基于數(shù)字微鏡器件的快速超分辨晶格結(jié)構(gòu)光照明顯微研究*

楊浩智 聶夢(mèng)嬌 馬光鵬 曹慧群 林丹櫻 屈軍樂 于斌?

1) (深圳大學(xué)物理與光電工程學(xué)院,光電子器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,深圳 518060)

2) (深圳大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,深圳 518060)

超分辨結(jié)構(gòu)光照明顯微成像技術(shù)(super-resolution structured illumination microscopy,SR-SIM)具有時(shí)間分辨率高、光漂白和光毒性低和對(duì)熒光探針的要求少等優(yōu)點(diǎn),適用于活細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)程超分辨成像.采用二維晶格結(jié)構(gòu)光作為照明光,可以實(shí)現(xiàn)更快的成像速度和更低的光毒性,但同時(shí)也增加了系統(tǒng)的復(fù)雜性.為了解決此問(wèn)題,本文提出了一種基于數(shù)字微鏡器件的快速超分辨晶格結(jié)構(gòu)光照明顯微成像方法(digital micromirror device-based lattice SIM,DMD-Lattice-SIM),通過(guò)同步分時(shí)觸發(fā)DMD 和sCMOS 相機(jī)的方式實(shí)現(xiàn)二維正交晶格結(jié)構(gòu)光的產(chǎn)生,且只需要采集5 幅相移原始圖像即可重構(gòu)出超分辨圖像,相比于傳統(tǒng)SR-SIM需要9 幅相移原始圖像的方法,圖像采集時(shí)間減少了約44.4%.同時(shí),在基于空域和頻域聯(lián)合的SIM 重構(gòu)算法(joint space and frequency reconstruction method-SIM,JSFR-SIM)的基礎(chǔ)上,本文還發(fā)展了用于Lattice-SIM 的JSFR 超分辨圖像重構(gòu)方法(Lattice-JSFR-SIM),先在頻域?qū)υ紙D像進(jìn)行預(yù)濾波處理;然后,在空域?qū)V波后的圖像進(jìn)行超分辨重構(gòu)處理.與傳統(tǒng)頻域圖像重構(gòu)處理對(duì)比,該方法在512 ×512 像素?cái)?shù)的成像視場(chǎng)下重構(gòu)時(shí)間減少了約55.6%,對(duì)于實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞實(shí)時(shí)超分辨成像具有重要意義和應(yīng)用價(jià)值.

1 引言

近年來(lái),超分辨顯微成像技術(shù)(super-resolution microscopy,SRM)快速發(fā)展,達(dá)到了納米量級(jí)的空間分辨率,在生命科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用.目前,典型的SRM 主要包括受激輻射損耗(stimulated emission depletion,STED)顯微成像技術(shù)、單分子定位顯微成像技術(shù)(single molecule localization microscopy,SMLM)和超分辨結(jié)構(gòu)光照明顯微成像技術(shù)(super-resolution structured illumination microscopy,SR-SIM)等.STED 采用點(diǎn)掃描的成像方式,通過(guò)一束激光激發(fā)熒光分子,另一束環(huán)形空心損耗光抑制熒光發(fā)射,從而縮小點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)實(shí)現(xiàn)超分辨,其橫向分辨率可以實(shí)現(xiàn)50 nm 以內(nèi),并且不需要后期圖像處理,但需要特定的熒光標(biāo)記和高功率的損耗光,不適合活細(xì)胞樣品的長(zhǎng)時(shí)間觀察.SMLM 通過(guò)稀疏激發(fā)熒光分子,并對(duì)每個(gè)熒光分子的位置進(jìn)行擬合定位,通過(guò)重復(fù)數(shù)千次甚至數(shù)萬(wàn)次這個(gè)過(guò)程實(shí)現(xiàn)樣品的超分辨重構(gòu),成像速度慢,不適合活細(xì)胞樣品成像.SR-SIM 通過(guò)在樣品面產(chǎn)生一系列的結(jié)構(gòu)光照明圖案,把樣品處于衍射極限外的高頻信息編碼到衍射極限內(nèi);然后,通過(guò)算法后處理將高頻信息解調(diào)出來(lái)并移動(dòng)到真實(shí)位置,從而實(shí)現(xiàn)超分辨成像.由于照明圖案的空間頻率也受到顯微物鏡衍射極限的影響,因此,相比寬場(chǎng)顯微,SR-SIM 的理論橫向分辨率最多只能提升一倍,結(jié)合優(yōu)化算法等,分辨率可進(jìn)一步提高.總之,SR-SIM 具有時(shí)間分辨率高、光漂白和光毒性低,以及對(duì)熒光探針的要求少等優(yōu)點(diǎn),適用于活細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)程超分辨成像.

傳統(tǒng)SR-SIM 通常需要采集3 個(gè)不同方向和相位的至少9 幅結(jié)構(gòu)光照明圖像,基于頻域Wiener解卷積架構(gòu)以實(shí)現(xiàn)超分辨圖像重建[1],且超分辨圖像重建質(zhì)量依賴于對(duì)結(jié)構(gòu)光照明參數(shù)如頻率、相位的精確估計(jì),否則會(huì)產(chǎn)生明顯的圖像偽影.多幀成像特性和頻域去卷積重建涉及復(fù)雜耗時(shí)的照明結(jié)構(gòu)光參數(shù)精確估計(jì)制約了SR-SIM 的原始圖像采集速度與超分辨圖像重建效率,是其應(yīng)用于活細(xì)胞實(shí)時(shí)成像時(shí)所面臨的主要挑戰(zhàn).為了進(jìn)一步提高SR-SIM 的成像速度,研究人員發(fā)展了多種形式的結(jié)構(gòu)光照明及超分辨圖像重構(gòu)方法[2].為避免機(jī)械驅(qū)動(dòng)光柵帶來(lái)的不穩(wěn)定性和速度慢,利用空間光調(diào)制器[3](spatial light modulator,SLM)或數(shù)字微鏡器件[4-6](digital micromirror device,DMD)產(chǎn)生數(shù)字光柵,提高了結(jié)構(gòu)光照明的切換速度,進(jìn)而提高了SR-SIM 成像速度.研究人員在照明模板上進(jìn)行一些改進(jìn),如表1 所列.Mudry等[7]提出的blind-SIM 使用隨機(jī)散斑照明,在沒有照明模式的先驗(yàn)前提下即可計(jì)算超分辨圖像.Heintzmann[8]提出使用二維圖案照明用于飽和圖案激發(fā)顯微技術(shù)(saturated patterned excitation microscopy,SPEM),在保持高時(shí)間分辨率的同時(shí),實(shí)現(xiàn)比傳統(tǒng)SPEM 更高的空間分辨率.蔡司公司利用二維光柵生成晶格照明,并通過(guò)解卷積算法實(shí)現(xiàn)了60 nm的空間分辨率[9].Zheng等[10]提出大視場(chǎng)Lattice-SIM,利用二維光柵產(chǎn)生結(jié)構(gòu)光,使用SLM 實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)光的相移,并且通過(guò)控制光的偏振,避免兩個(gè)正交方向上光束的干涉,只需采集五張?jiān)紙D像即可重構(gòu)出超分辨圖像.然而,為了產(chǎn)生Lattice-SIM所需要的結(jié)構(gòu)光,需要同時(shí)使用物理光柵和SLM,并且需要在光路中加入特定的偏振片,增加了系統(tǒng)的復(fù)雜性.除了在照明模板上進(jìn)行改進(jìn),研究人員在重構(gòu)算法上也取得一些重要進(jìn)展,如表2 所列.Huang等[11]利用生物結(jié)構(gòu)的連續(xù)性作為先驗(yàn)知識(shí),有效地減少了SIM 重構(gòu)過(guò)程中產(chǎn)生的偽影.在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步將生物結(jié)構(gòu)的稀疏性[12]也納入先驗(yàn)知識(shí)范疇,在高幀速的情況下達(dá)到約60 nm的空間分辨率.Wen等[13]使用點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)改造方法優(yōu)化頻譜,無(wú)需進(jìn)行復(fù)雜的參數(shù)調(diào)整.上述幾種方法都是在頻域進(jìn)行重構(gòu),不可避免地涉及多次傅里葉變換和傅里葉逆變換,增加算法復(fù)雜度,圖像處理速度相對(duì)較慢.為了進(jìn)一步提升SIM 圖像的處理速度,Tu等[14]和Dan等[15]分別提出兩種直接在空域進(jìn)行處理的超分辨重構(gòu)算法,超分辨重構(gòu)速度分別比傳統(tǒng)在頻域中快約5.4 倍和7 倍.Wang等[16,17]提出聯(lián)合空域和頻域重構(gòu)的算法(joint space and frequency reconstruction,JSFR-SIM),先在頻域?yàn)V波,然后在空域重構(gòu),獲得光學(xué)切片的超分辨圖像.Wen等[18]提出先在空域重構(gòu),然后在頻域優(yōu)化頻譜,速度比Wiener-SIM 快約2 倍,并且能夠在沒有照明模式的先驗(yàn)知識(shí)的情況下,也能抑制偽影的產(chǎn)生.然而,目前還沒有針對(duì)Lattice-SIM 的空域重構(gòu)算法.

表1 不同照明圖案的SIM 對(duì)比Table 1. Comparison of SIM with different illumination patterns.

表2 不同重構(gòu)算法的SIM 對(duì)比Table 2. Comparison of reconstruction algorithms.

為了簡(jiǎn)化Lattice-SIM 的成像裝置,同時(shí)縮短原始圖像的采集時(shí)間和算法后處理時(shí)間,進(jìn)一步提升SR-SIM 的時(shí)間分辨率,實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)超分辨顯微成像,本文提出了一種基于DMD 的快速晶格結(jié)構(gòu)光照明顯微成像方法(DMD-based lattice SIM,DMDLattice-SIM),該方法采用高速DMD 和相機(jī)同步分時(shí)觸發(fā)來(lái)實(shí)現(xiàn)二維晶格照明,只需采集5 幅原始圖像;同時(shí),在JSFR-SIM 的基礎(chǔ)上,發(fā)展了Lattice-JSFR-SIM 超分辨圖像快速重構(gòu)方法,并進(jìn)行了理論推理、仿真和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證.通過(guò)固定細(xì)胞微管成像實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證了系統(tǒng)的分辨率和算法的可行性;通過(guò)活細(xì)胞線粒體動(dòng)態(tài)超分辨成像實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步驗(yàn)證了該系統(tǒng)實(shí)時(shí)成像能力.

2 DMD-Lattice-SIM 系統(tǒng)與方法

2.1 系統(tǒng)設(shè)計(jì)與搭建

圖1 為DMD-Lattice-SIM 的系統(tǒng)光路示意圖.一臺(tái)波長(zhǎng)為532 nm 的激光器(Sapphire 532-200CW CDRH,相干,美國(guó))發(fā)出的一束激光經(jīng)過(guò)由透鏡L1 (f=10 mm)和透鏡L2 (f=150 mm)組成的擴(kuò)束系統(tǒng)擴(kuò)束15 倍后,經(jīng)反射鏡M 反射后照射在DMD (DLP 6500FLQ,微鏡數(shù)為1920×1080,微鏡尺寸為7.56 μm×7.56 μm,德州儀器,美國(guó))上,通過(guò)控制微鏡的“on”和“off”狀態(tài)調(diào)控入射光場(chǎng)分布以產(chǎn)生特定的照明光柵;入射光束經(jīng)處于“on”狀態(tài)的微反射鏡反射后進(jìn)入由透鏡L3 (f=250 mm)和透鏡L4 (f=250 mm)組成的4f濾波系統(tǒng),在4f系統(tǒng)的頻譜面放置濾波掩模板,僅讓±1 級(jí)衍射通過(guò),然后,在透鏡L4 的像方焦面處形成正弦光柵;最終,正弦光柵經(jīng)過(guò)透鏡L5 (f=300 mm)、二向色鏡DM 和物鏡(60×,NA=1.49,尼康,日本)縮小90 倍成像在樣品面.樣品產(chǎn)生的熒光被同一個(gè)物鏡收集,經(jīng)過(guò)管鏡TL (f=200 mm)成像在科學(xué)級(jí)互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體(sCMOS)相機(jī)(ORCA-Fusion BT,像素?cái)?shù)為2304 ×2304,像素尺寸為6.5 μm×6.5 μm,濱松,日本)上.其中,DM 的作用是使激光反射進(jìn)入物鏡,同時(shí)使樣品的熒光信號(hào)透射進(jìn)入相機(jī).

圖1 DMD-Lattice-SIM 系統(tǒng)光路示意圖Fig.1.Schematic diagram of DMD-Lattice-SIM system.

2.2 二維晶格結(jié)構(gòu)光的產(chǎn)生

二維晶格結(jié)構(gòu)光可以看作是兩個(gè)正交的一維光柵的非相干疊加,一維光柵可以通過(guò)DMD 加載相應(yīng)的模板然后濾波得到,使用Labview 通過(guò)數(shù)據(jù)采集卡(NI,USB-6363)控制DMD 和相機(jī)同步分時(shí)觸發(fā),實(shí)現(xiàn)兩個(gè)光柵的非相干疊加,產(chǎn)生晶格結(jié)構(gòu)光.圖2(a)為數(shù)據(jù)采集卡輸出的信號(hào),利用DMD快速切換的特性,可以在相機(jī)一次曝光的時(shí)間內(nèi),DMD 依次加載兩個(gè)正交方向的一維光柵,相機(jī)連續(xù)收集如圖2(b)和圖2(c)所示的兩個(gè)方向的光柵激發(fā)的熒光信號(hào),最終得到圖2(d)的熒光圖像.由于兩個(gè)方向的光柵是分時(shí)觸發(fā)的,這種方法可避免兩個(gè)光柵之間的干涉串?dāng)_,不需要考慮激發(fā)光偏振方向的影響,并且DMD 加載二進(jìn)制圖片的切換速度高達(dá)9500 Hz,不會(huì)影響相機(jī)最終的采集速度.

圖2 產(chǎn)生晶格結(jié)構(gòu)光照明的原理示意圖(a) 數(shù)據(jù)采集卡的控制信號(hào);(b) DMD 加載第一張模板時(shí)相機(jī)采集的模擬數(shù)據(jù);(c) DMD加載第二張模板時(shí)相機(jī)采集的模擬數(shù)據(jù);(d) 相機(jī)在一次曝光時(shí)間內(nèi)采集的模擬數(shù)據(jù);(e)—(g) 圖(b)—(d)的傅里葉頻譜Fig.2.Schematic diagram of the principle of generating lattice structured illumination: (a) Control signal of the data acquisition board;(b) analog data collected by the camera when the DMD loads the first template;(c) analog data collected by the camera when the DMD loads the second template;(d) analog data collected by the camera within one exposure time;(e)-(g) frequency spectra of panel (b)-(d).

2.3 超分辨圖像重構(gòu)方法

傳統(tǒng)SR-SIM 重構(gòu)算法通過(guò)測(cè)量計(jì)算照明結(jié)構(gòu)光頻率、相位等照明參數(shù),然后把原始圖像進(jìn)行傅里葉變換轉(zhuǎn)換到頻域,求解線性方程組得到樣品的低頻信息和高頻信息,再把每個(gè)分量信息移動(dòng)到其真實(shí)的位置上,相加后轉(zhuǎn)化為空域得到超分辨圖像.JSFR-SIM 利用照明參數(shù)構(gòu)造參數(shù)矩陣,先在頻域進(jìn)行濾波,抑制離焦背景,然后在空域中把濾波后的圖像與對(duì)應(yīng)的參數(shù)矩陣進(jìn)行點(diǎn)乘,相加后即可得到超分辨圖像.本文所使用的超分辨重構(gòu)算法是在JSFR-SIM 的基礎(chǔ)上,提出Lattice-JSFR-SIM,用二維正交光柵照明代替一維光柵條紋照明,對(duì)參數(shù)矩陣進(jìn)行修改,具體原理如下.

在SIM 中采用二維光柵照明,照明光場(chǎng)的強(qiáng)度分布可以表示為

其中r是二維空間的位置矢量;I0是均值照明強(qiáng)度;m1和m2,ω1和ω2,φ1,i和φ2,i分別是兩個(gè)正交條紋的調(diào)制度、頻率矢量和初相位;i表示第i張照明模板.樣品受到二維光柵的照明激發(fā)出熒光,由于光學(xué)顯微成像系統(tǒng)具有低通濾波的特性,sCMOS相機(jī)檢測(cè)到的熒光信號(hào)強(qiáng)度分布可以表示為

其中O(r) 表示樣品熒光分布,H(r) 表示顯微系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù),?表示卷積運(yùn)算.與JSFR-SIM 類似,假設(shè)存在c1(r),c2(r),c3(r),c4(r),c5(r),使得下式對(duì)于任何O(r)和H(r) 恒成立,則系統(tǒng)的有效點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)可以通過(guò)將寬場(chǎng)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)乘以調(diào)制函數(shù)2+cos(ω1r)+cos(ω2r) 得到:

把(1)式和(2)式代入(3)式,并利用卷積公式分別得到下列兩個(gè)式子:

由于(4)式和(5)式相等,通過(guò)比較得出下列關(guān)系:

根據(jù)三角函數(shù)公式對(duì)上述式子左右兩邊進(jìn)行展開,得到:

由于三角函數(shù)具有正交性,并且ω1和ω2是正交的頻率矢量,上述式子對(duì)于任意r′恒成立,則(7)式中常數(shù)項(xiàng)、cosω1r′、sinω1r′、cosω2r′和sinω2r′的系數(shù)分別相等,滿足下列方程組:

寫成矩陣運(yùn)算的形式:

由于照明光的頻率、相位、調(diào)制度均可以通過(guò)計(jì)算得到,只要選擇適當(dāng)?shù)摩?,i和φ2,i,使得矩陣M可逆,則可以通過(guò)下列式子得到ci(r),再通過(guò)(3)式得到超分辨重構(gòu)圖像.

DMD 加載不同的光柵圖片,可以實(shí)現(xiàn)不同的相位變化.采用φ1,i ∈{0,π/2,π,π,π} ,φ2,i ∈{0,0,0,π/2,π}的兩個(gè)方向條紋的相移量組合,根據(jù)(1)式和(2)式可以得到寬場(chǎng)圖像的熒光信號(hào)強(qiáng)度分布為

Lattice-JSFR-SIM 的重構(gòu)過(guò)程如圖3 所示.其重構(gòu)過(guò)程如下: 首先,根據(jù)原始圖像計(jì)算出照明晶格的頻率、相位和調(diào)制度;其次,根據(jù)(10)式得到系數(shù)矩陣ci(r) ;然后,將原始圖像轉(zhuǎn)換到頻域進(jìn)行濾波、再轉(zhuǎn)換到空域與系數(shù)矩陣進(jìn)行點(diǎn)乘、疊加等操作;最終得到超分辨圖像.

圖3 Lattice-JSFR-SIM 重構(gòu)過(guò)程Fig.3.Lattice-JSFR-SIM reconstruction process.

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 數(shù)值仿真實(shí)驗(yàn)

首先,使用模擬數(shù)據(jù)驗(yàn)證算法的可行性.生成一個(gè)1000 ×1000 像素?cái)?shù)的星狀測(cè)試圖像,像素大小為10 nm ×10 nm,如圖4(a)所示.模擬的熒光發(fā)射波長(zhǎng)為600 nm,物鏡的數(shù)值孔徑NA為1.49,由阿貝衍射極限公式計(jì)算可知,寬場(chǎng)圖像分辨率rWF=≈201 nm .使用±45°兩個(gè)正交方向的正弦光柵作為照明晶格,光柵周期dG為300 nm,根據(jù)理論公式可以得到超分辨圖像分辨率為rSIM=120 nm .為進(jìn)行對(duì)比,使用傳統(tǒng)正弦條紋作為照明光源,條紋方向與上述晶格方向相同,分別為45°和-45°,相位為φ ∈{0,2π/3,4π/3},使用開源算法fairSIM[19]進(jìn)行重構(gòu).圖4(b)是衍射受限的寬場(chǎng)圖像,圖4(c)是條紋照明fairSIM 重構(gòu)圖像,圖4(d)是晶格照明Lattice-SIM 重構(gòu)圖像,圖4(e)是晶格照明Lattice-JSFR-SIM 重構(gòu)圖像.圖4(f)所示為曲線所截取的切面強(qiáng)度分布對(duì)比.從圖4 可以看到,Lattice-JSFRSIM 處理后的圖像能夠分辨相鄰約145 nm 的條紋,與理論計(jì)算的結(jié)果接近,并且與開源算法fairSIM處理的結(jié)果接近.

圖4 模擬數(shù)據(jù)重構(gòu)結(jié)果(a) 真實(shí)圖像;(b) 寬場(chǎng)圖像;(c) fairSIM 超分辨重構(gòu)圖像;(d) Lattice-SIM 超分辨重構(gòu)圖像;(e) Lattice-JSFR-SIM 超分辨重構(gòu)圖像;(f) 圖(b)—(e)中曲線的切面強(qiáng)度分布Fig.4.Reconstructed results of the simulated data: (a) Ground truth;(b) wide-field image;(c) fairSIM super-resolution reconstructed image;(d) Lattice-SIM super-resolution reconstructed image;(e) Lattice-JSFR-SIM super-resolution reconstructed image;(f) intensity distribution of the profile in panel (b)-(e).

接下來(lái),對(duì)算法運(yùn)行速度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.在對(duì)樣品進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間觀測(cè)記錄時(shí),每個(gè)照明周期對(duì)應(yīng)的照明參數(shù)(如頻率、相位等)可以認(rèn)為是相同的.因此,在統(tǒng)計(jì)算法運(yùn)行速度時(shí),無(wú)需考慮計(jì)算照明參數(shù)的時(shí)間,只需計(jì)算超分辨重構(gòu)所需的時(shí)間.使用的電腦配置如下: Intel(R) Core(TM) i5-10500 CPU@3.10 GHz,DDR4 2133 MHz 16 GB,NVIDIA Ge-Force GTX 1050Ti,Netac NVMe SSD 512 GB,Windows 10 專業(yè)版,MATLAB R2021a.每個(gè)算法分別重復(fù)運(yùn)行5000 次,記錄每次運(yùn)行超分辨處理的代碼所需的時(shí)間,得到平均值和標(biāo)準(zhǔn)差.結(jié)果如表3 所列.在處理前,先對(duì)圖像進(jìn)行插值縮小一倍像素大小,以滿足分辨率要求.采集時(shí)間根據(jù)相機(jī)對(duì)應(yīng)尺寸下最快幀速與采集張數(shù)的乘積得到,傳統(tǒng)頻域算法是Zheng等[10]提供的開源算法.從結(jié)果可以看出,空域重構(gòu)算法的速度是傳統(tǒng)頻域算法的2 倍多,結(jié)合使用GPU 重構(gòu),可以進(jìn)一步地降低重構(gòu)時(shí)間.空域重構(gòu)算法通過(guò)避免多次傅里葉變換和傅里葉逆變換的操作,極大地減少了重構(gòu)時(shí)間.同時(shí),采用晶格照明只需采集5 幅原始圖像,不僅減少了采集時(shí)間,而且圖像數(shù)量的減少也會(huì)相應(yīng)地縮短了重構(gòu)時(shí)間.

表3 算法運(yùn)行速度對(duì)比Table 3. Comparison of algorithm running speed.

3.2 固定細(xì)胞微管樣品的超分辨成像

在前期的研究工作中,本課題組[20]合成了一種用于超分辨成像的InP/ZnSe/Zns 量子點(diǎn),利用該量子點(diǎn)標(biāo)記非洲綠猴腎細(xì)胞(BSC-1)微管樣品,進(jìn)行了系統(tǒng)的分辨率標(biāo)定,以驗(yàn)證所搭建的Lattice-JSFR-SIM 系統(tǒng)的超分辨成像能力.使用5 個(gè)不同的晶格模板進(jìn)行照明,并采用上述方法對(duì)采集到的圖像進(jìn)行超分辨重構(gòu).結(jié)果如圖5 所示,其中圖5(a)是寬場(chǎng)圖像,圖5(b)是超分辨重構(gòu)圖像,圖5(c)和圖5(d)分別是圖5(a)和圖5(b)中所選區(qū)域的放大圖,圖5(g)是劃線區(qū)域的切面強(qiáng)度分布對(duì)比.由圖5 可以看出,經(jīng)過(guò)超分辨重構(gòu)后的圖像能夠區(qū)分寬場(chǎng)圖像無(wú)法區(qū)分的微管,并且具有更高的信噪比.進(jìn)一步利用自適應(yīng)去相關(guān)分辨率估計(jì)方法[21]計(jì)算了寬場(chǎng)圖像和超分辨重構(gòu)圖像的分辨率,如圖5(e)和圖5(f)所示,得到的圖像分辨率分別是317 nm 和135 nm.

圖5 固定細(xì)胞微管實(shí)驗(yàn)結(jié)果(a) 寬場(chǎng)圖像;(b) 超分辨圖像;(c) 圖(a)中所選區(qū)域的放大;(d) 圖(b)中所選區(qū)域的放大圖;(e) 圖(a)的去相關(guān)分辨率估計(jì);(f) 圖(b)的去相關(guān)分辨率估計(jì);(g) 圖(c)和圖(d)中劃線位置的切面強(qiáng)度分布Fig.5.Experimental results of fixed cell microtubules: (a) Wide-field image;(b) super-resolution image;(c) magnification of the selected area in panel (a);(d) magnification of the selected area in panel (b);(e) corresponding decorrelation analysis of panel (a),C.c.,cross-correlation;(f) corresponding decorrelation analysis of panel (b);(g) intensity distribution of the profile at the line position in panel (c) and (d).

3.3 活細(xì)胞線粒體樣品的動(dòng)態(tài)超分辨成像

為了驗(yàn)證該系統(tǒng)的快速成像能力,使用Mito-TrackerTMOrange CMTMRos標(biāo)記BSC-1活細(xì)胞線粒體樣品進(jìn)行動(dòng)態(tài)成像.相機(jī)的采集頻率為100 Hz,DMD 的切換頻率為200 Hz,利用Labview控制相機(jī)和DMD 實(shí)現(xiàn)連續(xù)同步分時(shí)采集.結(jié)果如圖6 所示,圖6(a)是連續(xù)采集數(shù)據(jù)中第一張寬場(chǎng)圖像,圖6(b)是對(duì)應(yīng)的超分辨重構(gòu)圖像.利用自適應(yīng)去相關(guān)分辨率估計(jì)方法計(jì)算寬場(chǎng)圖像和超分辨重構(gòu)圖像的分辨率,如圖6(c)和圖6(d)所示,得到的圖像分辨率分別是373 nm 和138 nm.圖6(e)是圖6(b)中所選區(qū)域的放大圖,該采集時(shí)序以0.5 s 為間隔進(jìn)行展示.在該序列中,可以清晰地看到箭頭所指的線粒體的動(dòng)態(tài)過(guò)程: 在第1 s 時(shí)線粒體分裂成兩段,在第3 s 時(shí)融合成一段,在4.5 s 時(shí)又分裂成兩段.為了更清晰觀察線粒體的動(dòng)態(tài)過(guò)程,把該動(dòng)態(tài)過(guò)程以0.05 s 為間隔,從第3.5 s 開始進(jìn)行展示,如圖6(f)所示,該時(shí)序可以更清楚地看到線粒體的分裂過(guò)程,充分說(shuō)明了所提出的系統(tǒng)具備快速成像的能力,對(duì)監(jiān)測(cè)活細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化具有重要意義.

圖6 BSC-1 活細(xì)胞線粒體動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(a) 寬場(chǎng)圖像;(b) 超分辨圖像;(c) 圖(a)的去相關(guān)分辨率估計(jì);(d) 圖(b)的去相關(guān)分辨率估計(jì);(e) 圖(b)中所選區(qū)域放大圖,時(shí)間間隔為0.5 s;(f) 圖(b)中所選區(qū)域放大圖,時(shí)間間隔為0.05 sFig.6.Experimental results of BSC-1 live cell mitochondria dynamics: (a) Wide-field image;(b) super-resolution image;(c) corresponding decorrelation analysis of panel (a);(d) corresponding decorrelation analysis of panel (b);(e) magnification of the selected area in panel (b) with a time interval of 0.5 s;(f) magnification of the selected area in panel (b) with a time interval of 0.05 s.

4 結(jié)論

本文提出和搭建了基于DMD 的超分辨晶格結(jié)構(gòu)光照明顯微成像系統(tǒng),通過(guò)DMD 和相機(jī)同步分時(shí)觸發(fā)的方式生成晶格結(jié)構(gòu)光照明,僅需5 張?jiān)紙D像即可重構(gòu)出超分辨圖像,簡(jiǎn)化了系統(tǒng),提升了采集速度.同時(shí),該系統(tǒng)采用了聯(lián)合空域和頻域的重構(gòu)方法,進(jìn)一步提高了重構(gòu)速度.最后,通過(guò)在該系統(tǒng)上進(jìn)行微管和活細(xì)胞線粒體實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證了該方法具備超分辨實(shí)時(shí)成像的能力,為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)超分辨實(shí)時(shí)成像打下基礎(chǔ).本文所提出的方法可以幫助研究人員更好地在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中尋找感興趣區(qū)域,并提供實(shí)時(shí)的反饋信息,使得研究人員能夠及時(shí)調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件、干預(yù)過(guò)程或觸發(fā)特定事件,對(duì)于實(shí)驗(yàn)控制和優(yōu)化非常有用.在本文工作的基礎(chǔ)上,還可以結(jié)合高保真SIM 重建算法[13,17]把有效點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)設(shè)計(jì)成理想形式,進(jìn)一步優(yōu)化頻譜以減少重建偽影,提升成像質(zhì)量.