芥菜BjGSTF12基因克隆及表達(dá)分析

摘 要：為了探究谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶編碼基因（GST）在芥菜花青素積累中的作用，該文以紫薹-綠薹芥菜近等位基因系為材料，克隆到1個花青素積累相關(guān)的GST基因，命名為BjGSTF12。該文對BjGSTF12編碼蛋白及其啟動子進行生物信息學(xué)分析，并分析其在綠薹、紫薹芥菜中的表達(dá)水平及其與花青素含量的關(guān)系。結(jié)果表明：（1）BjGSTF12的基因組和cDNA全長分別為808、651 bp，編碼216個氨基酸，具有GST_N端和GST_C端保守結(jié)構(gòu)域。然而，綠薹、紫薹芥菜BjGSTF12序列無區(qū)別。（2）BjGSTF12與擬南芥AtGSTF12親緣關(guān)系最近，同屬于φ亞家族。（3）2個芥菜品系BjGSTF12啟動子序列存在4處堿基突變/插入，但二者順式作用元件種類與數(shù)目相同，均含9個MYB結(jié)合位點、1個赤霉素響應(yīng)元件、3個非生物脅迫響應(yīng)元件。（4）紫薹芥菜花青素含量顯著高于綠薹芥菜，BjGSTF12表達(dá)水平與花青素含量表現(xiàn)出類似變化規(guī)律。（5）互作蛋白網(wǎng)絡(luò)分析表明，BjGSTF12與花青素合成關(guān)鍵酶、糖基化修飾、轉(zhuǎn)運蛋白等蛋白存在互作。綜上認(rèn)為，BjGSTF12在芥菜薹莖花青素積累中可能發(fā)揮重要作用，BjGSTF12可能通過互作蛋白調(diào)控芥菜花青素合成、修飾、轉(zhuǎn)運從而影響花青素積累。該文對深入研究GST在芥菜薹莖花青素積累的功能及作用機制奠定了一定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：芥菜，GST，生物信息學(xué)分析，表達(dá)分析，花青素積累

中圖分類號：Q943 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1000-3142（2024）02-0267-14

廣 西 植 物44卷2期朱云娜等： 芥菜BjGSTF12基因克隆及表達(dá)分析收稿日期： 2023-07-13

基金項目：廣東省科技專項資金項目（210903164532210）；韶關(guān)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計劃項目（Sycxcy2022155）。

第一作者：朱云娜（1982-），博士，講師，主要從事蔬菜生理與分子生物學(xué)研究，（E-mail）zhuyn326@126.com。

^*通信作者：李海渤，博士，副教授，主要從事油菜和芥菜遺傳育種研究，（E-mail）lihai-bo@163.com。

Cloning and expression analysis of BjGSTF12 in Brassica juncea

ZHU Yunna， CHEN Fengmei， LI Zhixian， WANG Bin，

FENG Huimin， HU Fang， LI Haibo^*

（ Guangdong Provincial Key Laboratory of Utilization and Conservation of Food and Medicinal Resources in Northern Region /

College of Biology and Agriculture， Shaoguan University， Shaoguan 512005， Guangdong， China ）

Abstract： To explore the role of glutathione S-transferase gene （GST） in the accumulation of anthocyanin in Brassica juncea， one GST gene related to the anthocyanidin accumulation was cloned from near-isogenic lines of B. juncea with purple stalk and green stalk， and named as BjGSTF12. In this study， the bioinformatics characteristics of BjGSTF12 encoding protein and promoter were analyzed， the expression level of BjGSTF12 and the relationship with total anthocyanidin content were analyzed in B. juncea lines with purple stalk and green stalk. The results were as follow： （1） BjGSTF12 genes from B. juncea were successfully cloned， whose the full length of BjGSTF12 in genome and cDNA was 808 bp and 651 bp， encoding a protein of 216 amino acids. The BjGSTF12 contained the typical domains of GST proteins， namely GST_N and GST_C. However， their sequences of BjGSTF12 did not exhibit any differences between the two lines of B. juncea. （2） BjGSTF12 was closely related to AtGSTF12 in Arabidopsis， and both belonged to the φ subfamily of GST family. （3） The BjGSTF12 promoter sequences were cloned from two Brassica juncea strains of green stalk and purple stalk， and they exhibited four base mutations/insertions. However， the types and numbers of cis-acting elements did not show obvious differences between the two strains， including nine MYB transcription factor binding sites， one hormone response element， and three abiotic corresponding elements. （4） The total anthocyanidin content in B. juncea of purple stalk was significantly higher than that in green stalk ones， and the expression levels of BjGSTF12 in two lines were found to be similar to the total anthocyanidin content in both lines. （5） Protein interaction network analysis revealed that BjGSTF12 may interact with the key enzymes of anthocyanidin biosynthesis， glycosylation modification， and transporter proteins. In summary， BjGSTF12 is likely to play a key role in the accumulation of anthocyanidin in B. juncea by regulating its biosynthesis， modification， and transportation through interactions with other proteins. This study provides a theoretical reference for further study on the function of GST and the mechanism of anthocyanidin accumulation in B. juncea.

Key words： Brassica juncea， GST， bioinformatics analysis， expression analysis， anthocyanidin accumulation

谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST，EC 2.5.1.1.8）是一種具有多功能的超家族酶，廣泛存在于生物界，主要催化還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）和疏水、親電底物共價結(jié)合形成共軛物，將生物體內(nèi)潛在的有毒物質(zhì)和外來的有害物質(zhì)隔離在液泡或轉(zhuǎn)移到質(zhì)外體，從而達(dá)到解毒目的（Cummins et al.， 2011；陳秀華等，2013；張雪等，2017）。根據(jù)GST家族的基因結(jié)構(gòu)、氨基酸序列相似性以及催化底物等性質(zhì)的不同，GST家族分為7個亞家族，分別為φ（phi，F(xiàn)）、τ（tau，U）、ζ（zeta，Z）、θ（theta，T）、λ（lambda，L）、脫氫抗壞血酸還原酶（dehydroascorbate reductase，DHAR）和四氯對苯二酚脫鹵酶（tetrachlorohydroquinone dehalogenase，TCHQD），其中，φ和τ是植物所有特有的GST類型（Mohsenzadeh et al.， 2011）。GST蛋白均包含N端和C端2個結(jié)構(gòu)域，其中，N端為GSH特異結(jié)合位點（G位點），該位點較保守，C端包含結(jié)合疏水底物的結(jié)合位點（H位點），該位點可變性較大（邢磊等，2020）。

目前，已從擬南芥（Mohsenzadeh et al.， 2011）、油菜（Wei et al.， 2019）、石榴（劉龍博等，2021）等多個物種中分離鑒定了GST基因，其功能主要體現(xiàn)在以下三個方面：（1）催化GSH與有毒異源物質(zhì)或氧化產(chǎn)物結(jié)合，促進其代謝、隔離或清除，從而降低有毒物質(zhì)對細(xì)胞傷害（陳秀華等，2013）；（2）參與調(diào)控植物對鹽脅迫、重金屬脅迫等非生物脅迫條件下的抗逆能力（Lallement et al.， 2014；邢磊等，2020；張創(chuàng)娟等，2022）；（3）參與花青素等次生代謝物的跨膜運輸定位（Marrs et al.， 1995）。玉米Bronze-2是研究發(fā)現(xiàn)的第一個在花青素積累中起重要作用的GST基因（Marrs et al.， 1995）。Bronze-2的同源基因，如擬南芥TT19（GSTF12）（Sun et al.， 2012）、獼猴桃AcGST1（Liu et al.， 2019）、棉花GhGSTF12（Shao et al.， 2021）、蘿卜RsGSTF12（Niu et al.， 2022）等陸續(xù)被報道，表明GST基因在花青素積累中的功能是高度保守的。由此可見，GST家族成員在植物花青素積累中發(fā)揮著重要作用。

芥菜（Brassica juncea ）是十字花科蕓薹屬作物，為世界重要的蔬菜、油料、調(diào)料作物。在我國，芥菜可分為根、莖、葉、薹四大類16個變種（劉佩瑛，1996），除西藏等高寒山區(qū)外，芥菜在全國各地均有栽培（萬正杰等，2020）。隨著生活水平的日益提高與環(huán)境條件的變化，人們對芥菜品質(zhì)和品種抗性提出了新要求（符梅等， 2022）。培育紫色蔬菜品種對提高蔬菜的經(jīng)濟價值和營養(yǎng)價值具有重要意義。課題組以紫莖埃芥與棒菜經(jīng)多代回交及自交，選育了紫薹-綠薹芥菜近等位基因系（201-402）。該文以紫薹-綠薹芥菜近等位基因系為材料，采用同源克隆方法對芥菜BjGSTF12基因及啟動子進行克隆，通過生物信息學(xué)軟件對其編碼的蛋白序列進行同源性分析和系統(tǒng)進化分析、啟動子序列的順式作用元件分析，并分析其在紫薹、綠薹近等位基因系芥菜中的表達(dá)情況及其花青素含量之間的關(guān)系，擬探討以下問題：（1）BjGSTF12基因及啟動子序列在紫薹芥菜和綠薹芥菜中是否存在差異；（2）紫薹、綠薹芥菜薹莖花青素含量分析，BjGSTF12基因在紫莖芥菜和綠莖芥菜中的表達(dá)情況；（3）芥菜BjGSTF12的互作蛋白分析。本研究結(jié)果將為探究紫薹和綠薹芥菜花青素含量差異提供信息，為進一步解析BjGSTF12在芥菜薹莖花青素積累中的作用奠定基礎(chǔ)，為芥菜種質(zhì)資源的有效利用與合理保護等提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為課題組選育紫薹-綠薹芥菜近等位基因系（201-402）。2022年10月至次年2月，將芥菜種植于廣東省韶關(guān)市韶關(guān)學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院生態(tài)園連棟溫室內(nèi)。

1.2 試驗材料的種植和取樣

芥菜種子用7.5%的NaClO消毒10 min，用無菌水清洗4～5次，將種子播種于泥炭∶蛭石=3∶1基質(zhì)中進行育苗，待芥菜幼苗長至三葉一心進行定植，統(tǒng)一水肥管理，在移整地時，按照每667平方米一次性施入50 kg復(fù)合肥（N-P₂O₅-K₂為15-5-25）。移栽40 d后，待其抽薹，選取生長狀態(tài)一致的紫薹芥菜、綠薹芥菜植株，取新鮮莖，撕取表皮后剪碎，液氮速凍后，保存在-80℃冰箱中備用，每個樣品取3個生物重復(fù)，每個生物重復(fù)取4～6株。

1.3 芥菜薹莖花青素含量的測定

取0.05 g左右紫薹、綠薹芥菜表皮，切碎，放入5 mL的1％HCl甲醇溶液室溫避光過夜浸提，利用UV-2600型紫外分光光度計測定波長在530 nm下的吸光值（Li et al.， 2016）。

1.4 基因組DNA、總RNA的提取及cDNA合成

參照天根生化科技（北京）有限公司的新型基因組DNA提取試劑盒提取芥菜基因組DNA，參照普洛麥格（北京）生物技術(shù)公司的Eastep^? Super植物總RNA提取試劑盒和GoScript^TM Reverse Transcription System分別提取總RNA和合成cDNA。

1.5 基因克隆及陽性克隆鑒定

根據(jù)十字花科基因組數(shù)據(jù)庫（Brassicaceae Database）中的芥菜基因組數(shù)據(jù)Braju_tum_V2.0中的BjGSTF12基因序列（BjuVB05G21730）設(shè)計引物（表1）。

以表1中GSTF12為引物，以紫薹芥菜薹莖DNA、cDNA樣品分別為模板，克隆芥菜BjGSTF12基因。PCR產(chǎn)物回收擴增得到的基因產(chǎn)物，連接到pMD20-T載體，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過PCR鑒定后，選取陽性克隆送到廣州擎科生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.6 生物信息學(xué)分析

參照表2所列的生物信息學(xué)軟件或網(wǎng)址對芥菜GSTF12基因及其編碼氨基酸進行分析。

1.7 BjGSTF12在紫薹、綠薹芥菜薹莖中的表達(dá)量分析

根據(jù)SYBR Green^? Premix Ex Taq^TM進行熒光定量PCR分析，以Actin2為內(nèi)參基因，使用2^-ΔΔCt計算基因相對表達(dá)量（Livak amp; Schmittgen， 2002）。

1.8 芥菜BjGSTF12啟動子的克隆與順式作用元件分析

以紫薹、綠薹芥菜基因組DNA為模板，以表1中GSTFpro為引物，克隆芥菜BjGSTF12啟動子序列，連接pMD20-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，挑選陽性克隆進行測序。利用DNAMAN軟件對2個品種的啟動子序列進行比對，利用Plantcare網(wǎng)站對其啟動子序列進行順式作用元件分析，并利用TBtools對作用元件進行可視化（Chen et al.， 2020）。

1.9 統(tǒng)計分析與作圖

利用Microsoft Excel 2010進行數(shù)據(jù)整理，利用SPSS 19.0進行Duncan’s顯著性分析，利用SigmaPlot 11.0進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 芥菜BjGSTF12基因的克隆

提取紫薹芥菜薹莖DNA和總RNA，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，利用表1中GSTF12-F/R為引物，克隆芥菜BjGSTF12基因。經(jīng)過PCR擴展，獲得目的條帶如圖1所示。測序結(jié)果顯示，芥菜BjGSTF12基因的基因組序列和開放閱讀框序列分別為808、651 bp。

利用Gene Structure Display Server 2.0軟件繪制芥菜BjGSTF12基因結(jié)構(gòu)圖。由圖2可知，芥菜BjGSTF12基因序列中包含2個內(nèi)含子，內(nèi)含子序列分別在148～232 bp、282～353 bp之間。芥菜BjGSTF12基因全長CDS序列為651 bp，編碼216個氨基酸。通過BLAST在線比對，芥菜GSTF12基因片段與甘藍(lán)型油菜BnGSTF12（B. napus，XM_013794351）、 白菜（Brassica rapa，XM_009127922.3）、擬南芥AtGSTF12（Arabidopsis thaliana，NM_121728.4）核苷酸序列的同源性分別為94%、94%和88%。因此，將該芥菜基因命名為BjGSTF12。

2.2 芥菜BjGSTF12蛋白序列的生物信息學(xué)分析

利用 ProtParam對芥菜BjGSTF12基因編碼氨基酸序列進行分析發(fā)現(xiàn)，芥菜BjGSTF12基因編碼216個氨基酸，分子量為24.80 kDa，原子組成為C₁₁₂₁H₁₇₆₅N₂₉₇O₃₁₃S₁₂，主要由亮氨酸（Leu，11.6%）、纈氨酸（Val，9.7%）、丙氨酸（Ala，8.8%）、谷氨酸（Glu，8.8%）等氨基酸組成。該氨基酸序列的理論等電點（pI）為 5.73，平均疏水率為-0.075，脂肪酸系數(shù)為 98.38，不穩(wěn)定系數(shù)為 38.30。這表明芥菜BjGSTF12為穩(wěn)定性蛋白。

利用NCBI網(wǎng)站保守結(jié)構(gòu)域分析網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對芥菜BjGSTF12基因編碼氨基酸進行保守結(jié)構(gòu)域分析。由圖3：A可知，芥菜BjGSTF12具有GST_NTERHE和GST_CTER兩個結(jié)構(gòu)域，保守結(jié)構(gòu)域的位置為1～75、 91～207位氨基酸，¹MVVKLYGQVTAACPQRVLLCFLEKEIEFEIVHVDLDTLEQKKPEHLLRQPGQVPAIEDGDFKLFESRAIARYYA⁷⁵；⁹¹EHRAIVDQWADVETHY FNVLAFPIVLNLVIKPRLGEECDVVLVEETKVKLEVVLDIYENRLASNRFLAGDEFTMAD LTHMPAMGHLMGTDVNRMVKARVNMNRWWEEITARPAWKKL²⁰⁷。由此可見，芥菜BjGSTF12具有GST-C保守結(jié)構(gòu)域，屬于GST基因家族成員。

利用ExPASY ProtScale預(yù)測了芥菜BjGSTF12氨基酸序列的親疏水性，由圖3：B可知，芥菜BjGSTF12的最大正分值（2.522）位于肽鏈中的第116位氨基酸，最小負(fù)分值（-2.256）位于第40位氨基酸，整條肽鏈的親水性氨基酸數(shù)量多于疏水性氨基酸數(shù)量。由此推測，芥菜BjGSTF12可能為親水性蛋白。

利用NetPhos 3.1對芥菜BjGSTF12進行了潛在磷酸化位點分析。由圖3：C可知，芥菜BjGSTF12存在若干個潛在的磷酸化位點。芥菜BjGSTF12磷酸位點最多的是蘇氨酸磷酸位點（threonine，Thr），為4個，酪氨酸磷酸化位點（tyrosine，Tyr）次之，為3個，絲氨酸磷酸位點（serine，Ser）最少，為1個。這說明芥菜BjGSTF12可能被蘇氨酸、酪氨酸、絲氨酸激酶磷酸化，從而實現(xiàn)其調(diào)控功能。通過SignalP 5.0預(yù)測分析芥菜BjGSTF12氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)無信號肽序列，說明芥菜BjGSTF12為非分泌型蛋白。

運用ExPASY的SOPMA對芥菜BjGSTF12的二級結(jié)構(gòu)進行了分析預(yù)測。由圖3：D可知，BjGSTF12蛋白含有α-螺旋（alpha helix）46.30%、延伸鏈（extended strand）15.28%、β-折疊（beta turn）7.41%、無規(guī)則卷曲（random coil）31.02%。由此可見，芥菜BjGSTF12蛋白的主要組成部分為α-螺旋，而延伸鏈、β-折疊、無規(guī)則卷曲則散布于蛋白結(jié)構(gòu)中。

利用Plant-PLoc server（www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant）預(yù)測芥菜BjGSTF12亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)芥菜BjGSTF12定位于細(xì)胞質(zhì)中。利用TMHMM Server 2.0分析該蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)。使用SWISS-MODEL在線軟件預(yù)測芥菜BjGSTF12的三級結(jié)構(gòu)。由圖3：E可知，芥菜BjGSTF12蛋白的主要結(jié)構(gòu)為α-螺旋，延伸鏈、β-折疊、無規(guī)則卷曲則散分布于蛋白結(jié)構(gòu)中，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致；芥菜BjGSTF12蛋白三級結(jié)構(gòu)為單體結(jié)構(gòu)。

2.3 芥菜BjGSTF12的同源性比對及系統(tǒng)進化分析

將芥菜BjGSTF12與油菜BnGSTF12 （XP_048602386.1）、擬南芥AtGSTF12/AtTT19（NP_197224.1）、白菜BrGSTF12（XP_009126170.1）、蘿卜RsGSTF12（XP_018444305.1）、棉花GhGSTF12（XP_016744877.2）以及獼猴桃AcGST1（PSS21435.1）等序列進行了氨基酸序列多重比對分析。由圖4可知，芥菜BjGSTF12與其他物種GST氨基酸的同源性相似性介于52.07%～95.31%之間，其中，芥菜BjGSTF12與獼猴桃AcGST1的相似性最低，為52.07%，與油菜BnGSTF12相似性最高，達(dá)95.31%。

利用MEME在線分析工具對芥菜BjGSTF12圖 2 芥菜BjGSTF12基因結(jié)構(gòu)圖

Fig. 2 Genetic structure diagram of BjGSTF12 gene from Brassica junceaA. 保守結(jié)構(gòu)域分析; B. 親疏水性預(yù)測; C. 磷酸化位點預(yù)測; D. 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測; E. 三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

與其他物種GSTs蛋白保守結(jié)構(gòu)域進行了分析。由圖5可知，共獲得10個保守基序，分別為Motif 1～Motif 10。在芥菜BjGSTF12與油菜、白菜、擬南芥、蘿卜等物種GSTs成員中，共有6個保守基序，分別為Motif 1～Motif 6；獼猴桃AcGST1與油菜BnGSTF12還包含Motif 8和Motif 10保守基序，而獼猴桃AcGST1與棉花GhGSTF12還包含Motif 7保守基序，但其他物種的GSTs成員不含這幾個基序。在7個物種的GSTs成員中，均含有Motif 1、Motif 2、Motif 4、Motif 5這4個保守基序。

為了進一步了解芥菜BjGSTF12與其他GST家族成員的進化關(guān)系，將其與50個擬南芥GST家族成員進行了進化樹分析。由圖6可知，擬南芥GST家族成員聚類為7個亞家族，分別為τ亞家族（28個成員）、φ亞家族（11個成員）、DHAR亞家族（3個成員）、ζ亞家族（2個成員）、θ亞家族（2個成員）、λ亞家族（2個成員）、TCHQD亞家族（1個成員）。芥菜BjGSTF12與擬南芥GSTF12先聚類在一起，后與ATGSTF11聚類在一簇，屬于φ亞家族成員，而與其他亞家族成員相距較遠(yuǎn)。本研究結(jié)果再次表明，所克隆的芥菜BjGSTF12基因?qū)儆谥参颎ST基因家族成員。

2.4 綠薹、紫薹芥菜近等基因系花青素含量及BjGSTF12基因表達(dá)量分析

為進一步了解芥菜BjGSTF12基因在薹莖表皮花青素合成中的作用，利用前期選育不同莖色芥菜近等位基因系（綠薹、紫薹芥菜），分析了其薹莖表皮花青素含量與BjGSTF12基因的表達(dá)情況。由圖7：A、B可知，綠薹芥菜無論葉片還是薹莖、薹葉均為綠色，而紫薹芥菜葉片顏色為綠色，薹莖及幼嫩薹葉表現(xiàn)出明顯紫色。對兩種芥菜薹莖花青素含量分析表明，紫薹芥菜的花青素含量極顯著高于綠薹芥菜的（Plt;0.01）（圖7：C）；BjGSTF12基因在綠薹芥菜中僅有微弱表達(dá)，而其在紫薹芥菜中的表達(dá)水平明顯高于綠薹芥菜，二者之間差異達(dá)到極顯著水平（圖7：D）。比較BjGSTF12基因在綠薹芥菜和紫薹芥菜中的表達(dá)水平及其薹莖表皮花青素含量差別的結(jié)果表明，BjGSTF12在不同薹色芥菜的基因表達(dá)水平與花青素含量呈現(xiàn)類似的變化規(guī)律。

2.5 芥菜BjGSTF12基因的啟動子順式作用元件預(yù)測

從芥菜基因組數(shù)據(jù)中調(diào)取BjGSTF12翻譯起始位點上游啟動子序列，設(shè)計引物，分別用綠薹芥菜和紫薹芥菜基因組DNA為模板進行PCR擴增、測序，分別獲得1 855、1 857 bp序列，利用DNAMAN軟件進行了比對。由圖8可知，兩個芥菜品系的BjGSTF12啟動子序列相似度為99.78%，與綠薹芥菜相比，紫薹芥菜BjGSTF12啟動子在第130、1 333 bp處分別插入了1個G和1個A堿基，在第937、980 bp處的T堿基分別突變?yōu)锳和G堿基。為進一步了解2個芥菜品系BjGSTF12啟動子的差別，利用PlantCare在線網(wǎng)站預(yù)測了其作用元件，并用TBtools軟件進行了可視化。由圖9可知，2個品系BjGSTF12啟動子序列預(yù)測的順式作用元件相同，均含有9個真核生物轉(zhuǎn)錄起始核心的啟動子作用元件（TATA-box）和5個啟動子和增強子區(qū)域的共同順式作用元件（CAAT-box），含有9個MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點（6個MYB作用元件、3個MYB-like sequences作用元件）、1個赤霉素響應(yīng)元件（GARE作用元件）、1個厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件（ARE作用元件）、2個損傷和防御響應(yīng)元件（WRE3），另外，該啟動子序列還有8個未知作用元件（1個作用元件為taTAAATATct、7個作用元件為CTCC）。

2.6 芥菜BjGSTF12蛋白互作關(guān)系

利用STRING交互式數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了芥菜BjGSTF12蛋白與其他蛋白的互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，進而預(yù)測與BjGSTF12可發(fā)生互作的蛋白。選擇模式植物擬南芥，構(gòu)建芥菜BjGSTF12蛋白的互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。由圖10可知，芥菜BjGSTF12蛋白與二氫黃酮醇還原酶（dihydroflavonol-4-reductase，DFR）、查爾酮合成酶（transparent testa 4/chalcone synthase，TT4/CHS）、無色花青素雙加氧酶（leucoanthocyanidin dioxygenase，LDOX）、類黃酮3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（anthocyanidin 3-O-glucosyltransferase，UF3GT）、丙二酰輔酶A：花青素5-O-葡萄糖苷-6″-O-丙二酰轉(zhuǎn)移酶（malonyl-CoA：anthocyanidin 5-O-glucoside-6-O-malonyltransferase，AT5MAT）、MATE轉(zhuǎn)運蛋白（transparent testa 12，TT12）、H⁺泵類型跨膜轉(zhuǎn)運蛋白（autoinhibited H⁺-ATPase isoform 10，AHA10）、UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶超家族成員（AT4G14090）、HXXXD-型?；D(zhuǎn)移酶家族蛋白（AT1G03495）等蛋白存在互作。其中，DFR、TT4、LDOX、UF3GT為花青素生物合成中關(guān)鍵酶，AT5MAT、AT4G14090、AT1G03495主要負(fù)責(zé)花青素糖基化、酰基化修飾，TT12和AHA10主要負(fù)責(zé)原花青素單體向液泡的轉(zhuǎn)運。由此可見，芥菜BjGSTF12可能通過與這些互作蛋白相互作用參與花青素生物合成、修飾及轉(zhuǎn)運。

3 討論與結(jié)論

谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶是一種多功能酶，在細(xì)胞解毒（陳秀華等，2013）、抵抗逆境脅迫（Lallement et al.， 2014）、花青素等次生代謝轉(zhuǎn)運（Marrs et al.， 1995；Sun et al.， 2012）等方面發(fā)揮重要作用。但是目前，有關(guān)芥菜GST基因的功能及其與蔬菜薹莖顏色形成之間關(guān)系的研究報道還較少。本研究從紫薹芥菜中分離BjGSTF12基因的基因組序列和開放閱讀框序列，該基因序列含有3個外顯子和2個內(nèi)含子。利用NCBI網(wǎng)站分析該基因編碼氨基酸序列具有GST_NTERHE和GST_CTER兩個結(jié)構(gòu)域，表明芥菜BjGSTF12具有GST蛋白的GST-N和GST-C保守結(jié)構(gòu)域，屬于GST家族成員。本研究通過進一步的系統(tǒng)進化樹分析所獲得的芥菜BjGSTF12與擬南芥φ亞家族GST成員聚類為一個類群，與擬南芥AtGSTF12的親緣關(guān)系最近，表明該基因?qū)儆贕ST家族φ亞家族成員?；ㄇ嗨厥穷慄S酮化合物，為植物提供從紅色、粉紅色、橙色到藍(lán)色的一系列顏色，是評價植物花色、葉色、果色等器官色澤及營養(yǎng)品質(zhì)的重要指標(biāo)?；ㄇ嗨卦诩?xì)胞質(zhì)中合成，由苯丙氨酸解氨酶（phenylalanin ammonialyase，PAL）、TT4/CHS、黃烷酮3-羥化酶（flavanone 3-hydroxylase，F(xiàn)3H）、DFR、UF3GT、LDOX等酶參與完成（侯澤豪等，2017）；主要通過空泡隔離積聚在液泡中，其中包括GST、多藥和有毒化合物擠出（multidrug and toxin extrusion，MATE）以及ATP結(jié)合盒（ATP binding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運體（Shao et al.， 2021）。本研究在紫薹芥菜和綠薹芥菜克隆得到的BjGSTF12基因，其核苷酸序列和氨基酸序列比對結(jié)果一致，并且與芥菜基因組BjuVB05G21730基因序列也完全一致，CDS序列長度為651 bp，編碼216個氨基酸殘基，該序列與油菜、白菜、擬南芥、蘿卜GSTF12氨基酸序列同源性較高，為84.33%～95.31%。GST蛋白除參與逆境脅迫調(diào)控外，也參與花青素的轉(zhuǎn)運（Marrs et al.， 1995；Kitamura et al.， 2004）。在擬南芥（Sun et al.， 2012）、棉花（Shao et al.， 2021）、蘿卜（Niu et al.， 2022）等植物中陸續(xù)被報道，GSTF12參與花青素從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到液泡的過程。此外，在獼猴桃、馬鈴薯等物種中，GST1也可作為花青素運輸載體轉(zhuǎn)運花青素至液泡（Liu et al.， 2019；Zhang et al.， 2023）。綜上表明，植物GST基因在花青素積累中的功能是保守的。本研究發(fā)現(xiàn)，BjGSTF12基因在綠薹芥菜中僅有微弱表達(dá)，而在紫薹芥菜中的表達(dá)水平明顯提高，并且不同薹色芥菜BjGSTF12基因表達(dá)水平與花青素含量有類似的變化規(guī)律。

本研究中，盡管紫薹、綠薹芥菜在花青素含量和BjGSTF12基因表達(dá)水平方面存在明顯差異，但是從2個芥菜品系中克隆的BjGSTF12基因序列完全一致，暗示BjGSTF12基因?qū)娌嘶ㄇ嗨睾铣煞e累的影響可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。為此，我們從綠薹芥菜、紫薹芥菜中分離BjGSTF12啟動子序列，發(fā)現(xiàn)2個品系BjGSTF12啟動子序列相似度為99.78%，紫薹芥菜BjGSTF12啟動子有4處存在單堿基的突變或插入，但這2個品系BjGSTF12啟動子序列的順式作用元件種類與數(shù)目均相同，主要含有MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、赤霉素響應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件以及損傷和防御響應(yīng)元件等作用元件。前人研究表明，MYB轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控GST促進花青素積累（Hu et al.， 2016；Zhang et al.， 2023）；在油菜中，GSTF12與MYB5、MYB56、MYB61、MYB118等多個MYB轉(zhuǎn)錄因子存在共表達(dá)（Wei et al.， 2019）；Goswami等（2018）利用雜交創(chuàng)制富含花青素的甘藍(lán)型油菜，研究表明TT19（GSTF12）與MYB111、TT8共同調(diào)控花青素合成和積累。此外，除MYB結(jié)合位點外，BjGSTF12啟動子還受激素、環(huán)境因子等調(diào)控。然而，紫薹芥菜BjGSTF12啟動子序列的突變和插入與該基因在綠薹、紫薹芥菜表達(dá)差異之間的關(guān)系，也有待進一步研究。

利用STRING數(shù)據(jù)庫分析芥菜BjGSTF12互作蛋白網(wǎng)絡(luò)，芥菜BjGSTF12與DFR、TT4/CHS、LDOX、UF3GT等花青素合成關(guān)鍵酶存在互作，同時與TT12和AHA10等負(fù)責(zé)原花青素單體向液泡轉(zhuǎn)運的蛋白存在互作；此外，BjGSTF12與AT5MAT、AT4G14090、AT1G03495等負(fù)責(zé)花青素糖基化、酰基化修飾蛋白也存在互作關(guān)系。然而，研究者指出GST本身并不能直接催化花青素生物合成，它僅作為載體將花青素從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運至液泡（Sun et al.， 2012）。由此可見，芥菜BjGSTF12可能通過互作蛋白相互作用調(diào)控花青素的生物合成、修飾、轉(zhuǎn)運，從而影響花青素的積累。然而，目前本研究還缺少足夠的試驗證據(jù)，今后將通過亞細(xì)胞定位、基因功能鑒定、構(gòu)建酵母文庫并篩選芥菜GST基因上游轉(zhuǎn)錄因子等方面著手，深入探究GST在芥菜薹莖花青素積累過程中生物學(xué)功能及其作用機制。

綜上所述，我們從綠薹、紫薹芥菜中克隆并分析了BjGSTF12基因、啟動子序列，分析結(jié)果表明該基因?qū)儆谥参颎ST家族的φ亞家族成員，其啟動子包含的順式作用元件種類和數(shù)目，僅存在幾處堿基突變/插入，然而該基因在綠薹、紫薹芥菜中表達(dá)量存在顯著差異且與芥菜薹莖花青素含量有類似的變化規(guī)律，表明BjGSTF12為功能基因，可能在芥菜薹莖花青素積累中發(fā)揮重要作用，為今后芥菜花青素積累機制研究提供了1個候選基因。然而，要想全面了解BjGSTF12調(diào)控芥菜花青素積累的具體作用機制還有待于進一步研究。

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（責(zé)任編輯 李 莉）