基于PPARγ/Nrf2信號通路探討頭穴透刺對腦出血大鼠血腫清除的影響

許文婷 孔瑩 薛玉滿

摘要 目的：基于過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）/核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）信號通路探討頭穴透刺對腦出血大鼠血腫清除的影響。方法：將160只雄性SD大鼠分為空白組、假手術(shù)組（顱內(nèi)注射生理鹽水）、模型組（腦出血模型）及干預(yù)組（腦出血模型＋頭穴透刺治療），每組40只。造模后3 d及頭穴透刺治療結(jié)束后檢測各組大鼠神經(jīng)功能、腦組織液中血紅蛋白（Hb）及一氧化氮（NO）含量、腦組織中Nrf2、CD36蛋白及mRNA表達(dá)量；觀察各組腦血腫周圍微血管分布并計算微血管直徑及密度指數(shù)。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，造模后3 d干預(yù)組與模型組腦組織Hb及NO水平升高，Nrf2、CD36蛋白及mRNA表達(dá)均降低，微血管直徑及微血管密度指數(shù)均減小（P＜0.05）。與造模后3 d比較，治療結(jié)束后干預(yù)組神經(jīng)功能評分、微血管直徑及微血管密度指數(shù)升高，Nrf2、CD36蛋白及mRNA表達(dá)降低，且優(yōu)于模型組（P＜0.05）；干預(yù)組Hb及NO水平降低，且低于模型組（P＜0.05）。干預(yù)組與假手術(shù)組治療后微血管直徑及微血管密度指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：頭穴透刺可促進(jìn)腦出血大鼠腦組織Nrf2、CD36蛋白及mRNA表達(dá)，降低腦組織Hb及NO水平，改善血腫周圍微血管血流狀態(tài)，對腦血腫清除有促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞 腦出血；腦血腫清除；過氧化物酶體增殖物激活受體γ/核因子E2相關(guān)因子2信號通路；頭穴透刺；大鼠；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.05.011

The Effect of Scalp Acupuncture on Hematoma Clearance in Rats with Cerebral Hemorrhage Based on PPARγ/Nrf2 Signaling Pathway

XU Wenting， KONG Ying， XUE Yuman

Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin 150040， Heilongjiang， China; Second Affiliated Hospital， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin 150001， Heilongjiang， China

Corresponding Author XUE Yuman， E-mail： xueyuman@163.com

Abstract Objective：To investigate the effect of scalp acupuncture on hematoma clearance in rats with cerebral hemorrhage based on the peroxisome proliferator-activated receptor γ（PPARγ）/nuclear factor E2 associated factor 2（Nrf2） signaling pathway.Methods：One hundred and sixty male SD rats were divided into blank group，sham group（intracranial injection of physiological pressure water），model group（intracerebral hemorrhage model） and intervention group（intracerebral hemorrhage model＋scalp acupuncture treatment），with 40 rats in each group.After 3 days modeling and after scalp acupuncture，nerve function，hemoglobin（Hb） and nitric oxide（NO） content in brain tissue fluid，Nrf2，CD36 protein and mRNA expression in cerebral tissue were measured.The distribution of microvessels around cerebral hematoma in each group was observed and the diameter and density index of microvessels were detected.Results：After 3 days modeling，compared with sham group，Hb and NO levels increased，Nrf2，CD36 protein and mRNA expression levels in? cerebral tissue of intervention group? and model group decreased，and microvessel diameter and microvessel density index were decreased（P＜0.05）.After 3 days modeling，neurological function score，microvascular diameter and microvascular density index increased，Nrf2，CD36 protein and mRNA expression levels in the intervention group?? decreased? after treatment，and those were better in the model group（P＜0.05）.The levels of Hb and NO in the intervention group were lower than those in the model group（P＜0.05）.After treatment，there were significant differences in microvessel diameter and microvessel density index between the intervention group and the sham group（P＜0.05）.Conclusion：The scalp acupuncture could promote the expression of Nrf2 and CD36 proteins and mRNA in? cerebral tissue of rats with cerebral hemorrhage，decrease the levels of Hb and NO in? cerebral tissue，improve the blood flow state of microvessels around hematoma，and promote the removal of cerebral hematoma.

Keywords cerebral hemorrhage; hematoma clearance; peroxisome proliferator-activated receptor γ/nuclear factor E2 associated factor 2 signaling pathway; scalp acupuncture; rats; experimental study

基金項(xiàng)目 國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（No.82374570，8194305）；黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.LH2023H063）；黑龍江省中醫(yī)藥科研項(xiàng)目（No.ZHY2020-162）；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)科研基金項(xiàng)目（No.2019MS24）；黑龍江省首批名老專家學(xué)術(shù)繼承項(xiàng)目（2022—2025年）

作者單位 1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)（哈爾濱? 150040）；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院（哈爾濱? 150001）

通訊作者 薛玉滿，E-mail：xueyuman@163.com

引用信息 許文婷，孔瑩，薛玉滿.基于PPARγ/Nrf2信號通路探討頭穴透刺對腦出血大鼠血腫清除的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（5）：833-838.

腦出血是指非外傷性腦實(shí)質(zhì)內(nèi)血管破裂引起的出血，是一種嚴(yán)重的急性腦血管疾病，腦出血后形成的腦血腫對周圍血管壓迫、暫時性缺血及血腫分解毒素，均是引起病人繼發(fā)性腦損傷的主要原因［1］。目前，雖可經(jīng)微創(chuàng)手術(shù)緩解腦出血后占位效應(yīng)，臨床研究顯示，與傳統(tǒng)治療方法比較，微創(chuàng)手術(shù)未明顯改善病人預(yù)后及生存率［2］。腦血腫占位雖被清除，但殘存的血腫產(chǎn)物及其降解物持續(xù)造成神經(jīng)血管損害。因此，臨床亟須一種可促進(jìn)紅細(xì)胞清除及吸收，改善血腫周圍微血管，促進(jìn)腦組織及腦神經(jīng)功能恢復(fù)的有效辦法。已知過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）、核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）在介導(dǎo)內(nèi)源性腦血腫清除過程中有明顯的調(diào)節(jié)作用，CD36是紅細(xì)胞及受損細(xì)胞吞噬清除的重要介質(zhì)，通過激動PPARγ/Nrf2信號通路及上調(diào)CD36表達(dá)，增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞對紅細(xì)胞的吞噬作用，促進(jìn)腦血腫的吸收［3］。有研究顯示，頭穴透刺對腦出血模型大鼠內(nèi)源性清除腦血腫具有一定的促進(jìn)作用［4］。本研究基于PPARγ/Nrf2信號通路探討頭穴透刺對腦出血大鼠血腫清除系統(tǒng)的影響，以期為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雄性SD大鼠160只（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)GLP實(shí)驗(yàn)動物中心），體質(zhì)量（300±20）g，周齡（12±2）周，實(shí)驗(yàn)前2周為大鼠適應(yīng)期，注意飼養(yǎng)溫度、濕度等環(huán)境控制。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑

苯巴比妥鈉（上海上藥新亞藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H31020502），Ⅳ型膠原酶［福州奧研實(shí)驗(yàn)器材，規(guī)格：100 mg（Biosharp）］，水合氯醛（青島宇龍海藻，國藥準(zhǔn)字H37022673），羊抗兔IgG（Solarbio，SE134），β-actin（翌圣生物科技，30102ES40），兔抗-CD36（Abcam，EPR22512-58），兔抗-Nrf2（Abcam，EP1808Y），TRIzol試劑盒（R30506），實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative reverse transcription，RT-PCR）試劑盒（賽默飛，18090010）。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器

腦立體定位儀（江蘇賽昂斯生物科技，貨號SA301），紫外分光光度計，微量注射器（Hamilton 瑞士，貨號1011211402），臺式高速冷凍離心機(jī)，NanoDrop 2000（Therm公司，美國），超低溫冰箱（海信，型號HD-86L390），T100型PCR儀（Bio-Rad，美國），7300型RT-PCR儀（美國ABI公司），顯微攝影成像系統(tǒng)（Moticam3000），針灸針（蘇州醫(yī)療用品，華佗牌），電針治療儀（上海華誼醫(yī)用儀器，G6805-Ⅱ型）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

將160只大鼠隨機(jī)分為空白組、假手術(shù)組、模型組及干預(yù)組，各40只；模型組及干預(yù)組構(gòu)建腦出血模型，干預(yù)組同時進(jìn)行電針頭穴透刺干預(yù)。

1.3.2 動物建模

參照相關(guān)文獻(xiàn)［5］，采用苯巴比妥鈉（30? mg/kg）對假手術(shù)組、模型組及干預(yù)組大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，俯臥位固定在立體定向儀上。頭中下部切開2.0 cm，在前囟右側(cè)距離顱骨背側(cè)前囟后0.2 mm、中線2.9 mm，點(diǎn)位鉆孔（尾狀核位置）?？瞻捉M不予以任何處理；將微量注射器（針頭0.7 mm）沿鉆孔進(jìn)針6 mm，假手術(shù)組注射生理鹽水1 μL，模型組和干預(yù)組均注射（20 min緩慢推進(jìn)）含有1 U/μL Ⅳ型膠原酶的生理鹽水1 μL（濃度66.67%）。待藥物完全吸收后，將針頭緩慢拔出，使用骨蠟封閉大鼠顱骨孔，縫合手術(shù)傷口。以下情況視為大鼠建模不成功（需將各組建模失敗數(shù)量補(bǔ)齊）：Zausinger評分為5分（無法自發(fā)行走為0分；自由行走但向病灶對側(cè)旋轉(zhuǎn)為1分；抓住大鼠尾巴，大鼠向病灶對側(cè)旋轉(zhuǎn)為3分；大鼠病灶對側(cè)前爪無法伸直為4分；無神經(jīng)功能缺損癥狀為5分）［6］；示例斬首觀察腦組織未出現(xiàn)腦血腫或蛛網(wǎng)膜下腔出血；術(shù)后死亡。

1.3.3 分組處理

造模成功后3 d，將假手術(shù)組、模型組及干預(yù)組大鼠充分固定于操作臺上，假手術(shù)組及模型組不進(jìn)行處置，干預(yù)組均給予刺“百會”透“太陽”電針治療。百會：位于大鼠兩耳根連線與頭中線交匯點(diǎn)；太陽：大鼠外眼角與耳見凹陷位。電針刺激前對相應(yīng)穴位及器械消毒，取0.25 mm×30 mm毫針，分別刺入百會（向右前太陽穴方向）及右側(cè)太陽穴；將電針儀正極連接百會穴毫針，負(fù)極連接太陽穴毫針，調(diào)頻2 Hz連續(xù)波，1 mA電流，留針30 min觀察。每日電針干預(yù)1次，連續(xù)1周。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 神經(jīng)功能評價

造模成功后3 d、頭穴透刺治療周期結(jié)束后參照改良馬氏評分（Modified Gorcia Score）［7］對各組大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評估（計算各項(xiàng)目總分），詳見表1。

1.4.2 腦血腫周圍微血管圖像

參照相關(guān)文獻(xiàn)［8］，假手術(shù)組、模型組及干預(yù)組（造模后3 d、干預(yù)治療后）采用照相顯微鏡（NikonE600，日本）攝取每組10只解剖后大鼠腦組織切片圖像，將其導(dǎo)入MIAS2000圖像分析系統(tǒng)（四川大學(xué)圖像研究所）。隨機(jī)選取每只大鼠緊鄰腦血腫部位的10支微血管，測定直徑平均值；選取緊鄰腦血腫1 mm2視野內(nèi)的10個緊鄰區(qū)域（視野面積Sf），測定微血管覆蓋面積（Sc），計算微血管密度指數(shù)＝Sc/Sf，取平均值。

1.4.3 血紅蛋白（Hb）及一氧化氮（NO）檢測［9］

參照相關(guān)文獻(xiàn)［9］，于造模成功后3 d、頭穴透刺治療結(jié)束后，每組取10只大鼠，采用5%水合氯醛麻醉后開胸，于右心耳灌入預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液（PBS），待心尖部流出清亮液體為止；斷頭處死大鼠，將腦組織移至玻璃皿中，加入1 100 μL PBS仔細(xì)研磨后，將上述混合液以15 000 r/min、4 ℃離心30 min，取上清液。移液管取上清液25 μL移入96孔板中，以1∶4比例逐步加入文齊氏液，室溫條件下孵育5 min，紫外分光光度計檢測540 nm波長OD值，計算腦組織液Hb水平。采用硝酸還原酶法測量NO，取上清液樣本加入8 μL硝酸試劑，孵育30 min后再加入顯色劑，靜置10 min，紫外分光光度計于550 nm波長、0.5 cm光鏡下比色，并計算含量。

1.4.4 免疫組化測定Nrf2、CD36蛋白含量

造模成功3 d、頭穴透刺治療結(jié)束后，每組取10只大鼠，用5%水合氯醛麻醉后處死，取血腫周圍腦組織制備石蠟標(biāo)本（10%中性甲醛固定，石蠟包埋），之后制備常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）病理切片（4 μm）備用。將上述石蠟切片經(jīng)脫蠟至水化，封閉通透液（40 mL PBS＋120 μL TritonX-100＋400 μL 30%H2O2）浸潤30 min（RT避光），PBS溶液洗脫3次×3 min；依次加入3%H2O2與5%正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，溫育10 min；滴加一抗，4 ℃冷藏過夜；取出樣本PBS溶液洗脫3次×3 min，之后依次滴入二抗、辣根過氧化酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，分別于37 ℃溫箱孵育30 min；PBS溶液再洗脫3次×5 min，加入二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色5～10 min，將顯色片用清水洗脫后置于蘇木精中10 min，復(fù)染后脫水、透明、封片。每張切片取10個200倍鏡下視野，由專業(yè)病理醫(yī)師觀察判斷Nrf2、CD36蛋白表達(dá)。

1.4.5 RT-PCR檢測Nrf2、CD36 mRNA表達(dá)量

造模成功3 d、頭穴透刺治療結(jié)束后，每組取10只大鼠，用5%水合氯醛麻醉后處死取腦組織。冰PBS沖洗腦組織后于液氮中保存。取血腫周圍腦組織置于玻璃皿中碾碎，加入1 mL TRlzol后移至離心管靜置10 min；以12 000 r/min、4 ℃高速離心5 min，取上清液加入氯仿200 μL充分均勻振動，25 ℃靜置10 min；再以12 000 r/min、4 ℃離心2次，每次5 min。室溫干燥沉淀10 min，加入20 μL蒸餾水溶解。打開NanoDrop2000測定樣品中RNA總質(zhì)量。取上述RNA樣本0.5 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系：SYBR Green 1染料10 μL＋0.5 μg RNA樣本＋2 μmol/L引物（正向、反向引物各1 μmol/L）＋dNTP 1 μL＋TaqDNA多聚酶（50 U/mL）2 μL；在PCR儀上進(jìn)行PCR周期擴(kuò)增反應(yīng)：起始94 ℃ 5 min；30個周期：變性94 ℃ 5 min，退火58 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1 min，最后延伸72 ℃ 5 min，得到PCR產(chǎn)物。記錄各樣本Ct值，以2－△△Ct計算相對表達(dá)量。引物序列見表2。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組神經(jīng)功能評分比較

造模后3 d，與假手術(shù)組比較，干預(yù)組與模型組大鼠神經(jīng)功能評分均下降（P＜0.05）；與造模后3 d比較，治療結(jié)束后干預(yù)組神經(jīng)功能評分升高，且高于模型組（P＜0.05）。詳見表3。

2.2 各組腦血腫周圍微血管直徑及密度指數(shù)比較

與假手術(shù)組比較，造模后3 d干預(yù)組及模型組微血管直徑及微血管密度指數(shù)均降低（P＜0.05）；與造模后3 d 比較，治療結(jié)束后干預(yù)組微血管直徑及微血管密度指數(shù)均升高，且高于模型組（P＜0.05），低于假手術(shù)組（P＜0.05）。詳見表4。

2.3 各組Hb及NO含量比較

與假手術(shù)組比較，模型組及干預(yù)組造模后3 d腦組織Hb及NO含量均升高（P＜0.05）；與造模后3 d比較，治療結(jié)束后干預(yù)組Hb及NO水平降低，且低于模型組（P＜0.05）。詳見表5、表6。

2.4 各組Nrf2、CD36蛋白含量比較

與假手術(shù)組比較，造模后3 d模型組及干預(yù)組Nrf2、CD36蛋白含量均增加；與造模后3 d比較，治療結(jié)束后干預(yù)組Nrf2、CD36蛋白含量均降低。詳見圖1、圖2。

2.5 各組Nrf2、CD36 mRNA相對表達(dá)量比較

與假手術(shù)組比較，造模后3 d模型組及干預(yù)組Nrf2、CD36 mRNA相對表達(dá)量均上升（P＜0.05）；與造模后3 d比較，治療結(jié)束后干預(yù)組Nrf2、CD36 mRNA相對表達(dá)量降低，且低于模型組（P＜0.05）。詳見表7、表8。

3 討 論

有研究顯示，腦血腫清除情況是影響腦出血病人預(yù)后及生存率的關(guān)鍵因素［10］。腦出血發(fā)生數(shù)小時后，血塊回縮、靜水壓下降、血漿大量滲出造成血管源性水腫，血塊及血小板聚集導(dǎo)致腦血腫周圍血管堵塞，腦組織暫時性缺血；隨著炎癥反應(yīng)及凝血酶原被激活引發(fā)的細(xì)胞毒性水腫，血腦屏障被破壞、腦組織代謝活性降低，腦血腫周圍微血管及管周星形膠質(zhì)細(xì)胞受損，腦血流量明顯降低，腦組織缺血缺氧嚴(yán)重［11-12］；最終紅細(xì)胞溶解破壞并釋放亞鐵血紅素、NO、鐵離子等物質(zhì)，破壞血腦屏障，引發(fā)延遲性腦水腫并加重神經(jīng)元損傷［13］。本研究結(jié)果顯示，大鼠造模后3 d模型組、干預(yù)組與假手術(shù)組比較，腦組織液中Hb及NO水平呈高表達(dá)，腦血腫周圍微血管直徑及微血管密度指數(shù)下降，患側(cè)肢體無力、不能自發(fā)運(yùn)動，神經(jīng)行為功能嚴(yán)重異常。目前腦出血病人早期采用介入治療，通過清除腦血腫、降壓及補(bǔ)體支持，降低腦血腫造成的持續(xù)性影響。上述治療均未有效改善病人預(yù)后情況［14］。

相關(guān)研究指出，腦出血后腦組織可自發(fā)吸收和清除腦血腫內(nèi)容物，緩解機(jī)械性壓迫，限制炎癥反應(yīng)并促進(jìn)神經(jīng)元恢復(fù)［15］。大腦小膠質(zhì)細(xì)胞和血源性巨噬細(xì)胞是介導(dǎo)腦血腫清除的第一道防線，CD36是廣泛認(rèn)可的、整合巨噬細(xì)胞細(xì)胞膜蛋白和Ⅱ型清道夫受體［16］。腦血管破裂后，病灶周圍的小膠質(zhì)細(xì)胞和外周巨噬細(xì)胞大量富集，一些缺乏吞噬能力的小膠質(zhì)細(xì)胞通過CD36的轉(zhuǎn)染獲得吞噬功能［17］。PPARγ是激素受體超家族的一員，參與糖脂代謝、炎癥及免疫反應(yīng)等多種生物學(xué)過程，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著重要的作用［18］。體外實(shí)驗(yàn)表示，PPARγ及其激動劑通過上調(diào)CD36表達(dá)，增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的紅細(xì)胞吞噬作用，減輕炎癥反應(yīng)及氧化損傷，減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［19］。Nrf2是一種多效性的轉(zhuǎn)錄因子，通過核轉(zhuǎn)位干擾血紅素誘導(dǎo)血紅素加氧酶1蛋白活性，上調(diào)CD36等相關(guān)蛋白表達(dá)，減少紅細(xì)胞斑塊形成，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬作用；調(diào)控白細(xì)胞介素-10表達(dá)升高，抑制氧化應(yīng)激，減少血紅蛋白-血紅素-游離鐵的積累及自由基的生成，上調(diào)CD36表達(dá)量，增強(qiáng)腦組織腦血腫的清除功能［20］。本研究結(jié)果顯示，造模后3 d大鼠腦組織中Nrf2及CD36表達(dá)水平上升（與假手術(shù)組比較），表明腦血管破裂后機(jī)體激發(fā)自身腦血腫清除系統(tǒng)，但未進(jìn)行治療的模型組在干預(yù)組治療結(jié)束后發(fā)現(xiàn)，大鼠腦組織中Nrf2及CD36水平及神經(jīng)功能與造模后3 d比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。該結(jié)果提示機(jī)體自身清除過程緩慢，神經(jīng)功能可能在長時間腦血腫毒性影響下無法完全恢復(fù)。本研究對干預(yù)組進(jìn)行頭穴透刺治療，通過刺“百會”透“太陽”，一針跨越多個穴位和多條經(jīng)絡(luò)，通過電流的強(qiáng)烈刺激，改善腦部相應(yīng)區(qū)域的微循環(huán)并加快腦血腫吸收。同時本研究結(jié)果還顯示，與造模后3 d比較，干預(yù)組大鼠腦組織液Hb及NO水平均降低，腦組織Nrf2、CD36蛋白及 mRNA均呈高表達(dá)，血腫周圍微血管直徑及微血管密度指數(shù)升高。雖然治療后大鼠神經(jīng)功能評分仍低于假手術(shù)組，腦組織液中Hb及NO水平也略高于假手術(shù)組，與模型組比較各指標(biāo)均表現(xiàn)更佳。

綜上所述，頭穴透刺可促進(jìn)腦出血大鼠腦組織Nrf2、CD36蛋白及 mRNA表達(dá)，降低腦組織Hb及NO水平，改善血腫周圍微血管血流狀態(tài)，對腦血腫的清除具有促進(jìn)作用。

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（收稿日期：2022-07-05）

（本文編輯薛妮）