Sfrp-1通過下調(diào)Wnt信號對血管緊張素Ⅱ相關心肌損傷的影響

嚴憲才 李亮 吳志光 劉錦文 馮勁立 楊宇琦 周耀輝

摘要：目的 觀察分泌型卷曲相關蛋白1（Sfrp1）調(diào)控無翼相關整合位點（Wnt）信號通路對血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導的體外心肌細胞損傷的影響。方法：體外培養(yǎng)大鼠心肌細胞H9c2，設置空白對照組（control組）、9型腺相關病毒載體組（aav9-Sfrp1組）和無Sfrp1基因組（aav9-NC組）；control組僅進行常規(guī)培養(yǎng)，aav9-Sfrp1組和aav9-NC細胞分別轉(zhuǎn)染aav9-Sfrp1和aav9-NC后，使用AngⅡ誘導心肌肥大模型。采用細胞計數(shù)試劑盒-8檢測細胞活性，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，免疫熒光對心肌細胞內(nèi)LC3進行染色，蛋白免疫印跡法檢測自噬相關蛋白（Sfrp1、p62、atg5、Beclin1、LC3）和Wnt/β-catenin通路相關蛋白（β-catenin、Dvl-1、Wisp1）表達。結(jié)果：aav9-Sfrp1組Sfrp1 mRNA表達水平高于aav9-NC組（P＜0.01）。aav9-NC組細胞存活率低于control組，aav9-Sfrp1組細胞存活率高于aav9-NC組（P＜0.01）。aav9-NC組細胞凋亡率高于control組，aav9-Sfrp1組細胞凋亡率低于aav9-NC組（P＜0.01）。aav9-NC組LC3熒光染色強度低于control組，aav9-Sfrp1組LC3熒光染色強度高于aav9-NC組。aav9-NC組p62、LC3Ⅰ/Ⅱ表達高于control組，atg5、Beclin1表達低于control組（P＜0.05）；aav9-Sfrp1組p62、LC3Ⅰ/Ⅱ表達低于aav9-NC組，atg5、Beclin1表達高于aav9-NC組（P＜0.01）。aav9-NC組β-catenin、Dvl-1和Wisp1表達高于control組（P＜0.001），aav9-Sfrp1組β-catenin、Dvl-1和Wisp1表達低于aav9-NC組（P＜0.001）。結(jié)論：Sfrp1通過抑制Wnt/β-catenin信號通路，誘導細胞自噬，減輕心肌肥大，發(fā)揮保護心肌損傷的作用。

關鍵詞 心肌肥大；心肌損傷；分泌型卷曲相關蛋白1；Wnt/β-catenin信號通路；細胞自噬；血管緊張素Ⅱ；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.05.007

Effect of Sfrp-1 on Angiotensin Ⅱ-related Myocardial Injury by Down-regulating Wnt Signaling

YAN Xiancai， LI Liang， WU Zhiguang， LIU Jinwen， FENG Jinli， YANG Yuqi， ZHOU Yaohui

Zhongshan Hospital of Traditional Chinese Medicine of Guangzhou University of Chinese Medicine， Zhongshan 528400， Guangdong， China， E-mail： yanvec210@yeah.net

Abstract Objective：To observe the effect of secreted frizzled related protein-1（Sfrp1） regulating wingless-related MMTV integration site （Wnt） on angiotensin Ⅱ（AngⅡ）-induced cardiomyocyte injury in vitro.Methods：Rat cardiomyocytes H9c2 were cultured in vitro，and blank control group（control group），type 9 adeno-associated virus vector group（aav9-Sfrp1 group） and non-Sfrp1 gene group（aav9-NC group） were set up.The control group was only cultured routinely，aav9-Sfrp1 group and aav9-NC cells were respectively transfected with aav9-Sfrp1 and aav9-NC cells，and the myocardial hypertrophy model was induced by AngⅡ.Cell activity was detected by cell counting kit 8，cell apoptosis was detected by flow cytometry，LC3 in cardiomyocytes was stained by immunofluorescence.The expression of autophagy associated proteins（Sfrp1，p62，atg5，Beclin1，LC3） and Wnt/β-catenin pathway-associated proteins（β-catenin，Dvl-1，Wisp1） were detected by protein imprinting.Results：The mRNA expression level of Sfrp1 in aav9-Sfrp1 group was higher than that in aav9-NC group（P＜0.01）.The cell survival rate of aav9-NC group was lower than that of control group，and that of aav9-Sfrp1 group was higher than that of aav9-NC group（P＜0.01）.The apoptosis rate of aav9-NC group was higher than that of control group，and that of aav9-Sfrp1 group was lower than that of aav9-NC group（P＜0.01）.The LC3 fluorescence staining intensity of aav9-NC group was lower than that of control group，and the LC3 fluorescence staining intensity of aav9-Sfrp1 group was higher than that of aav9-NC group.The expressions of p62，LC3Ⅰ/Ⅱ in aav9-NC group were higher than those in control group，while the expressions of atg5，Beclin1 in AAV9-NC group were lower than those in control group（P＜0.05）.The expressions of p62，LC3Ⅰ/Ⅱ in aav9-Sfrp1 group were lower than those in aav9-NC group，and the expressions of atg5，Beclin1 in aav9-NC group were higher than those in AAV9-NC group（P＜0.01）.The expressions of β-catenin，Dvl-1 and Wisp1 in aav9-NC group were higher than those in control group（P＜0.001），and the expressions of β-catenin，Dvl-1 and Wisp1 in aav9-Sfrp1 group were lower than those in aav9-NC group（P＜0.001）.Conclusion：Sfrp1 could induce the cell autophagy，alleviate myocardial hypertrophy，and protect myocardium injury by inhibiting the expression of Wnt/β-catenin signaling pathway.

Keywords myocardial hypertrophy; myocardial injury; secreted frizzled related protein 1; Wnt/β-catenin signaling pathway; autophagy; angiotensin Ⅱ; experimental study

基金項目 中山市科學技術(shù)局2021年第一批社會公益（醫(yī)療衛(wèi)生一般項目）（No.2021B1057）

作者單位 廣州中醫(yī)藥大學附屬中山中醫(yī)院（廣東中山? 528400），E-mail：yanvec210@yeah.net

引用信息 嚴憲才，李亮，吳志光，等.Sfrp-1通過下調(diào)Wnt信號對血管緊張素Ⅱ相關心肌損傷的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（5）：811-816.

急性心肌梗死是致死率極高的心血管疾病之一，是由冠狀動脈急性阻塞、心肌缺血壞死引起的，多發(fā)生于45歲以上的中老年人群，若不及時治療，可使心臟結(jié)構(gòu)和功能受損，進而發(fā)展為急性心力衰竭，在短時間內(nèi)導致死亡［1］，嚴重威脅病人生命安全?，F(xiàn)階段臨床多通過再灌注方式進行治療，可能發(fā)生缺血再灌注損傷，影響治療效果及預后［2］。心肌細胞凋亡是心肌重塑的重要標志，清除凋亡的細胞是治療心力衰竭的重要過程［3］。隨著分子技術(shù)的不斷發(fā)展，細胞凋亡和自噬證實參與了心肌損傷過程，與細胞損傷修復和心功能保護作用有關［4］。無翼相關整合位點（wingless-related MMTV integration site，Wnt）信號通路與心血管疾病有關，參與心肌細胞肥大、主動脈狹窄、動脈粥樣硬化等心臟生理病理改變［5］。分泌型卷曲相關蛋白1（secreted frizzled related protein 1，Sfrp1）與Wnt配體競爭性結(jié)合負調(diào)控Wnt信號通路，與心肌梗死等多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關［6］。既往研究報道，Sfrp1具有較強的促血管新生作用，過表達Sfrp1的骨髓干細胞可抑制心肌梗死區(qū)中性粒細胞浸潤，拮抗炎癥反應，從而抑制心肌缺血損傷［7］?；诖耍狙芯坎捎醚芫o張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）體外誘導大鼠H9c2細胞構(gòu)建心肌肥大模型，將9型腺相關病毒轉(zhuǎn)染Sfrp-1至H9c2細胞中，探討Sfrp-1調(diào)控Wnt信號通路影響細胞自噬對心肌損傷的影響，為臨床治療心肌肥厚、心肌損傷和心力衰竭提供實驗依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大鼠心肌細胞系H9c2購自中國科學院上海細胞庫，將H9c2細胞置于含10%胎牛血清和青霉素鏈霉素混合物的改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每日更換新的培養(yǎng)液，當細胞密度達到80%～90%時，以0.25%胰蛋白酶對細胞進行消化后傳代。設置空白對照組（control組）、9型腺相關病毒載體組（aav9-Sfrp1組）和無Sfrp1基因組（aav9-NC組），control組僅進行常規(guī)培養(yǎng)，aav9-Sfrp1組和aav9-NC組按相關操作構(gòu)建心肌肥大模型。

1.2 心肌肥大模型的建立

取培養(yǎng)后的對數(shù)生長期大鼠H9c2細胞接種于6孔板中，設置每孔細胞密度為5×105個，分別以重組9型腺相關病毒載體（aav9-Sfrp1）、無Sfrp1基因（aav9-NC）轉(zhuǎn)染H9c2細胞，轉(zhuǎn)染復數(shù)為6×105（v.g.）/細胞。將病毒液完整覆蓋于培養(yǎng)基中的細胞表面，保持37 ℃、5%CO2條件，每隔30 min搖晃培養(yǎng)基，使病毒充分接觸細胞。轉(zhuǎn)染5 d后，以10－6 mmol/L AngⅡ刺激H9c2細胞48 h，誘導心肌肥大模型。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative reverse transcription，qRT-PCR）檢測H9c2細胞內(nèi)Sfrp1 mRNA表達

采用TRIzol試劑提取H9c2細胞內(nèi)的總RNA，之后用PrimeScriptTMRT試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用SYBR GreenPCR試劑進行顯色，ABI7500FAST Real-Time PCR儀進行qRT-PCR。采用2－△△Ct方法評估，以GAPDH作為標準化內(nèi)參校正后Sfrp1 mRNA表達水平。Sfrp1正向引物：5′-ATGCAGTTCTTCGGCTTCTACT-3′；反向引物：5′-CAGCTTCTTCAGCTCCTTCTTC-3′。

1.4 細胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK8）檢測細胞活力

采用CCK8（上海語純生物科技有限公司）檢測各組心肌細胞H9c2的細胞活力，將細胞按每孔1×105個密度接種于96孔板中培養(yǎng)48 h，加入CCK8溶液再次培養(yǎng)2 h，嚴格按照說明書進行操作，采用酶標儀檢測波長450 nm處各組細胞的吸光度值。計算細胞活力，細胞存活率（%）＝（試驗井平均吸光度）/（對照井平均吸光度）×100%。

1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

將各組細胞重懸于緩沖區(qū)中，加入膜聯(lián)蛋白V（Annexin V-FITC）試劑（上海博湖生物科技有限公司）和碘化丙啶（PI）染液（上海如吉生物科技發(fā)展有限公司），避光孵育15 min后，采用流式細胞儀（上海三崴醫(yī)療設備有限公司）按照試劑盒說明書分析細胞凋亡情況。

1.6 蛋白免疫印跡法檢測蛋白表達

將各組細胞加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的細胞溶解液中，收集細胞提取物，4 ℃條件下離心15 min，二喹啉甲酸（BCA）蛋白測定試劑盒（福州奧研實驗器材有限責任公司）檢測蛋白濃度，凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，電轉(zhuǎn)移至膜后室溫下封閉，4 ℃條件下，與一抗Sfrp1、p62、atg5、Beclin1、LC3、β-catenin、Dishevelled-1（Dvl-1）、WNT1誘導信號通道蛋白1（Wnt1-inducible signaling pathway protein 1，Wisp1）、β-actin（上海艾博抗貿(mào)易有限公司）孵育過夜，室溫下與辣根過氧化物酶標記的二抗孵育1 min，采用電化學發(fā)光（ECL）試劑（廣州濟恒醫(yī)藥科技有限公司）顯影，Image J軟件進行蛋白定量分析。

1.7 免疫熒光分析

將上述處理的各組細胞室溫下用4%多聚甲醛固定30 min，用0.4%Triton X-100滲透1 h，37 ℃下以山羊血清阻斷1 h，與LC3一抗（上海艾博抗貿(mào)易有限公司）和硫氰酸熒光素標記的IgG二抗連續(xù)培養(yǎng)，奧林巴斯ckx53熒光顯微鏡（上海迪圖生物科技有限公司）觀察細胞免疫熒光情況。

1.8 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本 t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組Sfrp1 mRNA表達水平比較

aav9-Sfrp1組Sfrp1 mRNA表達水平高于aav9-NC組（P＜0.05）。提示轉(zhuǎn)染成功。詳見表1、圖1。

2.2 各組細胞存活率比較

aav9-NC組細胞存活率低于control組，aav9-Sfrp1組高于aav9-NC組（P＜0.01）。詳見表2、圖2。

2.3 各組細胞凋亡率比較

aav9-NC組細胞凋亡率高于control組，aav9-Sfrp1組低于aav9-NC組（P＜0.01）。詳見表3、圖3及圖4。

2.4 各組細胞免疫熒光強度比較

aav9-NC組LC3熒光染色強度低于control組，aav9-Sfrp1組LC3熒光染色強度高于aav9-NC組。詳見圖5。

2.5 各組細胞自噬相關蛋白表達比較

aav9-NC組p62、LC3Ⅰ/Ⅱ表達高于control組，atg5、Beclin1表達低于control組（P＜0.05）；aav9-Sfrp1組p62、LC3Ⅰ/Ⅱ表達低于aav9-NC組，atg5、Beclin1表達高于aav9-NC組（P＜0.01）。詳見表4、圖6。

2.6 各組細胞內(nèi)Wnt/β-catenin通路表達比較

aav9-NC組β-catenin、Dvl-1和Wisp1表達高于control組（P＜0.001），aav9-Sfrp1組β-catenin、Dvl-1和Wisp1表達低于aav9-NC組（P＜0.001）。提示Sfrp1可抑制Wnt/β-catenin通路活化。詳見表5、圖7。

3 討 論

心力衰竭是心肌肥大等心肌損傷疾病的終末期表現(xiàn)，從分子角度分析，細胞凋亡與心肌肥大等心肌損傷密切相關，清除凋亡細胞是心肌肥大水平治療的重要靶點［8］。AngⅡ是腎素-血管緊張素-醛固酮誘導心肌肥大和心肌細胞凋亡的效應肽，是誘導心肌肥大損傷模型的常用方式，通過刺激細胞間的分子轉(zhuǎn)導、信號通路失活及活化，誘導心肌細胞表型改變［9］。本研究采用AngⅡ誘導大鼠H9c2心肌細胞建立心肌肥大模型，轉(zhuǎn)染aav9-Sfrp1，探討Sfrp1調(diào)控Wnt/β-catenin通路對心肌細胞損傷的影響。

Sfrp1基因是Sfrp分泌糖蛋白家族的一員，在宮頸癌、乳腺癌和非小細胞肺癌等多種腫瘤組織中基因表達缺失［10］，通過調(diào)控DNA甲基化和microRNA轉(zhuǎn)錄導致基因表觀遺傳沉默，抑制細胞增殖、遷移和侵襲，發(fā)揮顯著的抑癌作用［11］。有研究顯示，Sfrp1在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，可保護因心肌梗死等造成的心臟損傷［12］。Sklepkiewicz等［13］研究顯示，Sfrp1基因敲除小鼠隨著年齡增長，心功能逐漸惡化，心肌纖維化水平加劇，可觀察到明顯的擴張型心肌病特征。本研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染Sfrp1可顯著增強AngⅡ誘導的體外心肌細胞增殖活性，抑制細胞凋亡，誘導細胞自噬，發(fā)揮顯著的保護心肌損傷作用。與Pan等［14］研究結(jié)果一致。Sfrp1對心肌細胞的調(diào)控作用可能通過影響Wnt/β-catenin信號通路實現(xiàn)的，Sfrp1是Wnt/β-catenin通路的重要抑制劑，Sfrp1通過抑制Wnt/β-catenin通路的活化，抑制α平滑肌肌動蛋白水平、膠原合成能力及心肌纖維化，促進成纖維細胞的激活［15］，進而促進正常心肌細胞存活，增強細胞活性，抑制細胞凋亡并影響自噬。

細胞自噬不同于凋亡的代謝過程，通過將細胞質(zhì)中的物質(zhì)傳送至溶酶體中進行動態(tài)分解，清除受損、破裂及癌變的細胞，維持正常細胞和組織的穩(wěn)態(tài)平衡。p62、Beclin1、atg5和LC3是細胞自噬的重要標志物［16］。LC3是由LC3Ⅰ和LC3Ⅱ組成的自噬相關蛋白，細胞自噬發(fā)生時，p62表達下調(diào)，Beclin1、atg5表達上調(diào)，LC3Ⅰ與磷脂酰乙醇胺結(jié)合轉(zhuǎn)化為LC3Ⅱ。Wnt/β-catenin通路是調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、細胞生長、發(fā)育及分化的重要信號通路，與心肌肥大、心力衰竭等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展有關［17］。有研究顯示，Wnt/β-catenin不僅與細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡過程有關，還可激活下游效應分子Dvl-1、Wisp1，參與細胞自噬過程［18］。本研究結(jié)果顯示，Wnt/β-catenin通路被Sfrp1基因抑制，誘導細胞自噬，促進心肌細胞存活，增強細胞活性，抑制細胞凋亡，在AngⅡ誘導的心肌肥大細胞模型中發(fā)揮著保護作用。Tao等［19］研究顯示，Wnt/β-catenin通路是老年小鼠心肌梗死的重要靶點，Sfrp1可靶向抑制Wnt/β-catenin通路活化，有效降低心肌纖維化程度，抑制心肌細胞凋亡，改善老年小鼠的心功能，保護心臟免受急性心肌梗死損傷。分析原因，可能與Wnt/β-catenin通路的生物特性有關，Sfrp1與Wnt的配體競爭性結(jié)合，導致Wnt/β-catenin通路的信號轉(zhuǎn)導和活化被抑制，下游效應分子Dvl-1、Wisp1的表達顯著下調(diào)，失活的Wnt/β-catenin通路可抑制血管內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞的增殖，增強心肌細胞活性，并通過線粒體凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及死亡受體等途徑抑制細胞凋亡［20］，誘導細胞自噬，從而緩解心肌細胞損傷。

綜上所述，Sfrp1通過使Wnt/β-catenin信號通路失活，降低了大鼠心肌細胞H9c2的體外凋亡，促進正常心肌細胞存活，增強細胞活性，誘導細胞自噬，從而發(fā)揮保護心肌細胞免受AngⅡ刺激引起的損傷。本研究揭示了Wnt/β-catenin通路在心肌損傷中的重要作用，并提出Sfrp1基因是保護心肌細胞免受AngⅡ誘導造成損傷的關鍵分子，為心肌梗死等心血管疾病的治療提供了新的分子靶點和治療策略。本研究存在一定的局限性，未驗證Sfrp1調(diào)控Wnt/β-catenin通路是否發(fā)揮同樣效應，今后需深入探索。

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（收稿日期：2022-06-22）

（本文編輯薛妮）