氟處理下茶樹根系的組織細胞形態(tài)差異及蠟質合成相關基因WSD1的表達分析

摘要：茶樹是一種氟含量較高的植物，具有聚氟性。基于掃描電鏡技術，探究不同質量濃度（10 mg·L-1和50 mg·L-1）及不同時間（1 d和16 d）氟處理下，氟高富集茶樹品種黃棪和氟低富集茶樹品種佛手根系吸收富集氟的特性差異，并對前期轉錄組數(shù)據(jù)篩選出氟處理下茶樹蠟質合成的差異基因WSD1進行分析。結果顯示，50 mg·L-1氟處理后，黃棪根部表皮細胞表面覆蓋的蠟質稍有增多，細胞排列較為疏松，而佛手根部表皮細胞界限模糊，覆蓋蠟質明顯增多，細胞壁出現(xiàn)扭曲斷裂等氟不耐受癥狀。蠟質合成相關基因WSD1熒光定量結果顯示，WSD1經(jīng)外源氟處理后，其對茶樹根部的蠟質有較為明顯的上調作用；WSD1蛋白互作網(wǎng)絡預測結果及相關性分析顯示，WSD1受CSS0041298、CSS0012327及CSS0049082的負調控。本研究從茶樹與蠟質合成互作角度探究茶樹緩解氟脅迫的響應機制，為深入探究茶樹氟吸收調控和耐氟茶樹品種的選育提供科學依據(jù)。

關鍵詞：茶樹；氟；SEM；蠟質合成基因

中圖分類號：S571.1；Q52 " " " " " " " " 文獻標識碼：A " " " " " " " 文章編號：1000-369X（2024）02-219-12

Physiological Differences and Expression Analysis of Wax Synthesis Related Gene WSD1 in Tea Roots Treated with Fluorine

SONG Bo1，3， JIA Peining1，3， YE Wenqi1，3， WU Jun1，3， SUN Weijiang1，3*， XUE Zhihui2，3*

1. College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， China;

2. Anxi College of Tea Science， Fujian Agriculture and Forestry University， Anxi 362406， China;

3. Tea Industry Engineering Technology Research Center of Fujian Province， Fuzhou 350002， China

Abstract： Tea plant， as one of the plants with high fluorine contents， has fluoride-polymerizing property. In this paper， based on scanning electron microscopy， the roots of ‘Huangdan’ and ‘Foshou’ were treated with different fluoride concentrations （10 mg·L-1 and 50 mg·L-1） and different time periods （1 d and 16 d）. The differentially expressed gene WSD1 of tea wax synthesis under fluoride treatment was screened from the transcriptome data of our research group. The results show that under 50 mg·L-1 fluoride treatment， the epidermal cells of ‘Huangdan’ root had slightly more wax on the surface and relatively loose cell arrangement， while the epidermal cells of ‘Foshou’ root had blurred boundaries， significantly more wax on the surface， and fluorine intolerance symptoms such as cell wall distortion and breakage. Quantitative fluorescence results of WSD1 related to wax synthesis show that WSD1 had a significant up-regulation effect on the wax content of tea root under exogenous fluoride treatment. The prediction results of WSD1 protein interaction network and correlation analysis show that WSD1 was negatively regulated by CSS0041298， CSS0012327 and CSS0049082. This study provided a theoretical reference for alleviating fluorine stress in tea plants from the perspective of the interaction between tea plants and wax synthesis， and provided a scientific basis for further exploring the regulation of fluorine absorption in tea plants and the breeding of fluorine-tolerant tea cultivars.

Keywords： tea plant， fluorine， SEM， wax synthetic genes

茶樹[Camellia sinensis （L.） O. Kuntze]是氟超富集植物，通過土壤、水及空氣吸收并積累氟化物[1-2]。研究表明，在水溶性氟質量濃度低于1.0 mg·L-1的土壤中，茶樹新梢可富集氟100～300 mg·kg-1，成熟葉和老葉可富集氟1 000～3 000 mg·kg-1，且茶樹仍能正常生長，不表現(xiàn)受害癥狀[3]。富集系數(shù)（Bioaccumulation factor，BF）表示培養(yǎng)介質-植物體系中元素遷移的難易程度，富集系數(shù)越高，表明植物吸收能力越強[4-5]。通常將富集系數(shù)＞1作為衡量超富集植物的判斷指標[3]。研究表明，黃棪與毛蟹是高積累氟的茶樹品種；佛手與肉桂是低富集氟的茶樹品種[6]。賈培凝[7]研究發(fā)現(xiàn)，在同一土培環(huán)境下，佛手氟含量顯著低于其他品種，黃棪氟含量顯著高于肉桂、水仙和佛手，是佛手的2.65倍。茶樹根系極易吸收土壤中的氟，大多數(shù)氟最終被運輸并聚集至葉片中[8-9]。氟元素并非茶樹生長發(fā)育的必需營養(yǎng)元素[10]，低濃度氟能在一定程度上促進茶樹生長，而高濃度氟則會抑制茶樹正常生長，使茶樹表現(xiàn)出受脅迫毒害癥狀[11-14]。彭傳燚[15]研究表明，當水培溶液中氟的質量濃度小于50 mg·L-1時，茶樹基本處于正常發(fā)育狀態(tài)，且較低濃度的氟能促進茶樹生長；當水培溶液中氟的質量濃度達到50 mg·L-1時，6 d后茶樹根系出現(xiàn)發(fā)黑的情況，受脅迫癥狀隨處理時間延長而加重；當水培溶液中氟質量濃度超過50 mg·L-1，則對茶樹根系產生明顯負效應。

植物表皮細胞有一層蠟封的角質層，主要是由一些C20～C34超長鏈脂肪酸（Very long chain fatty acids，VLCFAs）及其衍生物組成的疏水有機混合物[16-17]。植物表皮蠟質作為植物應對外界環(huán)境變化的最外層屏障，在響應外界非生物脅迫和生物脅迫等方面起著重要作用[18]。植物表皮蠟質的?；铣赏緩街?，VLCFAs被還原成初級醇，初級醇再經(jīng)蠟酯合成酶（Ws）的催化，發(fā)生縮合反應生成烷基酯[19]。WSD1在蠟質合成過程中扮演著十分重要的角色，其主要編碼蠟酯合成酶，擬南芥中的AtWSD1具有較高水平的蠟酯合成酶活性[20]。此外，WSD1還編碼了二?；视王；D移酶[21]。研究表明，外源氟濃度超標會引起植物脂肪酸的過氧化，而脂肪酸作為茶樹蠟質層的主要成分，使得表皮細胞的蠟質合成受到氧化變質影響，進而引發(fā)細胞損傷[22]，因此研究茶樹表皮蠟質合成途徑中相關基因在不同濃度氟處理下的表達情況十分必要。

以往研究較多集中于氟在茶樹亞細胞的分布，對于氟處理對不同品種茶樹細胞超微結構影響的對比研究鮮有報道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃棪和佛手分別為氟高富集和氟低富集茶樹品種，本研究以黃棪與佛手為試驗材料，對不同氟富集茶樹品種根系進行不同氟濃度和不同時間的交叉處理，采用掃描電鏡（Scanning electron microscope，SEM）技術[23]探究2個品種的根系表面結構對氟響應的差異，并結合前期課題組茶樹根系氟處理轉錄組結果進行深層挖掘，旨在為深入研究不同氟富集茶樹品種根系的組織細胞形態(tài)差異提供試驗依據(jù)，并為耐氟茶樹品種分子育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2022年10月28日選取長勢一致的黃棪和佛手的1年生扦插茶苗作為試驗材料。對供試茶苗饑餓培養(yǎng)3 d后，轉入全營養(yǎng)液培養(yǎng)1～2周。氟處理氟的質量濃度分別為10 mg·L-1和50 mg·L-1（氟以氟化鈉形式加入），處理時間為1 d和16 d，以不加氟元素的溶液作為空白對照。營養(yǎng)液pH為4.8～5.2，每4 d更換1次，24 h提供泵氧。人工氣候培養(yǎng)室光照周期及溫度設置為白天28 ℃ 16 h，夜晚20 ℃ 8 h，濕度為75%。分別在處理1 d和16 d后，取各處理組佛手和黃棪的根系樣品，3個生物學重復，編號如表1所示。

選取實驗室前期外源氟處理下佛手和黃棪空白對照組和50 mg·L-1處理組的轉錄組測序結果，用于驗證分析。

1.2 氟含量及氟富集系數(shù)測定方法

選取兩個品種茶樹根系樣品于110 ℃恒溫干燥箱中干燥10 min，70 ℃烘至足干，再使用磨樣機將樣品磨碎后置于﹣20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩７繙y定參考GB/T 5009.18—2003中氟離子選擇電極法。氟富集系數(shù)測定參考文獻[5]，其數(shù)值為茶樹氟含量與培養(yǎng)介質全氟含量之比，數(shù)值越大表明茶樹對氟的富集能力越強，反之越弱。

1.3 SEM觀察的材料制備

參考文獻[23]中的方法，選取根尖部分，切割成小于2 cm的組織塊。使用5%的戊二醛固定樣品4 h，磷酸緩沖液清洗樣品3遍，1%鋨酸固定4 h，蒸餾水清洗3遍，50%、70%、80%、90%、100%乙醇逐級脫水。脫水后環(huán)氧丙烷置換2遍，然后進行臨界點干燥（日立HCP-2臨界點干燥儀），再上臺噴金（EIKO IB-5離子鍍膜儀），最后用JSM6380LV掃描電子顯微鏡（日本電子株式會社）進行掃描電鏡觀察，拍照。

1.4 茶樹總RNA提取和質量檢測

選用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取茶苗根部的總RNA，使用超微量紫外可見分光光度計（賽默飛世爾科技）測定RNA濃度，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。

1.5 實時熒光定量PCR驗證

選取與蠟質合成途徑相關的WSD1差異表達基因進行實時熒光定量PCR測定，使用DNAMAN軟件設計差異基因特異性引物，正向引物序列為TACCGTGTCCACCACTCCA，反向引物序列為ACGAAGTCGCCACATACAA。選擇CsGAPDH作為內參基因，反應體系10 μL，SYBR Green qPCR Master Mix 5 μL，ddH2O 3 μL，上下游引物各0.5 μL，模板1 μL。反應程序為95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，35個循環(huán)。

1.6 WSD1蛋白亞細胞定位及蛋白互作網(wǎng)絡預測

以HBT質粒作為空載體，將經(jīng)測序比對所得的正確重組質粒通過凍融法轉入農桿菌GV3101中，于LB液體培養(yǎng)基中搖至菌液濃度OD600介于0.6～0.8，6 000 r·min-1離心5 min收集菌體，室溫靜置4 h后將侵染液注射到本氏煙草葉片，黑暗培養(yǎng)12 h后正常培養(yǎng)12 h，進行激光共聚焦觀察熒光。將WSD1蛋白序列導入String在線數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org），獲得WSD1蛋白互作網(wǎng)絡。將WSD1蛋白啟動子上游1 000 bp序列導入PlantTFDB在線數(shù)據(jù)庫（http：//planttfdb.gaolab.org），設置Plt;1E-7，預測轉錄因子調控網(wǎng)絡，將蛋白互作網(wǎng)絡和轉錄因子調控網(wǎng)絡導入Cytoscape 3.8.2繪制WSD1蛋白互作網(wǎng)絡圖。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 25.0軟件Duncan法（P＜0.05）進行顯著性分析，采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析和繪圖，使用Tbtools軟件進行相關性分析[24]。

2 結果與分析

2.1 不同氟富集茶樹品種根系富集氟的差異

由表2可知，兩個茶樹品種根系氟含量均隨營養(yǎng)液中氟濃度升高而升高，黃棪根系的氟含量在同一濃度和同一時間氟處理下均高于佛手，表明兩個茶樹品種根系對于不同氟濃度處理的響應程度不同，黃棪的響應更劇烈。在10 mg·L-1和50 mg·L-1氟處理下，兩個品種第16天的氟含量均顯著高于第1天。

由表3可知，不同濃度氟處理1 d后，茶樹根部富集系數(shù)均大于1，說明兩個茶樹品種根系均具備植物氟超富集特性；同一茶樹品種在不同濃度氟處理下，低濃度處理組的根部富集系數(shù)均近2倍高于高濃度處理組。第16天高濃度氟處理下佛手根部富集系數(shù)小于1。

2.2 不同氟富集茶樹根系的掃描電鏡差異

由圖1A可知，佛手茶樹根系在50 μm視野下，氟處理前根表皮細胞分布有少量蠟質，根部橫切面顯示，維管束細胞排列較為密集，而氟處理后根表皮細胞有受損現(xiàn)象，細胞凸凹交替，似波浪狀起伏，皺脊模糊，排列無規(guī)則，根表皮細胞表面分布有較多蠟質，蠟質顆粒更為細碎。氟處理前，佛手根系的中柱鞘由多層細胞組成多列，中柱鞘細胞橫切面較為扁平，中柱維管束組織由木質部和韌皮部排列組成，木質部為外始式生長，從中柱鞘向根部中心進行分化，原生木質部靠近中柱鞘，管胞較細且發(fā)育較早，后生木質部靠近中心且不斷增大，氟處理后佛手的木質部導管管徑減小，但差異不大。

由圖1B可知，黃棪茶樹根系在50 μm視野下，氟處理前的根表皮細胞飽滿完整無破裂，分布有少量蠟質，細胞間排列緊密齊勻，氟處理后根表皮細胞表面呈現(xiàn)輕微干裂的狀態(tài)，細胞排列較為疏松，覆蓋的蠟質稍有增多。與氟處理前的根部橫切面形態(tài)相比，氟處理后根系的皮層管狀細胞直徑明顯擴大，中柱與中柱鞘的間距明顯增大，空隙面積隨之增大，呈半月形。

比較發(fā)現(xiàn)，氟處理前佛手根表皮細胞表面覆蓋的蠟質明顯多于黃棪，黃棪根表皮細胞的表面更為平滑，且細胞間排列更整齊緊密（圖1A1和圖1B1），氟處理后佛手根表皮細胞表面覆蓋的蠟質仍顯著多于黃棪，且佛手的細胞排列較為雜亂擁擠，皺脊模糊（圖1A3和圖1B3）。根部橫切面顯示，氟處理前佛手的維管束細胞排列較為密集（圖1A2），而黃棪則較為疏松（圖1B2）；氟處理后，黃棪的中柱細胞間隙較佛手更大，且中柱細胞的管徑更為開闊（圖1B4）。

2.3 WSD1表達分析及其亞細胞定位

本研究基于前期轉錄組數(shù)據(jù)篩選得到的1個根系角質和蠟質生物合成途徑中的關鍵基因WSD1。轉錄組和熒光定量結果顯示，WSD1基因FPKM值趨勢與熒光定量驗證結果趨勢一致（圖2）。亞細胞定位分析結果顯示，其發(fā)光部位位于質膜（圖3），與亞細胞定位預測結果一致。

根部WSD1的表達量如圖4所示，在佛手組中，氟處理后根系WSD1的相對表達量急劇增長，其中50 mg·L-1氟處理1 d的根系（F-50/1）相對表達量最高；在黃棪組中，氟處理后根系WSD1的相對表達量同樣大幅增長，其中50 mg·L-1氟處理16 d的樣品（H-50/16）的相對表達量最高。

2.4 WSD1蛋白互作調控網(wǎng)絡的預測及分析

通過String數(shù)據(jù)庫和PlantTFDB在線網(wǎng)站對WSD1蛋白互作網(wǎng)絡和轉錄因子調控網(wǎng)絡進行預測，結果表明，有9個功能基因和3個轉錄因子可能與WSD1蛋白存在互作關系（圖5和表4）。將蛋白互作預測結果與轉錄組FPKM值進行相關性分析，結果顯示基因CSS0041298（相關系數(shù)為﹣0.58）、CSS0012327（相關系數(shù)為﹣0.59）、CSS0049082（相關系數(shù)為﹣0.54）與WSD1基因呈顯著負相關（圖6）。

3 討論

3.1 不同茶樹品種根系生長及氟富集差異

茶樹具備氟富集的能力，并且不同茶樹品種表現(xiàn)出不同的氟富集能力。根系富集結果表明，茶樹根系對于氟環(huán)境的適應具有選擇性，更適應低濃度的氟環(huán)境，在高濃度的氟環(huán)境下也具備一定程度的富集能力。在不同氟濃度處理下，黃棪根系氟富集系數(shù)均高于佛手，表明其氟富集能力較強，這與氟富集茶樹品種的差異特性相互印證。佛手的氟富集能力較弱，在高氟處理下受脅迫嚴重，處理16 d后其富集系數(shù)lt;1，推測是由于佛手根系吸收的氟在更短的時間內向地上部轉運，故此時根系富集系數(shù)相對較低。研究表明[25]，新鮮蔬菜中氟含量一般較低；在同一條件下生長的紅松、大葉黃楊、柏、桑樹和杉等木本植物含氟量分別為12、8.0、6.0、24、14 mg·kg-1。佛手茶樹品種相較于其他植物仍具有較高的氟富集能力，說明茶樹對氟的富集能力與耐受性之間存在互相獨立、彼此區(qū)別的特點。耐受性可能僅受某個主效基因所調控，而多基因調控氟的超量吸收[26]。

3.2 不同氟富集茶樹品種根系組織細胞形態(tài)差異

根系作為茶樹吸收氟的重要器官，在高濃度氟環(huán)境下會受到一定程度的毒害，不僅會損傷根尖細胞，還會影響細胞壁、線粒體等細胞器。本研究通過SEM技術分析發(fā)現(xiàn)，不同氟富集茶樹品種的根系在經(jīng)過氟處理后其表面結構和亞細胞結構均受到了不同程度的影響。黃棪根部表皮細胞經(jīng)過50 mg·L-1氟處理后僅表現(xiàn)出表面輕微干裂，而佛手的根部表皮細胞則十分敏感，細胞界限模糊，覆蓋蠟質明顯增多，表現(xiàn)出對氟不耐受的癥狀。兩個品種茶樹經(jīng)高氟處理后，根部蠟質范圍均有所擴增，可能是由于高氟環(huán)境迫使茶樹根系啟動響應逆境脅迫的保護機制，合成更多蠟質來保護茶樹根系表皮細胞。與黃棪相比，佛手在氟處理后根系蠟質更多，推測是由于佛手作為氟低富集品種，對于氟富集的飽和程度趨近臨界，因此表現(xiàn)更為不耐受，機體通過合成更多蠟質的方式減輕氟對根系造成的生理脅迫[22，27]。本研究表明，高氟環(huán)境均會不同程度地抑制不同氟富集茶樹根系的正常生長；氟低富集茶樹品種佛手的根系在高氟環(huán)境下受脅迫嚴重；氟高富集茶樹品種黃棪的根系在高氟環(huán)境下雖受到脅迫，但仍耐受。

3.3 調控茶樹合成蠟質相關基因

蠟質作為角質層的一部分，可以抵御環(huán)境壓力，保護植物免受水分流失和紫外線輻射，是植物的一層天然屏障。在花花柴（Karelinia caspia）表皮蠟質的合成途徑中，KcP-450-77A和KcHHT共同參與角質、軟木脂和蠟質的合成[28-29]。擬南芥ERF13負調控KCS16的表達，KCS16編碼一種參與VLCFAs生物合成的脂肪酸延伸酶[30]，過表達KCS16和外源施加VLCFAs可以彌補ERF過表達株系中側根出現(xiàn)的缺陷[31]。轉錄因子MdERF2通過調控蘋果表皮蠟質合成關鍵基因的表達，改變蠟質的形態(tài)和組分含量，參與表皮蠟質合成的調控，推測可能進一步影響果實表皮蠟質的功能[32]。Park等[33]研究表明，AP2/ERF類轉錄因子WRI4可以正向調節(jié)LACS1、KCS1和WSD1的表達。WAX INDUCER（WIN）/SHINE（SHN）是AP2家族的一類重要成員，作為轉錄因子參與調控蠟質合成的同時，其自身的表達也受到其他轉錄因子的負調控[34]。在不同植物中，在蠟質合成途徑中WSD1受到不同基因的調控。本研究通過蛋白互作調控網(wǎng)絡預測，鑒定到細胞色素P450蛋白（CSS0041298）、多藥及毒性化合物排出轉運體蛋白（CSS0012327）和AP2/ERF家族轉錄因子（CSS0049082），并通過相關性分析發(fā)現(xiàn)其與WSD1顯著負相關，因此推測CSS0041298、CSS0012327、CSS0049082可能通過負調控WSD1的表達，影響氟處理下茶樹根部蠟質的合成。蠟質的化學成分與植物-病原體的相互作用有關。因此，經(jīng)氟處理后，WSD1的大量誘導可能預示其在防御氟脅迫方面的重要作用[35]。50 mg·L-1氟處理16 d后的掃描電鏡結果顯示，佛手根系比黃棪更不耐受，其表面蠟質合成量細碎密集，推測是由于酶基因活性的提高促進了茶樹根表面蠟質的形成和積累，增強抵御高濃度、長時間氟脅迫環(huán)境的能力，是茶樹根系應對逆境脅迫的一種自我保護機制[36-38]。

目前，對于外源氟處理下調控茶樹根系蠟質合成相關基因的研究仍較為淺顯，還需要進行深入挖掘，進一步驗證其基因功能。另外，還可以研究代謝途徑，探究不同關鍵基因協(xié)調作用的模式，構建完整的茶樹氟吸收富集模型，并將研究結果充分應用到實踐中，為氟低富集茶樹品種的選育提供技術手段。

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