樹樣本應(yīng)分為2個亞群。

圖5可以看出，巴東野生茶樹種質(zhì)資源樣本中，總體上1～6號6個野生茶樹樣本可以歸為一個亞群，7～26號20個樣本歸為另一個亞群。Structure分類結(jié)果顯示，少數(shù)沿渡河鎮(zhèn)和巴東自然保護(hù)區(qū)天然林區(qū)樣本被歸為一個亞群，多數(shù)沿渡河鎮(zhèn)和野三關(guān)鎮(zhèn)等區(qū)域的樣本被分為一個亞群。結(jié)合4個采樣區(qū)域分析發(fā)現(xiàn)，1～6號樣本亞群分類總體位于沿渡河鎮(zhèn)北端，7～26號亞群位于沿渡河鎮(zhèn)南端和巴東縣南端的信陵鎮(zhèn)、野三關(guān)鎮(zhèn)。以上結(jié)果說明巴東野生茶樹種質(zhì)資源遺傳背景清晰，2個亞群分類基本圍繞沿渡河鎮(zhèn)南北兩端展開，親緣關(guān)系較為單一。

2.5 野生茶樹樣本內(nèi)含物質(zhì)成分評價

對26份巴東野生茶樹樣本進(jìn)行HPLC法檢測，樣品兒茶素組分、氨基酸組分含量結(jié)果分別如圖6和圖7所示。

巴東野生茶樹共檢測了7種兒茶素組分，包括EGC、C、EC和GC 4種非酯型兒茶素，以及CG、GCG、ECG 3種酯型兒茶素。兒茶素總量含量范圍在0.14%～19.17%，差異范圍較大。26份野生茶樹樣本非酯型兒茶素總含量范圍在0.03%～7.09%，酯型兒茶素總量范圍在0.11%～12.93%。非酯型兒茶素C、EC和GC在26份野生茶樹中含量范圍較低，C含量范圍為0.01%～0.64%，平均含量0.19%；EC含量范圍為0.01%～1.24%，平均含量0.44%，GC含量范圍為0.03%～0.56%，平均含量為0.25%。EGC含量范圍為0.03%～5.84%，其中EGC含量大于5%的野生茶樹樣本為小神農(nóng)架野生茶樹1號和羅溪壩古茶樹3號。酯型兒茶素方面，EGCG含量范圍為0.09%～11.19%，GCG含量范圍為0.01%～0.04%，ECG含量范圍0.01%～2.27%。酯型兒茶素總量大于10%的有4個樣本，分別是沙灣大葉茶1號、沙灣大葉茶2號、樟樹村大茶樹5號和金竹園大茶樹5號，其中沙灣大葉茶1號和沙灣大葉茶2號分別達(dá)到12.29%、12.93%。

26份巴東野生茶樹共檢測了19種氨基酸組分。氨基酸平均含量前3為茶氨酸（Thea）、谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp），其次為谷氨酰胺（Gln）、絲氨酸（Ser）、纈氨酸（Val）、酪氨酸（Tyr）。組氨酸（His）、脯氨酸（Pro）、半胱氨酸（Cys）和亮氨酸（Leu）4種氨基酸在巴東野生茶樹中含量較低。氨基酸總量方面，26份巴東野生茶樹樣本氨基酸總量范圍為0.41%～2.25%，氨基酸總量較高的有神農(nóng)6號、樟樹村大茶樹4號、樟樹村大茶樹5號、金竹園大茶樹1號、金竹園大茶樹2號、金竹園大茶樹4號共5個樣本。

參照《農(nóng)作物優(yōu)異種質(zhì)資源評價規(guī)范 茶樹》（NY/T 2031—2011）[27]相關(guān)指標(biāo)，結(jié)合圖6和圖7結(jié)果可以得出，巴東縣野生茶樹樣本中低咖啡堿含量樣本4份，高EGCE樣本2份。

為將采集到的地方野生茶樹樣本有效利用，對野生茶樹樣本進(jìn)行歸類及評價，得出本研究兒茶素總量方面潛在優(yōu)良資源（兒茶素總量在15%～20%）4份，其他類種質(zhì)資源如酯型兒茶素＞120 mg·g-1共2份，非酯型兒茶素總量占比大于50%共2份，富含EGC（＞5%）共2份。此外，結(jié)合表6可知，小神農(nóng)架野生茶樹1號為高兒茶素含量樣本，富含EGC；沙灣大葉茶1號、沙灣大葉茶2號為高EGCG、高酯型兒茶素的樣本。將野生茶樹樣本根據(jù)酚氨比進(jìn)行初步適制茶類篩選，發(fā)現(xiàn)26份樣本資源酚氨比范圍在2.29～11.53，其中堆子場沙

灣大茶樹、金竹園大茶樹2號、金竹園大茶樹4號、高陽寨大茶樹2號4個樣本酚氨比小于8，為適制綠茶類茶樹資源。小神農(nóng)架野生茶樹1號、羅溪壩古茶樹3號、樟樹村大茶樹2號、樟樹村大茶樹5號4個樣本酚氨比大于8，其中小神農(nóng)架野生茶樹1號、羅溪壩古茶樹3號分別達(dá)到10.07、10.54，均大于10，可初步判斷作為當(dāng)?shù)剡m制紅茶樣本資源。

3 討論

3.1 SSR分子標(biāo)記的檢測能力

本研究選取16個SSR標(biāo)記進(jìn)行多樣性分析，篩選出其中6個核心標(biāo)記引物，可準(zhǔn)確地檢測區(qū)分26份巴東縣野生茶樹種質(zhì)資源。研究使用的16對SSR分子標(biāo)記引物來源于Tan等[17]開發(fā)的SSR引物序列，該類型引物對中小葉種茶樹效果明顯，也可有效用于多種不同類型茶樹種質(zhì)[28-29]。本研究結(jié)果顯示，巴東縣野生茶樹遺傳多樣性結(jié)果中，共有6個SSR標(biāo)記香農(nóng)多樣性指數(shù)值大于1.5，16個SSR標(biāo)記的香農(nóng)多樣性指數(shù)均大于1.0，最小的達(dá)到1.023。說明本研究選取的16個標(biāo)記整體多態(tài)性較好，符合此類中小葉種野生茶樹資源的檢測要求。

3.2 巴東縣野生茶樹種質(zhì)資源結(jié)構(gòu)及親緣關(guān)系

本研究的48份材料依據(jù)遺傳距離可分為7個類別，26份巴東野生茶樹樣本被劃分到其中的5個類別。類群1分組中野三關(guān)鎮(zhèn)高陽寨大茶樹1號、高陽寨大茶樹2號和3個栽培型茶樹品種親緣關(guān)系接近。由于高陽寨大茶樹1號、高陽寨大茶樹2號均位于同一村寨，且兩個樣本表型相似，均為小喬木，推測兩個樣本親緣關(guān)系較近。類群2分組為3個巴東野生茶樹，而在該分組類別中金竹園大茶樹2號和金竹園大茶樹3號又被劃分為其中一個小的分類，而羅溪壩古茶樹3號為沿渡河鎮(zhèn)羅溪壩村古茶樹，結(jié)合3者遺傳分類及地理特點(diǎn)，推測羅溪壩村古茶樹3號有可能是由信陵鎮(zhèn)金竹園村附近引種而來。類群3分組包含3個小的類別共10個樣本，其中兩個無性系茶樹品種桂林3號、中茶108被劃分在其中1個小的類別，推測該分組的8個巴東野生茶樹與中茶108等相關(guān)無性系茶樹品種親緣關(guān)系相近。類群4中栽培型茶樹保靖黃金茶1號和其他6個巴東野生茶樹聚在一起，表明它們之間存在相關(guān)親緣關(guān)系。類群6中鄂茶4號、鄂茶10號同為湖北省主栽茶樹品種，與其他7個巴東野生茶樹聚在一起，說明它們之間親緣關(guān)系接近。類群7及類群5全部為栽培型茶樹品種，這兩個栽培型茶樹分組與其他包含野生茶樹的5個分組有明顯區(qū)別。說明本次SSR遺傳多樣性試驗(yàn)結(jié)果能有效地將兩種不同類型茶樹種質(zhì)資源進(jìn)行劃分。同時表明野生茶樹與栽培型茶樹遺傳多樣性具有不同的特點(diǎn)。

按照地理位置劃分進(jìn)行種群聚類分析時，巴東縣3個鄉(xiāng)鎮(zhèn)野生茶樹群體組合之間遺傳距離小于它們和栽培種茶樹之間遺傳距離，說明這3個鄉(xiāng)鎮(zhèn)野生茶樹群體之間親緣關(guān)系更為接近。聚類分析及Structure分析表明，巴東縣野生茶樹樣本中地理位置相似的樣本基本都能被劃為一類，這表明不同樣本間存在明顯地理位置特點(diǎn)。AMOVA分析顯示，巴東縣野生茶樹來自種群內(nèi)個體解釋量達(dá)到88%，這說明種群內(nèi)遺傳變異高。樣本的UPGMA聚類顯示，巴東縣野生茶樹樣本大多數(shù)表現(xiàn)為各自聚為一個類別，而栽培型茶樹聚為另一個類別，這表明多數(shù)野生茶樹內(nèi)部遺傳分化小。綜上表明，巴東野生茶樹遺傳背景清晰，親緣關(guān)系簡單，具有較高的種質(zhì)資源開發(fā)潛力。

3.3 野生茶樹生化成分分析

兒茶素組分及其總量是茶葉生化成分常規(guī)指標(biāo)之一，也是茶葉品質(zhì)的重要代表，兒茶素在茶葉品質(zhì)中主要呈現(xiàn)在茶湯的苦澀味方面[30]。前人研究表明，非酯型兒茶素含量占兒茶素總量比例超過50%的茶樹相對進(jìn)化程度低，且野生茶樹有高茶多酚向低茶多酚進(jìn)化趨勢[31-32]；本研究中，羅溪壩古茶樹2號和高陽寨大茶樹3號2個樣本的非酯型兒茶素占比大于50%，與其研究結(jié)果相一致。本研究將酚氨比作為初步判斷適制綠茶、紅茶標(biāo)準(zhǔn)[33-34]，共篩選8份適制類茶樹資源，其中4份酚氨比小于8的適制綠茶類樣本，4份酚氨比大于8的適制紅茶類樣本，其中小神農(nóng)架野生茶樹1號和羅溪壩古茶樹3號2份種質(zhì)資源為酚氨比大于10的樣本，可為后續(xù)選育紅茶品種提供一定的參考。

咖啡堿和氨基酸是茶樹區(qū)別于其他植物的特殊成分，本研究中巴東縣野生茶樹有4份樣本的咖啡堿含量≤1.5%[27]，可為低咖啡堿茶樹品種的選育提供原始種質(zhì)資源。但本研究中多數(shù)野生茶樹氨基酸總量偏低，部分結(jié)果表現(xiàn)與前人研究不一致，可能是由于本研究樣本多為夏秋季成熟葉或野生茶樹下端定型葉，試驗(yàn)樣本原料成熟度偏高所致。

4 結(jié)論

本研究利用16對SSR引物，分析了湖北巴東縣境內(nèi)26份野生茶樹種質(zhì)資源的遺傳多樣性及種群親緣關(guān)系，篩選出了6對核心標(biāo)記引物，同時檢測了巴東縣野生茶樹兒茶素、氨基酸等生化成分含量，并進(jìn)行了初步評價及篩選，研究結(jié)果為巴東縣野生茶樹種質(zhì)資源保護(hù)及發(fā)掘利用提供了重要的研究基礎(chǔ)。

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