基于NIRS技術(shù)的款冬花藥材質(zhì)控指標(biāo)定量分析模型的建立Δ

耿濤，蔣文慧，劉佳倫，蘭松平，王柳瓔，陳佩林，嚴(yán)寒靜，姬生國(guó) （廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 510006）

款冬花（Farfarae Flos）為菊科植物款冬Tussilago farfaraL.的干燥花蕾，主要分布在我國(guó)華北、西北、西南地區(qū)，主產(chǎn)于甘肅、陜西、河北、山西等地。本品始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，有潤(rùn)肺下氣、止咳化痰之功效，臨床多用于治療新久咳嗽、喘咳痰多等證[1]，是通宣理肺丸、百花定喘丸等中成藥的重要原料藥[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，款冬花及其提取物具有抗炎、抗腫瘤、抗結(jié)核、呼吸興奮及神經(jīng)保護(hù)等藥理活性[3―4]?？疃强疃ǖ闹饕钚猿煞种?，也是其質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定款冬花中款冬酮的含量不得少于0.070%，醇溶性浸出物含量不得少于20.0%，但對(duì)其水分及總灰分的含量沒(méi)有明確規(guī)定[1]?！断愀壑兴幉臉?biāo)準(zhǔn)》（第五期）對(duì)款冬花的水分和總灰分含量有明確規(guī)定，要求其水分不得超過(guò)11%，總灰分不得超過(guò)11%[5]。

以往的研究在對(duì)款冬花進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)時(shí)，通常采用的是以高效液相色譜法測(cè)定款冬酮的含量，以烘干法、熱浸法等方法測(cè)定藥材中水分、浸出物及總灰分的含量，但上述方法在實(shí)際操作時(shí)通常具有程序繁瑣、消耗大量有機(jī)試劑、耗時(shí)耗力等缺陷。近紅外光譜（nearinfrared spectroscopy，NIRS）法作為一種綠色環(huán)保、便捷、高效的分析方法，可以改善上述試驗(yàn)操作中的弊端，目前已廣泛應(yīng)用于中藥材或中藥制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)中[6―7]。本課題組十余年來(lái)一直從事NIRS應(yīng)用于中藥材及中藥制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究工作，已經(jīng)對(duì)高良姜[8]、夏枯草[9]、何首烏[10]、陽(yáng)春砂[11]、益智[12]、穿心蓮[13]、辛夷[14]等藥材進(jìn)行了相關(guān)研究。本研究采用NIRS技術(shù)結(jié)合偏最小二乘（partial least squares，PLS）法建立了款冬花藥材質(zhì)控指標(biāo)定量分析模型，旨在為該藥材及其制劑的快速質(zhì)量檢測(cè)提供可靠的技術(shù)和方法。

1 材料

1.1 主要儀器

TANGO型傅里葉變換NIRS儀購(gòu)自布魯克（北京）科技有限公司；1120型高效液相色譜儀、AY120型十萬(wàn)分之一天平購(gòu)自日本島津公司；TQ-Analyst光譜分析軟件購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；DELTA-D150型數(shù)顯超聲清洗機(jī)購(gòu)自上海旦鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司；Q/ZT153-1998型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥器購(gòu)自浙江正泰儀器儀表有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋購(gòu)自上海力辰邦西儀器科技有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

款冬酮對(duì)照品（批號(hào)MUST-21101304，純度≥98.89%）購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司；甲醇為色譜純，水為蒸餾水，其余試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用藥材于2021年12月至2022年3月分別收集于陜西、甘肅、河北等種植基地，經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院姬生國(guó)教授鑒定為菊科植物款冬T.farfaraL.的干燥花蕾。樣品來(lái)源信息見(jiàn)表1。藥材經(jīng)低溫干燥后粉碎，過(guò)四號(hào)篩，置于自封袋中，保存在干燥器中備用。

表1 各批次款冬花藥材樣品的來(lái)源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 款冬酮的含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件

色譜柱為ODS-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為水-甲醇（15∶85，V/V）；柱溫為30 ℃；流速為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm；進(jìn)樣量為20 μL。

2.1.2 款冬酮對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取款冬酮對(duì)照品5.88 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為117.60 μg/mL的款冬酮對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備

取款冬花藥材粉末1 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入乙醇20 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲提?。üβ?00 W，頻率40 kHz）1 h，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.4 系統(tǒng)適用性考察

取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液及空白溶液（乙醇），按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖（圖1，空白圖略）。結(jié)果顯示，供試品在與對(duì)照品溶液中款冬酮相同的出峰位置處有色譜峰出現(xiàn)；款冬酮色譜峰的峰形穩(wěn)定，與供試品溶液中的其他色譜峰能達(dá)到基線(xiàn)分離，理論板數(shù)為12 075。

圖1 款冬酮含量測(cè)定的高效液相色譜圖

2.1.5 線(xiàn)性關(guān)系考察

取“2.1.2”項(xiàng)下款冬酮對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，搖勻，得款冬酮質(zhì)量濃度分別為5.88、11.76、23.52、47.04、70.56 μg/mL的系列線(xiàn)性溶液。取上述系列溶液和款冬酮對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析，得回歸方程為Y＝48 417.62X－25 352（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，款冬酮的檢測(cè)質(zhì)量濃度在5.88～117.60 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積成良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.1.6 精密度考察

取“2.1.2”項(xiàng)下款冬酮對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，款冬酮峰面積的RSD為0.51%（n＝6），說(shuō)明儀器精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性考察

取編號(hào)S41的樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，款冬酮峰面積的RSD為0.50%（n＝6），說(shuō)明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 重復(fù)性考察

取編號(hào)S41的樣品6份，分別按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算樣品含量。結(jié)果顯示，樣品中款冬酮的平均含量為0.085 1%，RSD為0.63%（n＝6），說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取編號(hào)S41的樣品（款冬酮含量為0.085 1%）0.5 g，共6份，精密加入含量約為樣品含量100%的對(duì)照品0.5 mg，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，款冬酮的平均加樣回收率為100.72%，RSD為0.97%（n＝6），說(shuō)明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.1.10 樣品含量測(cè)定

取各批次樣品粉末，分別按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，以外標(biāo)法按干燥品計(jì)算樣品中款冬酮的含量，平行測(cè)定3次，取平均值。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各批次款冬花藥材樣品中款冬酮的含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，%）

2.2 水分、醇溶性浸出物及總灰分的含量測(cè)定

參照2020年版《中國(guó)藥典》（四部）通則0832水分測(cè)定法中的烘干法測(cè)定樣品中水分含量，以通則2201浸出物測(cè)定法下的熱浸法測(cè)定樣品中醇溶性浸出物含量，以通則2302灰分測(cè)定法測(cè)定樣品中總灰分含量。平行測(cè)定3次，取平均值。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各批次款冬花藥材樣品中水分、醇溶性浸出物及總灰分含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，%）

2.3 NIRS的采集

取約2/3樣品杯的樣品粉末，緩慢倒進(jìn)石英樣品杯中，用震動(dòng)工具輕輕敲打杯體邊緣，使樣品均勻分布。測(cè)樣前以空氣作空白對(duì)照，掃描扣除空氣背景干擾，并保持環(huán)境溫度在（24±0.5） ℃、相對(duì)濕度在20%～35%。采用積分球漫反射測(cè)樣，儀器參數(shù)設(shè)置為：分辨率8 cm－1，掃描64次，掃描范圍12 000～4 000 cm－1。每個(gè)測(cè)試樣品平行掃描5次，求平均值?？疃悠返腘IRS圖見(jiàn)圖2。

圖2 款冬花藥材樣品的原始光譜圖和導(dǎo)數(shù)處理圖

2.4 樣品質(zhì)控指標(biāo)NIRS定量分析模型的建立

2.4.1 樣品集的劃分

根據(jù)表2、表3含量測(cè)定結(jié)果將各質(zhì)控指標(biāo)含量不合格的樣品及同一產(chǎn)地中含量差異較大的樣品剔除，根據(jù)各指標(biāo)的含量分布情況，均勻選擇其中約4/5的樣品作為校正集，其余樣品作為驗(yàn)證集。樣品集劃分情況見(jiàn)表4。

表4 樣品集中各質(zhì)控指標(biāo)的含量分布

2.4.2 光譜預(yù)處理和建模波段的選擇

NIRS的原始光譜數(shù)據(jù)信息通常包括無(wú)用的數(shù)據(jù)信息，如基線(xiàn)漂移和樣品破碎粒度、樣品顏色、儀器狀態(tài)等造成的噪聲。為了使構(gòu)建的模型精確、穩(wěn)定，進(jìn)行光譜預(yù)處理至關(guān)重要。多元散射校正（multiplicative signal correction，MSC）、標(biāo)準(zhǔn)歸一化（standard normal variate，SNV）法、一階導(dǎo)數(shù)（first derivative）、二階導(dǎo)數(shù)（second derivative）、Savitzky-Golay平滑（Savitzky-Golay filter，SG）、導(dǎo)數(shù)濾波平滑（Norris derivative filter，ND）等均為常用的光譜預(yù)處理方法[15―16]。使用PLS法建立NIRS模型時(shí)，應(yīng)以決定系數(shù)（R2）、校正集均方差（root mean square error of calibration，RMSEC）和預(yù)測(cè)均方差（root mean square error of prediction，RMSEP）等評(píng)價(jià)參數(shù)用作評(píng)估模型質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)R2越接近1，RMSEC、RMSEP越小，且1＜RMSEP/RMSEC≤1.2時(shí)，模型越穩(wěn)定，預(yù)測(cè)精準(zhǔn)度越好[17―18]。綜合上述各評(píng)價(jià)參數(shù)以確立最優(yōu)的校正模型，可得款冬花中款冬酮定量模型的最佳光譜預(yù)處理方法為MSC+second derivative+ND，水分定量模型的最佳光譜預(yù)處理方法為MSC+second derivative，醇溶性浸出物定量模型的最佳光譜預(yù)處理方法為SNV+first derivative，總灰分定量模型的最佳光譜預(yù)處理方法為SNV+SG。

由圖2可知，款冬花藥材樣品在9 000～6 000、6 000～4 000 cm－1波段的吸光度值變化明顯，包含了豐富的化學(xué)信息。為保證樣品光譜信息的全面應(yīng)用，本研究根據(jù)樣品在NIRS區(qū)的吸光度值選取5個(gè)波段（11 200～4 000、9 000～4 000、6 000～4 000、9 000～6 000、11 200～6 000 cm－1）進(jìn)行考察，并結(jié)合模型評(píng)價(jià)參數(shù)選擇建模區(qū)間。結(jié)果可得，為款冬花中款冬酮和醇溶性浸出物選擇9 000～4 000 cm－1的波段建模時(shí)，模型的評(píng)價(jià)參數(shù)最佳；為其水分和總灰分選擇11 200～4 000 cm－1的波段建模時(shí)，模型的評(píng)價(jià)參數(shù)最佳。

2.4.3 主因子數(shù)的選擇

采用PLS建模過(guò)程中，主因子數(shù)的選擇對(duì)模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性有重要影響，取不同的主因子數(shù)建模時(shí)，模型的交叉驗(yàn)證均方差（root mean square error of cross validation，RMSECV）值會(huì)有所不同，而RMSECV值越小，模型的預(yù)測(cè)精確度就越高[19]。本研究利用TQ Analyst軟件進(jìn)行分析，通過(guò)交叉驗(yàn)證確定模型的主因子數(shù)，結(jié)果顯示，款冬花中款冬酮、水分、醇溶性浸出物和總灰分定量模型的最佳主因子數(shù)分別為10、2、7、13，對(duì)應(yīng)的RMSECV值分別為0.003 68、0.551 01、1.207 02、0.211 37，詳見(jiàn)圖3。

圖3 款冬花藥材各質(zhì)控指標(biāo)的主因子數(shù)隨RMSECV值的變化圖

2.4.4 NIRS定量分析模型的建立

利用TQ Analyst軟件對(duì)款冬花藥材樣品的NIRS數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，選擇最佳建模波段和最佳主因子數(shù)，分別建立款冬花質(zhì)控指標(biāo)款冬酮、水分、醇溶性浸出物和總灰分的NIRS定量分析模型。結(jié)果顯示，4個(gè)定量分析模型的R2分別為0.985 8、0.968 4、0.973 4、0.988 0；RMSEC分別為0.001 54、0.187、0.478、0.127；RMSEP分別為0.001 81、0.212、0.543、0.149；RMSEP/RMSEC分別為1.175 3、1.133 7、1.136 0、1.173 2，均在合理范圍內(nèi)（1＜RMSEP/RMSEC≤1.2）。綜合各評(píng)價(jià)參數(shù)可知，所建立的款冬花藥材中4個(gè)質(zhì)控指標(biāo)定量分析模型的預(yù)測(cè)精度較好，模型穩(wěn)定可靠。款冬花各質(zhì)控指標(biāo)真實(shí)值與NIRS模型預(yù)測(cè)值的相關(guān)性見(jiàn)圖4。

圖4 款冬花各質(zhì)控指標(biāo)真實(shí)值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)性

2.4.5 模型的外部驗(yàn)證與評(píng)價(jià)

為了驗(yàn)證所建模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，本研究使用所建模型來(lái)測(cè)定建模中未涉及的驗(yàn)證集樣品。用NIRS模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的比值表示預(yù)測(cè)回收率，計(jì)算驗(yàn)證集樣品中各質(zhì)控指標(biāo)的平均預(yù)測(cè)回收率。驗(yàn)證集樣品質(zhì)控指標(biāo)含量真實(shí)值與NIRS模型預(yù)測(cè)值的平均絕對(duì)誤差及平均預(yù)測(cè)回收率見(jiàn)表5。表5結(jié)果表明，所建NIRS模型對(duì)驗(yàn)證集樣品的預(yù)測(cè)能力較強(qiáng)、預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。

表5 驗(yàn)證集樣品各質(zhì)控指標(biāo)的驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

本研究測(cè)定了19個(gè)產(chǎn)地共130批款冬花藥材中款冬酮、水分、醇溶性浸出物和總灰分4個(gè)質(zhì)控指標(biāo)的含量。其中，款冬酮的含量為0.051 4%～0.103 5%，均值為0.083 4%；產(chǎn)于河北省張家口市蔚縣、山西省長(zhǎng)治市沁縣、山東省菏澤市和遼寧省本溪市的樣品中款冬酮含量較高，為0.094 0%～0.103 5%，均值為0.099 0%；產(chǎn)于新疆維吾爾自治區(qū)伊犁哈薩克自治州霍城縣和浙江省杭州市臨安區(qū)的樣品中款冬酮含量較低，為0.051 4%～0.064 0%，均值為0.057 2%，低于2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定。各批次樣品中醇溶性浸出物含量為20.17%～31.12%，均值為24.11%，均符合2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定。各批次樣品中水分含量為7.75%～10.93%，均值為9.65%；總灰分含量為7.68%～12.10%，均值為9.01%。參照《香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（第五期）中款冬花藥材水分及總灰分的規(guī)定，所有樣品中的水分含量均符合要求；而產(chǎn)于甘肅省隴南市西和縣、甘肅省臨夏回族自治州和政縣的樣品中總灰分含量為11.34%～12.10%，均值為11.71%，不符合該規(guī)定。本研究結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的款冬花藥材樣品，其質(zhì)量存在一定差異，這可能是因?yàn)橹参锷L(zhǎng)的土壤、氣候、生境等因素均會(huì)對(duì)藥材的質(zhì)量產(chǎn)生影響；部分樣品的質(zhì)控指標(biāo)含量不符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，還可能因?yàn)樗幉脑诓墒?、加工、炮制、運(yùn)輸、儲(chǔ)藏等環(huán)節(jié)中存在不規(guī)范操作，導(dǎo)致有效成分損失和雜質(zhì)含量增加。

NIRS不能直接對(duì)樣品含量進(jìn)行測(cè)定，在建立分析模型時(shí)，必須使用傳統(tǒng)的分析方法來(lái)獲得樣品中待測(cè)成分的含量結(jié)果，然后結(jié)合PLS等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立模型，最后才可以對(duì)未知樣品成分含量進(jìn)行預(yù)測(cè)。由于NIRS主要反映的是樣品中化學(xué)成分C－H、O－H、N－H等含氫基團(tuán)產(chǎn)生的吸收信息，因此可以應(yīng)用NIRS對(duì)大部分中藥材進(jìn)行分析，建立其質(zhì)控指標(biāo)的定量分析模型，然后將中藥材NIRS信息直接導(dǎo)入定量分析模型，即可快速預(yù)測(cè)其質(zhì)控指標(biāo)的含量。NIRS不適用于無(wú)法獲得大量樣本的樣品，因?yàn)樵诮r(shí)，為保證所建模型穩(wěn)定可靠，需要收集大量的樣品，以涵蓋不同樣品的特征。本研究收集了19個(gè)產(chǎn)地130批款冬花藥材樣品，能基本涵蓋不同產(chǎn)地款冬花藥材的NIRS特征及質(zhì)控成分含量存在的差異。此外，還需要定期對(duì)所建立的NIRS分析模型進(jìn)行校準(zhǔn)，補(bǔ)充其他產(chǎn)地的樣品信息，以適應(yīng)樣品可能存在的變化。

綜上所述，本研究利用NIRS技術(shù)結(jié)合PLS，通過(guò)選擇最佳光譜預(yù)處理方法、建模波段及主因子數(shù)，建立了19個(gè)產(chǎn)地130批款冬花藥材樣品中款冬酮、水分、醇溶性浸出物和總灰分含量的NIRS定量分析模型。經(jīng)參數(shù)評(píng)價(jià)和驗(yàn)證集樣本驗(yàn)證結(jié)果可知，所建立的NIRS模型對(duì)各質(zhì)控指標(biāo)的含量預(yù)測(cè)結(jié)果均較為準(zhǔn)確，說(shuō)明所建模型穩(wěn)定性好、測(cè)定結(jié)果可靠，可以應(yīng)用于款冬花藥材中款冬酮、水分、醇溶性浸出物和總灰分含量的快速批量預(yù)測(cè)，為款冬花藥材及其制劑的快速質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了新思路、新方法。