甲巰咪唑?qū)谞钕俟δ芸哼M(jìn)癥大鼠尿液代謝組學(xué)的影響研究Δ

盧旭 ，李玲 ，葉濤 ，彭佑鋒 ，何佳馨 ，張寧 #（.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴陽 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，貴陽 55000；.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院康復(fù)科，貴陽 55000；.貴州省大方縣中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，貴陽 55699）

甲狀腺功能亢進(jìn)癥（簡稱“甲亢”）是由多種病因?qū)е碌募谞钕俟δ茉鰪?qiáng)、甲狀腺激素分泌過多，以甲狀腺腫大、多食易饑、體重減輕以及三碘甲腺原氨酸（triiodothyronine，T3）、四碘甲腺原氨酸（tetraiodothyronine，T4）分泌過多癥候群（包括高代謝癥候群及心血管、消化、骨骼肌肉系統(tǒng)癥狀）為主要臨床表現(xiàn)，可見脛前黏液水腫、指端粗厚等癥狀[1]。甲亢是全球內(nèi)分泌與代謝病領(lǐng)域較常見的疾病之一，僅次于糖尿病，在我國的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，給患者家庭和社會帶來沉重負(fù)擔(dān)[2]。

現(xiàn)代臨床治療甲亢主要以服用抗甲狀腺藥物和手術(shù)切除甲狀腺為主[3]。甲巰咪唑是我國臨床治療甲亢的一線藥物，可通過抑制T4合成的關(guān)鍵酶，即甲狀腺過氧化物酶（thyroid peroxidase，TPO），從而減少T4的生成，進(jìn)而有效減輕患者癥狀并恢復(fù)其甲狀腺功能[4]，但甲巰咪唑治療甲亢的分子機(jī)制尚不明確。

代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)研究的重要方法，可鑒別生物體在特定刺激或某種因素影響下產(chǎn)生的潛在代謝物，并有助于確定代謝物及相關(guān)代謝通路的變化情況[5]。尿液可快速反映機(jī)體狀態(tài)，同時對機(jī)體的正常生理活動至關(guān)重要，加之其檢測簡單、無創(chuàng)，故已成為臨床常規(guī)的生物樣本，被廣泛用于非靶向代謝組學(xué)研究?；诖耍狙芯炕诔咝б合嗌V-飛行時間質(zhì)譜（UPLC-TOFMS）技術(shù)，對甲巰咪唑干預(yù)后的甲亢大鼠進(jìn)行尿液代謝組學(xué)分析，旨在從尿液角度揭示甲巰咪唑治療甲亢的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有AcquityTMUPLC儀、Premier LCT XE型TOF-MS儀（美國Waters公司），KDC-160HR型高速冷凍離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司），Milli-Q型超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司），BT-3000型電子天平（啟東友洺衡器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

左甲狀腺素鈉片（批號H20140052，規(guī)格50 μg/片），甲巰咪唑片（批號010011428，規(guī)格10 mg/片）均購自德國Merck公司；T3檢測試劑盒（批號190815）、T4檢測試劑盒（批號190706）、促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）檢測試劑盒（批號190302）、游離三碘甲腺原氨酸（free triiodothyronine，F(xiàn)T3）檢測試劑盒（批號190518）、游離四碘甲腺原氨酸（free tetraiodothyronine，F(xiàn)T4）檢測試劑盒（批號190621）均購自南京建成生物工程研究所有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

本研究所用動物為SPF級雄性SD大鼠，共30只，體重160～180 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（湘）2019-0004。大鼠自由攝食飲水，飼養(yǎng)于溫度（22±1） ℃、相對濕度50%、每12 h光照/黑暗交替的環(huán)境下。本研究方案經(jīng)江西中洪博元生物技術(shù)有限公司實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)后實(shí)施（批準(zhǔn)號為2021062701）。

2 方法

2.1 甲巰咪唑改善甲亢的藥效學(xué)考察

2.1.1 動物分組、造模與給藥

將30只SD大鼠置于代謝籠中適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，按體重均衡原則分為對照組、模型組和甲巰咪唑組，每組10只。模型組和甲巰咪唑組大鼠每天按160 mg/kg（劑量為臨床等效劑量）灌胃左甲狀腺素鈉片混懸液，90 min后甲巰咪唑組大鼠按3.6 mg/kg（劑量為臨床等效劑量）灌胃甲巰咪唑片混懸液，對照組大鼠灌胃等體積的生理鹽水，每天1次，連續(xù)15 d。

2.1.2 大鼠基本情況變化考察

每天觀察大鼠的精神狀態(tài)、毛發(fā)色澤、飲食量、大便性狀和死亡等情況，并記錄其肛溫、體重變化。

2.1.3 大鼠血清生化指標(biāo)檢測

末次給藥24 h后，各組大鼠腹主動脈取血，離心（3 500 r/min，15 min）得血清，嚴(yán)格按照相關(guān)試劑盒說明書操作，檢測各組大鼠血清中T3、T4、TSH、FT3、FT4水平。

2.2 大鼠尿液樣品的代謝組學(xué)分析

2.2.1 尿液樣本處理

于給藥第15天收集各組大鼠24 h尿液，用于代謝組學(xué)分析。尿液樣本于4 ℃下離心（12 000 r/min，10 min），取上清液至－80 ℃條件下儲存。檢測前，將凍融的尿液于4 ℃下離心（13 000 r/min，10 min），將上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，然后用0.22 μm微孔濾膜過濾，取濾液進(jìn)行UPLC-TOF-MS檢測。

2.2.2 色譜與質(zhì)譜條件

以ACQUITY UPLC?BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）為色譜柱，以乙腈（A）-0.05%甲酸溶液（B）為流動相進(jìn)行梯度洗脫（0～15 min，2%A→100%A；15～17 min，100%A；17～18 min，100%A→2%A；18～20 min，2%A）；流速為0.4 mL/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為2 μL。

采用電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）進(jìn)行正、負(fù)離子模式檢測，并采用LockSprayTM校正系統(tǒng)進(jìn)行在線質(zhì)量校正。脫溶劑氣溫度和離子源溫度分別為350.0、110.0 ℃；脫溶劑氣流量為750.0 L/h；毛細(xì)管電壓分別為1 300.0 V（ESI+）和1 500.0 V（ESI－）；錐孔電壓分別為60.0 V（ESI+）和70.0 V（ESI－）；離子能量電壓分別為35.0 V（ESI+）和34.0 V（ESI－）。

2.2.3 數(shù)據(jù)分析

將UPLC-TOF-MS分析所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Progenesis QI軟件，并在每個分析步驟中可視化原始數(shù)據(jù)。采用主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，然后以差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）≥2、P≤0.05和變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值＞1為條件，篩選潛在差異代謝物[6]，并采用MetaboAnalyst 5.0軟件繪制熱圖將數(shù)據(jù)可視化，然后結(jié)合人類代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫（HMDB，http：//www.hmdb.ca/）、京都基因和基因組百科全書（KEGG，https：//www.kegg.jp/）等對差異代謝物及其相關(guān)代謝通路進(jìn)行分析。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行分析處理。數(shù)據(jù)用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 大鼠基本情況變化

造模7 d后，模型組大鼠出現(xiàn)毛色黃暗而不順、脾氣暴躁、便多等癥狀；與對照組相比，該組大鼠體重顯著降低、肛溫顯著升高（P＜0.01），表明造模成功。甲巰咪唑片干預(yù)15 d后，與模型組相比，甲巰咪唑組大鼠毛色柔順、便量減少，脾氣暴躁等癥狀也有所緩解，體重顯著升高、肛溫顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠體溫和體重變化（±s，n＝10）

表1 各組大鼠體溫和體重變化（±s，n＝10）

a：與對照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01。

組別對照組模型組甲巰咪唑組體重/g 191.48±8.86 157.51±7.59a 176.03±7.24b肛溫/℃35.57±0.45 38.46±0.41a 37.23±0.43b

3.1.2 大鼠血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果

與對照組相比，模型組大鼠血清中T3、T4、FT3、FT4水平均顯著升高，TSH水平顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，甲巰咪唑組大鼠血清中T3、T4、FT3、FT4水平均顯著降低，TSH水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠T3、T4、FT3、FT4和TSH的檢測結(jié)果（±s，n＝10）

表2 各組大鼠T3、T4、FT3、FT4和TSH的檢測結(jié)果（±s，n＝10）

a：與對照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.01。

組別對照組模型組甲巰咪唑組T3/（ng/mL）0.62±0.08 0.78±0.09a 0.70±0.08b T4/（ng/mL）8.04±1.16 11.29±1.67a 8.95±1.23c FT3/（ng/mL）1.82±0.16 5.91±0.98a 4.32±0.84c FT4/（ng/mL）18.11±1.51 52.29±8.44a 35.24±6.97c TSH/（mIU/L）1.25±0.13 0.76±0.11a 0.92±0.12b

3.2 尿液代謝組學(xué)分析結(jié)果

3.2.1 PCA、OPLS-DA結(jié)果

PCA結(jié)果顯示，對照組、模型組和甲巰咪唑組大鼠的PCA散點(diǎn)均能分開，且組內(nèi)樣品均能較好地聚集，說明各組間代謝物有明顯差異。進(jìn)一步OPLS-DA發(fā)現(xiàn)，甲巰咪唑組有向?qū)φ战M回調(diào)的趨勢，表明甲巰咪唑可改善甲亢大鼠機(jī)體異常代謝情況。結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 正負(fù)離子模式下各組大鼠尿液的PCA圖

圖2 正負(fù)離子模式下各組大鼠尿液的OPLS-DA圖

3.2.2 差異代謝物的篩選

由圖3可知，與對照組相比，模型組大鼠尿液中有22個代謝物表達(dá)顯著下調(diào)，44個代謝物表達(dá)顯著上調(diào)，196個代謝物表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與模型組相比，甲巰咪唑組大鼠尿液中有3個代謝物表達(dá)顯著下調(diào)，23個代謝物表達(dá)顯著上調(diào)，30個代謝物表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，上述3組樣品取交集后，共有5個差異代謝物（見表3）。與對照組相比，模型組大鼠尿液中2-氧代-4-甲硫基丁酸和脫氧胞苷顯著下調(diào)，癸二酸、利膽酸3-O-葡萄糖醛酸和N6，N6，N6-三甲基-L-賴氨酸表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）；與模型組相比，甲巰咪唑組大鼠尿液中癸二酸、利膽酸3-O-葡萄糖醛酸和N6，N6，N6-三甲基-L-賴氨酸表達(dá)均顯著下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），2-氧代-4-甲硫基丁酸、脫氧胞苷表達(dá)均顯著上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），結(jié)果見圖4、表4。

圖3 各組大鼠尿液中代謝物的火山圖

圖4 各組大鼠尿液中5個共有差異代謝物的相對強(qiáng)度分析熱圖

表3 5個共有差異代謝物的具體信息

表4 各組大鼠尿液中5個差異代謝物的表達(dá)情況（±s，n＝10）

表4 各組大鼠尿液中5個差異代謝物的表達(dá)情況（±s，n＝10）

a：與對照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.01。

組別對照組模型組甲巰咪唑組癸二酸15 342.49±3 022.08 24 437.23±684.66a 17 865.03±469.05b利膽酸3-O-葡萄糖醛酸304.60±72.33 2 413.57±790.80a 1 043.51±243.49c 2-氧代-4-甲硫基丁酸574.53±162.31 46.58±7.79a 475.10±81.48c N6，N6，N6-三甲基-L-賴氨酸666.53±115.94 1 324.61±330.27a 765.92±118.74c脫氧胞苷2 268.30±620.32 1 369.56±320.25a 1 601.84±107.14b

3.2.3 代謝通路的富集分析

5個共有差異代謝物結(jié)合HMDB、KEGG數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，甲巰咪唑改善甲亢大鼠代謝紊亂主要涉及戊糖和葡萄糖醛酸相互作用、賴氨酸降解、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝以及嘧啶代謝這4條代謝通路。結(jié)果見表5。

表5 差異代謝物涉及的代謝通路

4 討論

4.1 甲巰咪唑改善甲亢的藥效學(xué)變化

左甲狀腺素鈉片為化學(xué)合成的T4精制劑，其吸收穩(wěn)定、作用時間長，在體內(nèi)轉(zhuǎn)變成T3而活性增強(qiáng)，具有促進(jìn)代謝、增加產(chǎn)熱和增強(qiáng)交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)感受性等作用，可很好地模擬甲亢的臨床表現(xiàn)[7―8]。因此，本研究采用左甲狀腺素鈉片建立甲亢模型。本研究結(jié)果顯示，灌服左甲狀腺素鈉片后，模型大鼠出現(xiàn)了典型的甲亢表現(xiàn)，且血清中T3、T4、FT3、FT4水平和肛溫均顯著升高，TSH水平和體重均顯著降低，與甲亢的生化指標(biāo)變化一致。經(jīng)甲巰咪唑干預(yù)后，模型大鼠血清中上述指標(biāo)均顯著逆轉(zhuǎn)，甲亢癥狀明顯改善。

4.2 甲巰咪唑改善甲亢的代謝通路分析

本研究通過UPLC-TOF-MS技術(shù)對甲巰咪唑干預(yù)后的甲亢大鼠進(jìn)行尿液代謝組學(xué)分析，結(jié)果顯示，甲巰咪唑?qū)ψ蠹谞钕偎剽c片引起的脫氧胞苷和2-氧代-4-甲硫基丁酸下調(diào)，癸二酸、利膽酸3-O-葡萄糖醛酸和N6，N6，N6-三甲基-L-賴氨酸上調(diào)，均具有顯著的逆轉(zhuǎn)作用，主要代謝通路涉及戊糖和葡萄糖醛酸相互作用、賴氨酸降解、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝以及嘧啶代謝。

4.2.1 作用于戊糖和葡萄糖醛酸代謝通路

戊糖和葡萄糖醛酸代謝通路用是糖代謝通路中的一部分，其可參與碳水化合物的代謝和能量產(chǎn)生[9]。研究表明，甲亢患者戊糖和葡萄糖醛酸代謝通路發(fā)生了變化，表現(xiàn)為戊糖和葡萄糖醛酸之間的轉(zhuǎn)化速率增加、戊糖的消耗增加、葡萄糖醛酸的產(chǎn)生增加[10―11]。利膽酸3-O-葡萄糖醛酸是由膽汁酸和葡萄糖醛酸結(jié)合形成的化合物，可參與戊糖和葡萄糖醛酸之間的相互轉(zhuǎn)化[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)甲巰咪唑干預(yù)后，甲亢大鼠尿液中利膽酸3-O-葡萄糖醛酸水平下調(diào)。由此推測，甲巰咪唑可能通過下調(diào)利膽酸3-O-葡萄糖醛酸水平，抑制戊糖和葡萄糖醛酸之間的相互轉(zhuǎn)化，從而間接抑制甲亢大鼠糖代謝，進(jìn)而改善甲亢。

4.2.2 作用于賴氨酸降解通路

賴氨酸是一種人體必需的氨基酸，對蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞功能至關(guān)重要，其降解后可以產(chǎn)生能量和其他代謝產(chǎn)物，然后在甲狀腺激素合成過程中被利用[13―14]。研究表明，甲亢患者可能會出現(xiàn)賴氨酸降解增加的情況，從而導(dǎo)致賴氨酸穩(wěn)態(tài)失衡[15]。N6，N6，N6-三甲基-L-賴氨酸是賴氨酸的一種修飾形式，可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能和細(xì)胞代謝，從而影響賴氨酸降解的速率[16]。在甲亢患者中，甲狀腺激素的過度分泌可能會上調(diào)N6，N6，N6-三甲基-L-賴氨酸表達(dá)，進(jìn)而影響賴氨酸的降解過程[17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)甲巰咪唑干預(yù)后，甲亢大鼠尿液中N6，N6，N6-三甲基-L-賴氨酸下調(diào)。由此推測，甲巰咪唑可能通過下調(diào)N6，N6，N6-三甲基-L-賴氨酸表達(dá)，抑制賴氨酸降解，從而減少甲狀腺激素的合成和釋放，進(jìn)而改善甲亢。

4.2.3 作用于半胱氨酸和甲硫氨酸代謝通路

半胱氨酸和甲硫氨酸代謝是維持細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸和甲硫氨酸水平的重要途徑，甲亢患者過度分泌甲狀腺激素也會影響半胱氨酸和甲硫氨酸的代謝[18]。2-氧代-4-甲硫基丁酸是半胱氨酸和甲硫氨酸代謝通路中的中間產(chǎn)物，其可作為甲硫氨酸的前體，參與甲硫氨酸的合成[19]。甲巰咪唑作為抗甲亢藥物，主要通過抑制TPO來阻礙甲狀腺激素T4和T3的合成，半胱氨酸在甲狀腺激素合成過程中參與碘化反應(yīng)，甲硫氨酸在甲狀腺激素合成過程中參與甲基化反應(yīng)[20—21]，這提示甲巰咪唑可能會通過抑制半胱氨酸的碘化和甲硫氨酸的甲基化反應(yīng)，影響甲狀腺激素的合成。本研究也發(fā)現(xiàn)，甲巰咪唑可顯著上調(diào)甲亢大鼠2-氧代-4-甲硫基丁酸的水平，故推測甲巰咪唑可通過抑制TPO來阻礙甲狀腺激素的合成，改善甲亢大鼠半胱氨酸和甲硫氨酸代謝，促進(jìn)甲硫氨酸的合成。這種上下游的銜接使得甲巰咪唑能夠有效地改善機(jī)體蛋白質(zhì)合成和其他相關(guān)生物過程，進(jìn)而防治甲亢。

4.2.4 作用于嘧啶代謝通路

嘧啶核苷酸是構(gòu)成DNA和RNA的重要組成部分，因此嘧啶代謝對于維持細(xì)胞功能、傳遞遺傳信息至關(guān)重要[22]。甲狀腺激素可通過促進(jìn)嘧啶核苷酸的合成和降解，從而影響嘧啶代謝的平衡[23]。脫氧胞苷是一種嘧啶核苷酸，可通過酶的催化作用轉(zhuǎn)化為脫氧胞苷酸，進(jìn)而參與DNA的合成和修復(fù)過程[24]。研究發(fā)現(xiàn)，甲亢患者脫氧胞苷水平下調(diào)，這可能是由于甲狀腺激素過度分泌導(dǎo)致嘧啶代謝紊亂，進(jìn)而影響脫氧胞苷的合成和降解[25]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)甲巰咪唑干預(yù)后，甲亢大鼠尿液中脫氧胞苷水平上調(diào)。由此推測，甲巰咪唑可能通過上調(diào)脫氧胞苷表達(dá)，調(diào)節(jié)甲亢大鼠嘧啶代謝紊亂，進(jìn)而改善甲亢。

綜上所述，甲巰咪唑可能是通過調(diào)節(jié)戊糖和葡萄糖醛酸相互作用、賴氨酸降解、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝以及嘧啶代謝，從而發(fā)揮改善甲亢的作用。