地黃氧-?；D(zhuǎn)移酶WSD基因的鑒定與表達(dá)分析

摘 要：植物蠟酯合成酶催化長鏈醇和長鏈脂肪酸合成蠟酯，對植物蠟質(zhì)合成及其抗旱、抗致病菌襲擊和紫外輻射、抗寒和昆蟲侵害等環(huán)境脅迫具有非常重要的作用；鎘是環(huán)境中含量最高的有毒重金屬之一，嚴(yán)重威脅植物的生長發(fā)育、質(zhì)量、產(chǎn)量和食用安全。為研究地黃蠟酯合成酶基因鎘脅迫表達(dá)，該文從地黃全長轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中鑒定其成員，并用生物信息學(xué)技術(shù)與qRT-PCR對其編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化和保守結(jié)構(gòu)域及其組織表達(dá)與鎘脅迫表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果表明：（1）鑒定出兩個蠟酯合成酶基因RgOATWSD1與RgOATWSD2，其編碼蛋白質(zhì)的長度、理論等電點(diǎn)和相對分子量依次為463 aa與473 aa、8.86與9.34、51.31 kD與52.49 kD，均為不穩(wěn)定蛋白。（2）二者均具有acyl_WS_DGAT保守域與DUF1298超家族，前者占其氨基酸序列的92.65%～94.50%。（3）二者均定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)卷曲與α螺旋為主；RgOATWSD1為跨膜蛋白，而RgOATWSD2 不是。（4）二者均在地黃根、莖、葉中差異表達(dá)。（5）二者表達(dá)均受鎘脅迫誘導(dǎo)，但其表達(dá)變化趨勢不同。該研究鑒定了兩個鎘脅迫應(yīng)答反應(yīng)的蠟酯合成酶基因，為地黃RgOATWSD的鎘脅迫表達(dá)及功能研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：地黃，氧-?；D(zhuǎn)移酶WSD，生物信息學(xué)分析，基因表達(dá)，鎘脅迫

中圖分類號：Q943 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1000-3142（2024）02-0303-10

基金項目：河南省重點(diǎn)研發(fā)與推廣專項科技攻關(guān)項目（212102110405）；河南省自然科學(xué)基金（182300410018）；河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊支持計劃項目（23IRTSTHN022）。

第一作者：李慧敏（1997-），碩士，研究方向為植物遺傳， （E-mail）2004283157@stu.htu.edu.cn。

^*通信作者：周延清，博士，教授，研究方向為植物遺傳， （E-mail）yqzhou@htu.edu.cn。

Identification and expression analyses of O-acyltransferase WSD genes in Rehmannia glutinosa

LI Huimin， YUAN Ping， DUAN Hongying， ZHOU Yanqing^*

（ College of Life Sciences， Henan Normal University， Xinxiang 453000， Henan， China ）

Abstract： Plant wax ester synthase catalyzes the synthesis of wax esters from long-chain alcohols and fatty acids， and plays very important roles in plant wax synthesis and some resistances to drought， pathogenic bacteria， ultraviolet radiation， cold and insect invasion and other environmental stresses; cadmium （Cd） is one of the toxic heavy metals with the highest content in environment， and seriously threatens plant growth， development， quality， yield， and plant food safety. In order to explore the Cd stress expressions of wax ester synthase genes in Rehmannia glutinosa， we identified its wax ester synthase genes from its full-length transcriptome sequencing data， analyzed both physiochemical properties， phytogenetic trees and conserved domains with bioinformatics methods， and tissue expressions and Cd stress expressions using qRT-PCR. The results were as follows： （1） Two wax ester synthase genes， named as RgOATWSD1 and RgOATWSD2， were identified， whose coding proteins were unstable hydrophobic proteins with amino acid lengths of 463 aa and 473 aa， isoelectric points of" 8.86 and 9.34 and" molecular weights of 51.31 kD and 52.49 kD， respectively. （2） Both proteins contained a conserved acyl_WS_DGAT domain and" DUF1298 superfamily， in which the former accounted for 92.65% to 94.50% of the amino acid sequence. （3） Both proteins were located in the endoplasmic reticulum and both secondary structures were mainly composed of random coil and α-helix；RgOATWSD2 was not transmembrane protein but RgOATWSD1. （4） Both were differentially expressed in the roots， stems and leaves of R. glutinosa plants. （5） Both expressions were highly responsive to Cd stress， but both expression change trends were different under Cd stress. This study identifies two wax ester synthase genes in response to Cd stress， and lays a foundation for further research on Cd stress expression and other functions of RgOATWSD.

Key words： Rehmannia glutinosa， O-acyltransferase WSD， bioinformatics， gene expression， cadmium stress

隨著我國工業(yè)化與城市化進(jìn)程的加快，土壤和食品的重金屬污染問題日益加劇，其中，重金屬鎘（Cd）是其首要污染物。鎘污染土壤的治理難度很大，不但對植物生長發(fā)育、質(zhì)量和產(chǎn)量具有嚴(yán)重不良影響，而且鎘通過食物鏈從植物轉(zhuǎn)移到動物和人體內(nèi)，也會嚴(yán)重危害動物和人的健康。因此，當(dāng)前具有較高的環(huán)保和經(jīng)濟(jì)價值的土壤污染治理方法是利用自然生長植物或遺傳改良植物吸收、解毒與富集鎘污染土壤中的鎘對其進(jìn)行修復(fù)（陳思思等，2022；羅艷芳等，2022；于永昂等，2022）。迄今為止，雖然已經(jīng)鑒定了對鎘脅迫應(yīng)答的構(gòu)樹轉(zhuǎn)錄因子BpbZIP1 （陳思思等，2022）、花生NAS家族（羅艷芳等，2022）、小麥TaAlaAT基因（于永昂等，2022）、伴礦景天WRKY基因家族（王劍超等，2023）和水稻OsPT1等基因（姜南等，2023），但是還有很多植物鎘脅迫應(yīng)答反應(yīng)基因有待挖掘與功能研究，如植物蠟酯合成酶（wax ester synthase， WS or WSD）基因。

蠟酯是長鏈醇和長鏈脂肪酸在蠟酯合成酶催化下經(jīng)過酯化反應(yīng)生成的酯，廣泛存在于動物、植物和微生物，具有多種重要的生物學(xué)功能。就植物而言，蠟酯主要存在于植物初生芽表面的角質(zhì)層中或者霍霍巴的種子油中，防止植物水分流失、致病菌襲擊、紫外輻射和昆蟲侵害（肖一凡等，2020）與抗旱（肖一凡等，2020；王春語等，2023）及抗寒（朱聰?shù)龋?022）等環(huán)境脅迫。目前，從小麥（溫宏偉等，2021）、高粱（王春語等，2023）、椰子（朱聰?shù)龋?022）、擬南芥和霍霍巴（肖一凡等，2020）、絲穎針茅和紫花針茅（Yang et al.， 2020）、蕪菁（Yang et al.， 2019）、尖葉石竹（Zhou et al.， 2018）、葡萄（Nicolas et al.， 2020）、蘋果（Wang et al.， 2022）和向日葵（Shalini amp; Martin， 2020）等植物中克隆了蠟酯合成酶，但是尚未見從地黃中克隆WSD基因及其鎘脅迫表達(dá)的報道。

地黃（Rehmannia glutinosa）為玄參科地黃屬多年生草本的植物，生長在我國遼寧、內(nèi)蒙古和河南等地（周延清等，2020）。其塊根是我國著名中藥材，每年需求量較高，約1.5×10⁷ kg。在藥材上，它分為鮮地黃和生地黃、熟地黃三類。鮮地黃味道甘苦，清熱、生津、涼血與補(bǔ)血；生地黃味甘性寒，清熱滋陰；熟地黃性微溫，味道甘甜，補(bǔ)血滋陰、填髓益精（徐軍和傅喆暾，2017）。地黃種質(zhì)資源、藥理作用、化學(xué)成分、栽培育種和組學(xué)等方面研究較多，然而，地黃Cd污染及其脅迫研究很少，僅有地黃RgABCC基因Cd脅迫的報道（Zhao et al.， 2009；Yang et al.， 2021）。因此，有待深入研究地黃Cd脅迫應(yīng)答反應(yīng)基因。

本研究以地黃為研究材料，從其全長轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中查找Wax ester synthase、WS或WSD及其編碼基因（RgOATWSD），采用生物信息學(xué)、盆栽法與實時熒光定量PCR的方法，通過對其兩個基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化和保守結(jié)構(gòu)域及其組織表達(dá)與鎘脅迫表達(dá)進(jìn)行分析，擬探討以下問題：（1）地黃中是否有蠟酯合成酶基因；（2）地黃蠟酯合成酶基因大小及其編碼蛋白質(zhì)的特征如何；（3）地黃蠟酯合成酶基因空間表達(dá)模式及其鎘脅迫表達(dá)如何。

1 材料與方法

1.1 材料

地黃“金九”品種全長轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA780233）的基因注釋表與CDS表；河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院氣候室中培養(yǎng)的盆栽“金九”地黃植株。其光照周期為每天16 h光，8 h暗，培養(yǎng)溫度為（26±2）℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx。

1.2 方法

1.2.1 氧-?；D(zhuǎn)移酶WSD基因家族成員獲取 打開上述基因注釋表文件，點(diǎn)擊查找，輸入Wax ester synthase、WS或WSD，點(diǎn)擊全部查找，出現(xiàn)目標(biāo)酶及其對應(yīng)的基因名。利用其基因名在上述CDS表中查找其基因及其大小與堿基序列，命名為RgOATWSD基因。

1.2.2 RgOATWSD基因的生物信息學(xué)分析 利用NCBI （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/home/analyze/）中的ORF Finder進(jìn)行氨基酸序列的推導(dǎo)，并利用Blastn工具查找與RgOATWSD蛋白同源性較高的序列；運(yùn)用軟件DNAMAN 6.0進(jìn)行氨基酸的多重序列比對；利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用ExPASy-ProtParm在線分析軟件（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測RgOATWSD蛋白的理化性質(zhì)；通過在線網(wǎng)址WoLF PSORT （https：//wolfpsort.hgc.jp/）對RgOATWSD蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測；利用TMHMM 2.0進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域的分析；通過NCBI的Conserved Donmain Search （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/cdd/wrpsb.cgi）對其保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行在線分析；利用SignalP （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進(jìn)行信號肽預(yù)測；利用NetNGlyc 1.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）進(jìn)行N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測；利用NetPhos 2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/ NetPhos/）進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測；通過SOPMA （https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？ page=npsa_sopma.html）及SWISS-MODEL （https：// swissmodel.expasy.org/）預(yù)測蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)。

1.2.3 鎘處理地黃幼苗的培養(yǎng)和處理 將地黃新鮮塊根切成2～3 cm小塊，種于花盆基質(zhì)（營養(yǎng)土與蛭石比例為1∶1.5）中，在氣候室培養(yǎng)；2～3 d澆1次水，生長4周后，挑取長勢一致的幼苗進(jìn)行處理；用40 mmol·L^-1鎘水溶液澆地黃幼苗（CT），用同樣體積的水澆同樣數(shù)量的地黃幼苗（CK），兩組均設(shè)置3個重復(fù)；處理12 h后，分別取CT與CK的根、莖和葉，洗凈，晾干，液氮速凍，于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆茫ㄔ迹?023）。

1.2.4 qRT-PCR技術(shù)檢測基因表達(dá) 根據(jù)RgOATWSD1與RgOATWSD2基因的堿基序列，用Primer Premier 5設(shè)計其qRT-PCR的引物：（1） RgOATWSD1基因的正向引物為F（5′-AGCGAGTTGTTGCTGATGC-3′），反向引物為R（5′-GTTGCCCCACTGACTTCCA-3′）。（2） RgOATWSD2基因的正向引物為F（5′-TGATAAGTCGCCGATTAGGTC-3′），反向引物R（5′-CTTTTGATGGTTCGATGTGCT-3′）。這些引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；按照我們前期研究中提取地黃的總RNA方法與qRT-PCR技術(shù)，以地黃基因TIP41為內(nèi)參基因，用qRT-PCR檢測兩基因在CT與CK的根、莖、葉中的表達(dá)水平，用2^-ΔΔCt法計算其表達(dá)量（Li et al.， 2022）。

2 結(jié)果與分析

2.1 RgOATWSD基因家族的鑒定

在上述基因注釋結(jié)果表中查到Wax ester synthase-like Acyl-CoA acyltransferase domain或O-acyltransferase WSD1 （Arabidopsis thaliana）與O-acyltransferase WSD1-like isoform X2" ［Sesamum indicum］，以及基因F01_transcript_13342和F01_transcript_16419，在CDS表中查到兩個基因大小分別為1 392 bp和1 422 bp，其堿基序列如圖1所示，并將其分別命名為RgOATWSD1和RgOATWSD2，統(tǒng)稱RgOATWSD基因。

2.2 RgOATWSD氨基酸序列的推導(dǎo)、同源性比對以及系統(tǒng)進(jìn)化分析

根據(jù)RgOATWSD1和RgOATWSD2基因序列，利用軟件DNAMAN 6.0推導(dǎo)出其分別編碼由463和473氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，并將其分別命名為RgOATWSD1和RgOATWSD2 （圖1），統(tǒng)稱RgOATWSD蛋白。

利用DNAMAN 6.0進(jìn)行氨基酸多重序列比對，比對結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，RgOATWSD1與白花泡桐 ［Paulownia fortunei （KAI3448120.1）］、*表示終止密碼。方框中密碼子為起始密碼子。芝麻 ［Sesamum indicum （XP_011092557.1）］、紫花風(fēng)鈴木 ［Handroanthus impetiginosus （PIM99635.1）］的相似度較高，分別為87.79%、83.62%、82.51%；RgOATWSD2與白花泡桐（KAI3457227.1）、芝麻（XP_011100361.1）、松蒿 ［Phtheirospermum japonicum （GFP86401.1）］的相似度較高，分別為83.01%、78.69%、77.73%。利用MEGA 6.0進(jìn)行OATWSD蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，RgOATWSD1與白花泡桐聚為一支，進(jìn)化上親緣關(guān)系最近，RgOATWSD2與松蒿聚為一支，進(jìn)化上親緣關(guān)系最近，其中白花泡桐與松蒿均屬于玄參科。

2.3 RgOATWSD理化學(xué)性質(zhì)

利用ExPASy-ProtParam tool在線工具對RgOATWSD進(jìn)行化學(xué)性質(zhì)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RgOATWSD1由463個氨基酸殘基組成，包括20種氨基酸，其中Ala、Leu和Ser含量高，分別為8.4%、11.0%和8.2%，相對分子質(zhì)量為51. 31 kD，化學(xué)分子式為C₂₂₈₃H₃₆₉₃N₆₃₉O₆₄₉S₂₆，帶負(fù)電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu） 50個與帶正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys） 57個，理論等電點(diǎn)為8.86，該蛋白不穩(wěn)定指數(shù)預(yù)測結(jié)果是45.19，為不穩(wěn)定蛋白，脂肪指數(shù)為102.76，總的親水性平均系數(shù)為0.049，屬于疏水性蛋白；RgOATWSD2由473個氨基酸殘基組成，包括20種氨基酸，其中Leu、Lys和Ser含量多，分別為11.6%、7.6%和7.6%，相對分子質(zhì)量為52.49 kD，化學(xué)分子式為C₂₃₅₃H₃₇₉₁N₆₂₉O₆₇₉S₂₃，帶負(fù)電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu） 44個與帶正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys） 57個，理論等電點(diǎn)為9.34，該蛋白不穩(wěn)定指數(shù)預(yù)測結(jié)果是42.93，為不穩(wěn)定蛋白，脂肪指數(shù)為92.96，總的親水性平均系數(shù)為-0.140，屬于親水性蛋白。

利用NetPhos 2.0工具對RgOATWSD1與RgOATWSD2編碼的氨基酸序列進(jìn)行在線分析，結(jié)果表明分值大于0.5的各類磷酸化位點(diǎn)分別有42個和44個，并均勻分布在多肽鏈中。其中，RgOATWSD1絲氨酸磷酸化位點(diǎn)有37個，蘇氨酸的磷酸化位點(diǎn)有18個，酪氨酸磷酸化位點(diǎn)有7個；RgOATWSD2絲氨酸磷酸化位點(diǎn)有36個，蘇氨酸的磷酸化位點(diǎn)有31個，酪氨酸磷酸化位點(diǎn)有12個。利用NetNGlyc 1.0工具對RgOATWSD1與RgOATWSD2編碼氨基酸序列進(jìn)行在線分析，發(fā)現(xiàn)二者均無N-糖基化位點(diǎn)。

應(yīng)用TMHMM 2.0工具對RgOATWSD1編碼的氨基酸序列進(jìn)行在線分析，結(jié)果顯示該蛋白為單次跨膜蛋白，包括1～184位氨基酸在膜內(nèi)、185～207位氨基酸為跨膜區(qū)域、208～463位氨基酸定位在膜外。RgOATWSD2全部定位在膜外，不具有跨膜結(jié)構(gòu)域。

利用SignalP-4.1工具對編碼氨基酸序列進(jìn)行在線分析，結(jié)果表明RgOATWSD1和RgOATWSD2蛋白的信號肽無峰值出現(xiàn)，說明地黃OATWSD蛋白不存在信號肽，也說明該蛋白不屬于分泌型蛋白。利用WoLF PSORT工具對編碼氨基酸序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果表明RgOATWSD1和RgOATWSD2蛋白均可能存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。應(yīng)用SOPMA對RgOATWSD1和RgOATWSD2蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RgOATWSD1由39.96%的α螺旋、39.09%的無規(guī)卷曲、17.71%的延伸鏈和3.24%的β轉(zhuǎn)角共4種結(jié)構(gòu)元件組成，其中α螺旋比例最大；RgOATWSD2由39.32%的α螺旋、41.01%的無規(guī)卷曲、16.49%的延伸鏈和3.17%的β轉(zhuǎn)角共4種結(jié)構(gòu)元件組成，其中無規(guī)卷曲的比例最大（圖4）。

2.4 RgOATWSD保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

利用NCBI的Conserved Donmain Search進(jìn)行在線分析，發(fā)現(xiàn)RgOATWSD1與RgOATWSD2均具有acyl_WS_DGAT保守域與DUF1298超家族，前者分別覆蓋RgOATWSD1氨基酸序列的92.65%和RgOATWSD2氨基酸序列的94.50%。該家族是一種酰基轉(zhuǎn)移酶家族，類似WS二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶（WS/DGAT）和甘油單酰基轉(zhuǎn)移酶（MGAT）等，具有類似二?；视王；D(zhuǎn)移酶和甘油單?；D(zhuǎn)移酶相似的活性，后者在其中分別占7.35%與5.50%，功能未知（圖5）。

2.5 RgOATWSD三級結(jié)構(gòu)分析

應(yīng)用SWISS-MODEL對兩種蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)其中包含的二級結(jié)構(gòu)元件與上述二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果相吻合（圖4），而RgOATWSD1與RgOATWSD2的三級結(jié)構(gòu)形態(tài)有些不同，RgOATWSD1比較像球形（圖6）。

2.6 鎘對RgOATWSD基因在地黃不同組織部位表達(dá)的影響

qRT-PCR結(jié)果表明，RgOATWSD1與RgOATWSD2在CT和CK的根、莖和葉組織中均有表達(dá)，其中，RgOATWSD1在幼苗葉中的表達(dá)量最高，RgOATWSD2在幼苗根的表達(dá)量最高。由圖7可知，在鎘脅迫處理下，RgOATWSD1與RgOATWSD2基因在地黃根、莖和葉組織中都表達(dá)，但其表達(dá)水平均與對照組的表達(dá)水平有明顯變化且二者的變化相反，RgOATWSD1在根、莖與葉中的表達(dá)均上調(diào)，根部的變化最為明顯，RgOATWSD2在根、莖與葉中的表達(dá)均下調(diào)，莖部的變化最為明顯。以上結(jié)果表明，2個基因?qū)Φ攸S鎘脅迫響應(yīng)具有一定的差異表達(dá)。

3 討論與結(jié)論

植物脂肪酸代謝途徑主要有?；€原途徑與脫羰基化途徑，前者產(chǎn)生蠟酯，蠟酯在生成過程中雖然需要醛類中間體，但并不釋放出來；后者形成烷烴、醛、酮與仲醇。目前，霍霍巴和擬南芥等植物的WS或者WSD1已經(jīng)被報道，但地黃WSD未見報道。本研究從地黃全長轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中鑒定出兩個蠟酯合成酶基因RgOATWSD1與RgOATWSD2，與其他已知植物蠟酯合成酶基因同源性高，具有蠟酯合成酶基因的功能（Kunst amp; Samuels， 2009）且發(fā)現(xiàn)RgOATWSD1 和RgOATWSD2都定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，與擬南芥WSD1定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)果一致，以及發(fā)現(xiàn)RgOATWSD1與霍霍巴的WS一樣具有跨膜區(qū)域和疏水性（肖一凡等，2020）。RgOATWSD在地黃根、莖與葉組織的空間表達(dá)分析表明，RgOATWSD1與RgOATWSD2在根、莖與葉組織中均有不同程度的表達(dá)，而且在地黃莖與葉中表達(dá)的結(jié)果與擬南芥WSD1基因在莖與葉中表達(dá)的結(jié)果一致（Patwari et al.， 2019）。上述發(fā)現(xiàn)表明，RgOATWSD具有其他植物物種中已知蠟酯合成酶基因相似的結(jié)構(gòu)特征與空間表達(dá)特性。

植物表皮蠟質(zhì)是植物與環(huán)境之間的保護(hù)屏障，能夠保護(hù)植物免受干旱、鹽、冷、紫外線、病原菌和昆蟲等的侵害。例如，植物表皮蠟酯的積累和生物合成與植物的抗旱性反應(yīng)密切相關(guān)（Seo et al.， 2011; Patwari et al.， 2019），植物角質(zhì)層蠟酯的積累有助于抗旱性的提高；擬南芥AtWSD1參與了干旱期間蠟酯的積累，干旱期間葉片和莖中蠟酯的積累增加，說明該基因在擬南芥莖和葉組織中的蠟酯合成中起著關(guān)鍵作用（Patwari et al.， 2019）；蘋果MdWSD1基因通過調(diào)控酯類和醇類的合成，影響表皮蠟酯含量（王東陽，2016）；蕪菁BrrWSD1基因的剪接變異體及其在干旱脅迫下合成蠟酯的作用，證明其與干旱脅迫有關(guān)（Yang et al.， 2019）；在甘藍(lán)中檢測到甘藍(lán)BoWSD1基因在不同處理下表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，推測其在對NaCl、干旱、冷和熱等非生物脅迫的反應(yīng)中起重要作用（Zeng et al.， 2020）。但是迄今為止，植物WSD基因的Cd脅迫表達(dá)未見報道。因此，作者在其團(tuán)隊研究地黃與棉花Cd脅迫的同時開展了RgOATWSD基因的Cd脅迫表達(dá)研究（魏喜，2023；袁萍，2023），發(fā)現(xiàn)RgOATWSD基因表達(dá)對鎘脅迫有顯著的應(yīng)答反應(yīng)，從而擴(kuò)寬了植物WSD基因非生物脅迫表達(dá)的范圍。然而RgOATWSD基因的鎘脅迫表達(dá)機(jī)理尚不清楚。

目前，雖然植物對Cd脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制很不清楚（Zhang et al.， 2023），但是有一些好的探索發(fā)現(xiàn)。例如，Cd脅迫會激發(fā)植物通過質(zhì)膜Ca²⁺信號調(diào)控Cd脅迫的分子機(jī)制（Zhang et al.， 2023）；當(dāng)植物受到Cd脅迫時，植物體啟動生理生化網(wǎng)絡(luò)調(diào)控響應(yīng)，包括植物維持其體內(nèi)活性氧和活性氮的代謝水平及在抗氧化酶類、非酶類抗氧化物質(zhì)、鈣信號傳遞、激素、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工、調(diào)控蛋白和基因表達(dá)等方面的變化（安婷婷等，2021）。就基因表達(dá)變化而言，主要有參與Cd的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和解毒的NRAMP，參與轉(zhuǎn)運(yùn)Cd至植物地上部的HMA、MYB、ABA、ZIP、bHLH與RCD1等基因家族成員，以上參與植物鎘脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制比較清楚（魏喜，2023）。本研究中的基因RgOATWSD1和RgOATWSD2對Cd脅迫響應(yīng)未見報道，但發(fā)現(xiàn)二者編碼的蛋白質(zhì)都定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，因此，推測其Cd脅迫響應(yīng)機(jī)制可能類似于上述的基于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工與基因參與的鎘脅迫響應(yīng)機(jī)制（安婷婷等，2021）。

綜上所述，本研究成功從地黃全長轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中鑒定出兩個地黃蠟酯合成酶基因RgOATWSD1與RgOATWSD2，用生物信息學(xué)技術(shù)分析了其編碼酶的理化特性與結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)其在地黃根、莖與葉中的空間表達(dá)模式及2個基因表達(dá)模式的差異，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)其對鎘脅迫應(yīng)答反應(yīng)明顯及兩者之間的差異。本研究結(jié)果擴(kuò)大了已知地黃功能基因數(shù)據(jù)庫，豐富了植物鎘脅迫應(yīng)答的蠟酯合成酶基因信息，為進(jìn)一步研究其結(jié)構(gòu)功能及其鎘脅迫分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）