清上蠲痛湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油的UPLC特征圖譜建立及成分分析Δ

范志穎 ，祝倩倩 ，王協(xié)和 ，翟燕娟 ，王慧敏 ，顧楊欣 ，周海琴 ，陸兔林 ，張科衛(wèi) #，李松 （.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 003；.江陰天江藥業(yè)有限公司，江蘇 江陰 4434）

2018年國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布了第一批《古代經(jīng)典名方目錄》，清上蠲痛湯位列其中。清上蠲痛湯出自明代醫(yī)家龔?fù)①t《壽世保元》（卷六）“頭痛門”的第一方，由酒當(dāng)歸、川芎、白芷、細(xì)辛、羌活、獨(dú)活、防風(fēng)、菊花、蔓荊子、蒼術(shù)、酒黃芩、麥冬、甘草共13味藥材組成，生姜煎服，為治療頭痛的經(jīng)典方劑，具有疏風(fēng)散寒除濕、行氣活血、通絡(luò)止痛的作用。該方含揮發(fā)油類成分的藥材較多，且這些揮發(fā)油類成分具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腦缺血等藥理作用[1]。如方中的酒當(dāng)歸、川芎、白芷、細(xì)辛、羌活等藥材輕清上達(dá)，可疏風(fēng)通絡(luò)、松透伏邪，與該方主治頭痛相符，故對(duì)清上蠲痛湯揮發(fā)油類成分進(jìn)行探索和研究具有重要意義。

目前，關(guān)于清上蠲痛湯的研究多集中于臨床應(yīng)用以及該方水煎液中水溶性成分的指紋圖譜、特征圖譜、煎煮工藝與質(zhì)量控制等方面[2]。雖然有學(xué)者對(duì)該方中揮發(fā)油類成分進(jìn)行了相關(guān)研究，但仍側(cè)重于方中的水溶性成分，對(duì)揮發(fā)油類成分的研究尚不夠全面。鑒于此，本研究擬建立清上蠲痛湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油的超高效液相色譜（UPLC）特征圖譜，并利用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF/MS）法和氣質(zhì)聯(lián)用（GCMS）法分析和鑒定該方中的揮發(fā)油類成分，旨在為該方基準(zhǔn)樣品標(biāo)準(zhǔn)的制定、后續(xù)制劑工藝的研究及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供借鑒。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器包括Agilent 1290型UPLC儀、Agilent 6530型串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、8890A-7000D型GC-MS儀（美國Agilent公司），JJ500型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠），ME204型萬分之一電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]，POMEX型揮發(fā)油提取器（北京北玻博美玻璃有限公司），Milli-Q?IQ7005型純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

甲基丁香酚對(duì)照品（批號(hào)111642-200301，純度＞98.0%）購自中國食品藥品檢定研究院；洋川芎內(nèi)酯A對(duì)照品（批號(hào)ST10580120，純度＞98.0%）、藁本內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)RS04251081，純度＞98.0%）均購自上海詩丹德生物技術(shù)有限公司；甲醇、乙腈、甲酸、磷酸、冰醋酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

清上蠲痛湯所用藥材均購自道地產(chǎn)區(qū)或主產(chǎn)區(qū)。藥材基原、藥用部位、產(chǎn)地及采收加工均明確，藥材經(jīng)江陰天江藥業(yè)有限公司藥材鑒定高級(jí)工程師唐波鑒定均為真品。采用隨機(jī)數(shù)字表法將15批清上蠲痛湯組方飲片進(jìn)行組合，15批飲片批次產(chǎn)地信息見表1。

表1 15批清上蠲痛湯樣品組方飲片的批次產(chǎn)地信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Waters CORTECS C18（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）色譜柱，以乙腈（A）-水（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～2 min，25%A→34%A；2～13 min，34%A；13～15 min，34%A→35%A；15～27 min，35%A；27～28 min，35%A→25%A；28～32 min，25%A）；柱溫為30 ℃；檢測波長為235 nm；流速為0.3 mL/min；進(jìn)樣量為0.5 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)湯劑

本研究根據(jù)清上蠲痛湯最佳煎煮工藝[2]，放大6倍進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備：取酒當(dāng)歸22.38 g、川芎22.38 g、白芷22.38 g、細(xì)辛6.72 g、羌活22.38 g、獨(dú)活22.38 g、防風(fēng)22.38 g、菊花11.22 g、蔓荊子11.22 g、麩炒蒼術(shù)22.38 g、酒黃芩33.60 g、麥冬22.38 g、甘草6.72 g，粉碎（過4目篩網(wǎng)），加水2 438 mL，浸泡30 min，煮沸后再煎煮20 min，200目篩趁熱濾過；藥渣加水1 896 mL，煮沸后再煎煮15 min，200目篩趁熱濾過；合并2次濾液，即得。

2.2.2 供試品溶液

（1）全方供試品溶液。將“2.2.1”項(xiàng)下制備的清上蠲痛湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑趁熱轉(zhuǎn)移至5 000 mL圓底燒瓶中，加入玻璃珠數(shù)粒，連接揮發(fā)油提取裝置，自收集器上端加水使其充滿揮發(fā)油測定器的刻度部分，并溢流入燒瓶中，電熱套加熱并保持微沸狀態(tài)，回流4 h后冷卻；由提取器上端加入乙酸乙酯1 mL，收集乙酸乙酯層至2 mL量瓶中，用乙酸乙酯洗滌冷凝管及揮發(fā)油提取器內(nèi)壁，洗液并入同一量瓶中，加乙酸乙酯至刻度，搖勻，即得清上蠲痛標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油。從已收集的揮發(fā)油中精密吸取100 μL，置于2 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得全方供試品溶液（即標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油）。

（2）單味藥供試品溶液。分別按“2.2.1”項(xiàng)下稱樣量及方法制備單味藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑，再按“2.2.2（1）”項(xiàng)下方法制備單味藥供試品溶液。

（3）陰性制劑供試品溶液。分別按“2.2.1”項(xiàng)下稱樣量及方法制備各單味藥的缺味陰性標(biāo)準(zhǔn)湯劑，再按“2.2.2（1）”項(xiàng)下方法制備成各缺味陰性制劑供試品溶液。

2.3 清上蠲痛湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油UPLC特征圖譜的建立及分析

2.3.1 方法學(xué)考察

（1）精密度試驗(yàn)。取清上蠲痛湯（編號(hào)S1）飲片，先按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑，再按“2.2.2（1）”項(xiàng)下方法制備全方供試品溶液，最后按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。以穩(wěn)定性、分離度好的8號(hào)峰作為參照峰（S），計(jì)算得到各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均＜0.05%、相對(duì)峰面積的RSD均＜0.02%（n＝6），表明方法精密度良好。

（2）重復(fù)性試驗(yàn)。取清上蠲痛湯（編號(hào)S1）飲片，先按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑，再按“2.2.2（1）”項(xiàng)下方法平行制備6份全方供試品溶液，最后按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。以8號(hào)峰為參照峰（S），計(jì)算得到各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均＜0.03%、相對(duì)峰面積的RSD均＜0.95%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

（3）穩(wěn)定性試驗(yàn)。取清上蠲痛湯（編號(hào)S1）飲片，先按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑，再按“2.2.2（1）”項(xiàng)下方法制備全方供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。以8號(hào)峰為參照峰（S），計(jì)算得到各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均＜0.17%、相對(duì)峰面積的RSD均＜2.95%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.2 UPLC特征圖譜建立及相似度評(píng)價(jià)

取15批清上蠲痛湯（編號(hào)S1～S15）飲片，先按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑，再按“2.2.2（1）”項(xiàng)下方法制備全方供試品溶液，最后按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。將色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》，以S2樣品的特征圖譜作為參照圖譜，設(shè)置時(shí)間窗寬度為0.1 min，采用中位數(shù)法，進(jìn)行多點(diǎn)校正和Mark峰匹配，得到15批樣品的特征圖譜及對(duì)照特征圖譜（R）；以對(duì)照特征圖譜（R）為參照，計(jì)算15批清上蠲痛湯樣品的相似度。結(jié)果顯示，共得到12個(gè)共有峰；15批樣品的相似度在0.949～0.997之間，相似度較高。結(jié)果見圖1。

圖1 15批清上蠲痛湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油的UPLC疊加特征圖譜

2.3.3 共有峰的歸屬

取清上蠲痛湯（編號(hào)S2）飲片，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑，再按“2.2.2（1）”項(xiàng)下方法制備全方供試品溶液；取酒當(dāng)歸、川芎、白芷、細(xì)辛、羌活、獨(dú)活、防風(fēng)、菊花、蔓荊子、麩炒蒼術(shù)、生姜11味含揮發(fā)油類成分的飲片，按“2.2.2（2）”項(xiàng)下方法制備各單味藥供試品溶液，并按“2.2.2（3）”項(xiàng)下方法制備缺味的各陰性制劑供試品溶液。取上述3種溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。通過比對(duì)3種溶液的色譜圖發(fā)現(xiàn)，清上蠲痛湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油類成分的12個(gè)共有峰主要來源于當(dāng)歸、川芎、羌活、細(xì)辛4味飲片。其中，1、4號(hào)峰來源于羌活，2、3、5、7、8號(hào)峰來源于細(xì)辛，1、4、10、11、12號(hào)峰來源于當(dāng)歸，1、9、10、11、12號(hào)峰來源于川芎、羌活、細(xì)辛、當(dāng)歸，詳見圖2；而白芷、獨(dú)活、防風(fēng)、菊花、蔓荊子、蒼術(shù)、生姜在本色譜條件下未有相應(yīng)色譜峰歸屬信息。

2.4 UPLC特征圖譜中共有峰的UPLC-Q-TOF/MS鑒定

2.4.1 檢測條件

色譜條件同“2.1”項(xiàng)。質(zhì)譜檢測條件如下：離子源為電噴霧離子源（ESI）；干燥氣溫度為300 ℃；流量為8 mL/min；霧化器壓力為35 psi；正離子模式下毛細(xì)管電壓為4 000 V，毛細(xì)管出口電壓為175 V，錐孔電壓為65 V；采用高分辨模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，質(zhì)荷比（m/z）為100～2 000；霧化壓力為5 psi。

2.4.2 共有峰鑒定

取“2.2.1（1）”項(xiàng)下全方供試品溶液（編號(hào)S2），采用UPLC-Q-TOF/MS法，按“2.4.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣檢測，根據(jù)質(zhì)譜檢測數(shù)據(jù)結(jié)合參考文獻(xiàn)和化學(xué)數(shù)據(jù)庫對(duì)清上蠲痛湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油類成分共有峰進(jìn)行快速鑒定。結(jié)果見表2。

表2 清上蠲痛湯標(biāo)準(zhǔn)湯中揮發(fā)油類成分共有峰UPLCQ-TOF/MS鑒定結(jié)果

2.5 GC-MS法分析清上蠲痛湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油類成分

2.5.1 供試品溶液制備

取清上蠲痛湯（編號(hào)S2）飲片，按“2.2.2（1）”項(xiàng)下方法制備清上蠲痛湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油。精密吸取揮發(fā)油100 μL，置于2 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容，加適量無水硫酸鈉脫水，即得。

2.5.2 檢測條件

色譜柱為HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣量為1 μL；分流比為10∶1；進(jìn)樣口溫度為240 ℃；升溫程序?yàn)槠鹗紲囟?0 ℃、保持1 min，以5 ℃/min升溫至150 ℃、保持1 min，再以5 ℃/min升溫至160 ℃、保持2 min，接著以2 ℃/min升溫至180 ℃、保持1 min，最后以12 ℃/min升溫至230 ℃、保持4 min；載氣為氦氣；進(jìn)樣口溫度為240 ℃；離子源為電子轟擊離子源（EI）；電子能量為70 eV；接口溫度為230 ℃；掃描范圍為50～550 amu。

2.5.3 清上蠲痛湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油類成分的分析

取“2.5.1”項(xiàng)下供試品溶液，采用GC-MS法，按“2.5.2”項(xiàng)下條件進(jìn)行分析，通過Agilent MassHunter Qualitative Analysis 10.0化學(xué)工作站NIST17.L譜庫檢索，從清上蠲痛湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油中共鑒定出23個(gè)成分，占總含量的82.66%。通過Agilent MassHunter Qualitative Analysis 10.0化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，按峰面積歸一化法計(jì)算這23個(gè)成分的相對(duì)百分含量。結(jié)果顯示，主要化學(xué)成分有3，4，5-三甲氧基甲苯、百秋李醇、Z-藁本內(nèi)酯，分別占揮發(fā)油總量的9.19%、19.10%、21.10%。結(jié)果見表3。

表3 清上蠲痛湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油類成分的GC-MS鑒定結(jié)果

3 討論

3.1 處方量的選擇及標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油的提取

清上蠲痛湯原處方單味藥量較少，揮發(fā)油難以提取，因此本研究將最佳煎煮工藝放大6倍，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備與揮發(fā)油收集。由于揮發(fā)油研究是針對(duì)清上蠲痛湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑展開的，因此在制備全方供試品溶液時(shí)先制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑，繼而趁熱提取水煎液中的揮發(fā)油。

3.2 定性分析方法的選擇

本研究采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》確定UPLC特征圖譜的共有峰，再通過UPLC-Q-TOF/MS法進(jìn)行共有峰指認(rèn)。由于在正離子模式條件下清上蠲痛湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑中揮發(fā)油類成分的出峰數(shù)量較多、峰形好、基線較穩(wěn)定、分離度好，因此最終選擇在正離子模式下檢測。筆者前期通過與對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)出UPLC特征圖譜12個(gè)共有峰中的8號(hào)峰為甲基丁香酚、9號(hào)峰為洋川芎內(nèi)酯A、11號(hào)峰為藁本內(nèi)酯。為了更加全面地表征清上蠲痛湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油類成分，本研究采用UPLC法建立清上蠲痛湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油特征圖譜，輔以GC-MS法對(duì)清上蠲痛湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油類成分進(jìn)行定性分析。

3.3 色譜及樣品制備條件優(yōu)化

3.3.1 UPLC色譜條件優(yōu)化

本研究前期通過比較不同波長（235、245、255 nm）發(fā)現(xiàn)，檢測波長為235 nm時(shí)各化合物的響應(yīng)值最大，色譜峰分離較好。此外，本研究還比較了甲醇-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.1%冰醋酸溶液、乙腈-水6種不同流動(dòng)相體系對(duì)色譜峰分離效果的影響，最終根據(jù)出峰數(shù)量及響應(yīng)值情況等，選擇乙腈-水為本研究的流動(dòng)相。

3.3.2 GC色譜條件優(yōu)化及稀釋溶劑選擇

由于清上蠲痛湯中揮發(fā)油類成分比較復(fù)雜，因此本研究選擇程序升溫，以提高各揮發(fā)油類成分的分離度和分辨率。本研究前期比較了不同稀釋溶劑（乙酸乙酯、正己烷、甲醇）的分離效果，最終選擇了響應(yīng)值最大、分離度最好的甲醇作為稀釋溶劑。此外，本研究還考察了HP-5 MS、DB WAX、DB1701這3種毛細(xì)管色譜柱的分離效果，最終選擇HP-5 MS毛細(xì)管色譜柱。

3.4 活性成分分析

本研究建立了UPLC特征圖譜，并采用UPLC-QTOF/MS法對(duì)15批清上蠲痛湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油的12個(gè)共有峰進(jìn)行了鑒定。由圖1可知，其主要化學(xué)成分有甲基丁香酚（8號(hào)峰）、E-藁本內(nèi)酯（11號(hào)峰）、E-正丁烯基苯酞（12號(hào)峰）。其中甲基丁香酚具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌的作用[11]；E-藁本內(nèi)酯具有抗炎、保護(hù)腦血管的作用[12]；E-正丁烯基苯酞作為苯酞類成分，具有神經(jīng)保護(hù)作用[13]。在清上蠲痛湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油類成分的GC-MS檢測中，發(fā)現(xiàn)其主要化學(xué)成分有3，4，5-三甲氧基甲苯、百秋李醇、Z-藁本內(nèi)酯。其中，3，4，5-三甲氧基甲苯具有抗炎、鎮(zhèn)痛的藥理作用[14]，百秋李醇具有抗炎、抗菌、鎮(zhèn)靜、抗動(dòng)脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)免疫功能的生物活性[15]，Z-藁本內(nèi)酯具有抗腦缺血、保護(hù)神經(jīng)的作用[16]。

綜上所述，本研究選擇道地產(chǎn)區(qū)或主產(chǎn)區(qū)的代表性樣品隨機(jī)組方進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油的研究，建立的UPLCQ-TOF/MS、GC-MS及UPLC特征圖譜定性分析方法較為全面地表征了清上蠲痛湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油中的化學(xué)成分。通過分析可初步推測，甲基丁香酚、藁本內(nèi)酯、E-正丁烯基苯酞、百秋李醇、3，4，5-三甲氧基甲苯可能是影響清上蠲痛湯揮發(fā)油臨床治療效果的主要活性成分。

（利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突）