繡球‘杜麗’AP3基因克隆與基因編輯載體構(gòu)建

摘 要：繡球 （Hydrangea macrophylla） 是以花序?yàn)橹饕^賞部位的園林植物，多用作切花裝飾和景觀營(yíng)造，在亞洲、美洲、歐洲廣泛栽培。為探究AP3基因在繡球花萼形成過(guò)程中的功能，加快重瓣繡球新品種培育進(jìn)程，該研究以繡球‘杜麗’為材料，克隆其MADS-box B類基因HmAP3，并結(jié)合生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)基因功能；根據(jù)HmAP3序列信息，篩選出高特異性編輯靶點(diǎn)并構(gòu)建CRISPR/Cas9基因編輯載體，通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將載體整合到繡球基因組中。結(jié)果表明：（1） 克隆到1段HmAP3基因的cDNA序列，其序列全長(zhǎng)546 bp，共編碼181個(gè)氨基酸，測(cè)序結(jié)果表明其氨基酸序列與參考序列一致性為100%，與擬南芥AtAP3相似度為58.8%。（2）不同屬植物AP3氨基酸序列差異較大，在同屬不同物種中，AP3蛋白主要結(jié)構(gòu)較為保守，僅在少數(shù)基序上存在差異。（3）在HmAP3中共鑒定到2個(gè)高特異性靶點(diǎn)，并成功構(gòu)建2個(gè)單靶點(diǎn)CRISPR/Cas9基因編輯載體。（4）該研究共獲得5株基因組內(nèi)含有Cas9序列的抗性芽，但其靶點(diǎn)均未突變，在抗性芽中沒(méi)有檢測(cè)到Cas9表達(dá)。該研究探討了AP3基因在重瓣繡球育種中的價(jià)值，對(duì)繡球的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)進(jìn)行了初探，為繡球優(yōu)良品種繁育工作奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：繡球， MADS-box家族， AP3， CRISPR/Cas9， 載體構(gòu)建

中圖分類號(hào)：Q943 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-3142（2024）02-0257-10

基金項(xiàng)目：國(guó)家林業(yè)和草原局引進(jìn)國(guó)際先進(jìn)林業(yè)科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目（2015-4-15）。

第一作者：李童（1997-），碩士，主要從事花卉物種質(zhì)資源創(chuàng)新與育種研究，（E-mail）13051865858@163.com。

^*通信作者：趙惠恩，博士，教授，研究方向?yàn)榛ɑ芊N質(zhì)資源創(chuàng)新與育種，（E-mail）zhaohuien@bjfu.edu.cn。

AP3 gene cloning and gene-editing vector construction of Hydrangea macrophylla ‘Dooley’

LI Tong， WANG Yueying， ZHAO Huien^*

（ Beijing Key Laboratory of Ornamental Plants Germplasm Innovation amp; Molecular Breeding， Key Laboratory of Genetics and Breeding in Forest Trees and Ornamental Plants of Ministry of Education， National Engineering Research Center for Floriculture， Beijing Laboratory of Urban and Rural Ecological Environment， College of Landscape Architecture， Beijing Forestry University， Beijing 100083， China ）

Abstract： Hydrangea macrophylla is a garden plant widely cultivated in Asia， America， and Europe with its inflorescence as main ornamental feature. It is commonly used in interior decoration and landscape creation. To investigate the role of AP3 gene in hydrangea during calyx formation， H. macrophylla ‘Dooley’ was used as the material. The MADS-box Class B gene HmAP3 was cloned， and its gene function was predicted by bioinformatics analysis. To explore methods for quicker breeding new varieties， highly-specific editing targets were screened and CRISPR/Cas9 gene-editing vectors were constructed. The vector sequence was integrated into the H. macrophylla genome by agrobacterium-mediated transformation. The results were as follows： （1） The cDNA sequence full length of HmAP3 was 546 bp， encoding 181 amino acids. Its amino acid sequence was 100% similar to the reference sequence and 58.8% similar to Arabidopsis thaliana. （2） AP3 differed greatly in different genera. Within the same genus， the main structure of AP3 protein was conserved and differed only in a few motifs. （3） There were two highly specific targets in HmAP3. Sequencing results indicated that two single-target CRISPR/Cas9 gene-editing vectors were constructed successfully. （4） There were five resistant buds with Cas9 sequences in their genomes. However， their target sequences did not change due to the absence of Cas9 expression. In this study， the potential of AP3 gene in the breeding work of double flower phenotype was investigated， and a preliminary exploration of CRISPR/Cas9 gene-editing technology for Hydrangea macrophylla was conducted. These results provide a basis for the breeding of H. macrophylla.

Key words： Hydrangea macrophylla， MADS-box family， AP3， CRISPR/Cas9， vector construction

繡球 （Hydrangea macrophylla），虎耳草科繡球?qū)伲置讼苫ǎ谕ピ壕坝^中的應(yīng)用歷史悠久，是一種具有較高觀賞價(jià)值的園林植物，作為世界流行的切花深受大眾喜愛(ài)。目前繡球主要有蕾絲帽形和圓球形兩類花序，其花序中的不育花具有大而艷麗的花瓣?duì)钶嗥抢C球的主要觀賞組織。繡球不育花有單瓣和重瓣之分，其中單瓣類只有一輪觀賞性萼片，重瓣類則具有多輪觀賞性萼片。相比之下，重瓣繡球具有更高的觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是繡球新品種培育的重要方向 （Suyama et al.， 2015）。目前，國(guó)內(nèi)外的繡球育種方式以雜交育種為主，其育種效率低、周期長(zhǎng)，難以適應(yīng)日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求 （Wu et al.， 2021），需要探索更快捷、高效的育種方式。

CRISPR/Cas9技術(shù)是一種新興的基因編輯技術(shù)，能夠定向改變植物的觀賞性狀，如改造花型和花色，延長(zhǎng)觀賞周期等，在園林植物新品種繁育工作中具有極大的發(fā)展?jié)摿徒?jīng)濟(jì)價(jià)值 （Kaur et al.， 2021）。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)由Cas9核酸酶和單引導(dǎo)RNA （single guide RNA， sgRNA） 構(gòu)成 （Jinek et al.， 2012），二者在植物細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄后形成復(fù)合體，識(shí)別植物基因組中的間區(qū)序列鄰近基序 （protospacer adjacent motif， PAM） 前端約20 nt 核苷酸序列并結(jié)合，Cas9核酸酶切割該序列形成DNA雙鏈缺口（DNA double-strand breaks， DSBs），引發(fā)植物自身?yè)p傷修復(fù)機(jī)制，產(chǎn)生隨機(jī)的堿基缺失 （Hsu et al.， 2013）。與其他園藝作物相比，CRISPR/Cas9技術(shù)在園林植物中的應(yīng)用較少，僅應(yīng)用于毛白楊 （Fan et al.， 2015）、矮牽牛 （Zhang et al.， 2016; Sun amp; Kao， 2018; Xu et al.， 2020; Yu et al.， 2021）、菊花 （Kishi-Kaboshi et al.， 2017）、鐵皮石斛 （Kui et al.， 2017）、百合 （Yan et al.， 2019）、牽牛花 （Shibuya et al.， 2018; Watanabe et al.， 2018）、藍(lán)豬耳 （Nishihara et al.， 2018）與蝴蝶蘭 （Tong et al.， 2020; Semiarti et al.， 2020） 。

花器官由花瓣、花萼、雄蕊和心皮4個(gè)部分組成，其基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制可以用ABCDE模型來(lái)解釋。在ABCDE模型中，B類基因主要負(fù)責(zé)與A類基因共同調(diào)控花瓣的形成，以及與C類基因共同調(diào)控雄蕊的形成 （Coen amp; Meyerowitz， 1991）；除A類基因中的AP2屬于AP2/ERF家族外，該模型中的其余基因均屬于MADS-box基因家族 （王瑩等， 2021）。MADS-box B類基因亞家族成員廣泛存在于現(xiàn)存植物的基因組中，在裸子植物小孢子葉球與被子植物花瓣和雄蕊中均有表達(dá)，在植物發(fā)育過(guò)程中具有重要地位 （Albert et al.， 1998）。B類基因包含APETALA3 （AP3） 和PITILLATA （PI） 兩個(gè)譜系，其中AP3譜系主要調(diào)控花瓣和花萼的形成 （Jaramillo amp; Kramer， 2004）。AP3蛋白中含有保守的K-BOX結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能夠引導(dǎo)AP3蛋白與PI、SEP3、AP1蛋白形成四聚體，誘導(dǎo)花瓣原基形成 （Melzer amp; Theien， 2009; Theien et al.， 2016）。在觀賞植物中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)AP3基因沉默能夠?qū)е掳珷颗?（van der Krol， 1993）、蘭花 （Mondragón-Palomino amp; Theien， 2009）與耬斗菜 （Zhang et al.， 2013）等發(fā)生從花瓣向花萼的同源異型轉(zhuǎn)變。

因此，本研究對(duì)繡球‘杜麗’的MADS-box B 類基因HmAP3進(jìn)行了克隆和生物信息學(xué)分析；同時(shí)結(jié)合組內(nèi)前期繡球‘杜麗’再生體系建立基礎(chǔ)，借助CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，構(gòu)建了2個(gè)HmAP3單靶點(diǎn)載體，轉(zhuǎn)化獲得抗性芽，擬探討以下問(wèn)題：（1） HmAP3氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域特征與蛋白結(jié)構(gòu)分析；（2） HmAP3系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及其生物學(xué)功能預(yù)測(cè)；（3） 探究影響繡球CRISPR/Cas9基因編輯工作成功率的因素。以期為繡球的性狀改良和新品種繁育工作提供實(shí)踐參考和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和試劑

繡球‘杜麗’種植于北京植物園 （116° 28′ E、40°00′ N）。于4月選取翠綠、無(wú)病蟲(chóng)害的葉片作為試驗(yàn)材料，將葉片與葉柄一并剪下，放入干凈的蒸餾水中轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室。

試驗(yàn)所用的試劑盒包括植物總RNA提取試劑盒 ［天根生化科技（北京）有限公司，DP432］，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒 （TaKaRa，RR047A），DNA凝膠回收試劑盒 （北京擎科生物科技股份有限公司，GE0101），One step ZTOPO-Blunt/TA零背景快速克隆試劑盒 （北京莊盟生物科技有限公司，ZC206），SE無(wú)縫克隆和組裝試劑盒 （北京莊盟生物科技有限公司，ZC231），限制性內(nèi)切酶Bsa I ［紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司］。

1.2 繡球‘杜麗’HmAP3基因克隆

依據(jù)在NCBI 上查找到的繡球‘Blue Sky’ （H. macrophylla ‘Blue Sky’） AP3基因 （GenBank： AF230702.1） 的CDS序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì) （表1） 并合成高特異性引物。

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取試驗(yàn)材料RNA，并將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，用KOD One高保真DNA聚合酶 （TOYOBO，KMM-101），以HmAP3-F1/R1為引物 （表1） 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化，將目的片段所處區(qū)域凝膠切割下來(lái)，按照DNA凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)回收。純化后的PCR產(chǎn)物連接T載體后轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌感受態(tài)涂布平板培養(yǎng)12 h，選取單菌落送至測(cè)序公司 （北京擎科生物科技股份有限公司） 進(jìn)行質(zhì)粒提取和測(cè)序工作，獲得HmAP3基因的CDS序列。

1.3 繡球‘杜麗’HmAP3基因生物信息學(xué)分析

使用Cell-PLoc （http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/） 對(duì)HmAP3進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) （Chou amp; Shen， 2010）。利用NCBI-BLAST （https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） 比對(duì)HmAP3氨基酸序列相似性，下載比對(duì)結(jié)果中排名在前列的其他植物AP3氨基酸序列，同時(shí)下載擬南芥AtAP3氨基酸序列，通過(guò)MEGA-X軟件的鄰接法 （neighbor-joining method， NJ） 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) （Zhang et al.， 2019）。利用MEME （http：//meme-suite.org/tools/meme/） 預(yù)測(cè)HmAP3氨基酸序列保守基序。通過(guò)ProrParam （https：//web.expasy.org/protparam/） 分析HmAP3蛋白的理化性質(zhì) （Li et al.， 2020）。分別使用蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)工具SOPMA （https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html/）和蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)工具Swiss model （https：//swissmodel.expasy.org/） 對(duì)HmAP3氨基酸序列進(jìn)行分析。

1.4 CRISPR/Cas9基因編輯載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)化

使用CRISPR靶點(diǎn)設(shè)計(jì)網(wǎng)站CRISPRdirect" （http：//crispr.dbcls.jp/） 根據(jù)HmAP3基因的CDS序列，選擇PAM位點(diǎn)和GC含量在40%～60% 之間的高特異性靶點(diǎn)。以pCAMBIA1300-sgRNA/Cas9載體質(zhì)粒為模板，以HmAP3-F2/R2、HmAP3-F3/R3為引物 （表1），進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得帶有黏性末端的目的片段。使用內(nèi)切酶Bsa Ⅰ酶切獲得pCAMBIA1300-sgRNA/Cas9 線性載體，用無(wú)縫克隆試劑盒 （北京莊盟生物科技有限公司， ZC231） 連接載體和目的片段，獲得重組質(zhì)粒。構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌感受態(tài)涂布平板培養(yǎng)12 h，選取單菌落送至測(cè)序公司 （北京擎科生物科技股份有限公司） 進(jìn)行質(zhì)粒提取和測(cè)序工作，回收構(gòu)建成功的載體質(zhì)粒。將構(gòu)建好的載體pCAMBIA1300：：HmAP3利用凍融法轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)中，在2抗LB培養(yǎng)基 （50 mg·L^-1 卡那霉素+50 mg·L^-1 利福平） 中28℃培養(yǎng)2 d，挑取單菌落在LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)繁。離心收集擴(kuò)繁的農(nóng)桿菌菌體，加入適量侵染液 （MS+30 g·L^-1 蔗糖+200 μmol·L^-1 乙酰丁香酮） 調(diào)至OD₆₀₀=0.4。

將繡球‘杜麗’葉片剪切成1 cm×1 cm的小塊，在葉背劃3～4刀，放入上述配制好的侵染液中浸泡侵染10 min，轉(zhuǎn)接到共培養(yǎng)培養(yǎng)基 （MS+2.0 mg·L^-1 6-BA+0.1 mg·L^-1 IBA） 上暗培養(yǎng)2 d，再轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基 （MS+2.0 mg·L^-1 6-BA+0.1 mg·L^-1 IBA+2 mg·L^-1 潮霉素+200 mg·L^-1 頭孢霉素） 中至獲得抗性再生芽。

1.5 抗性芽檢測(cè)和鑒定

取抗性芽葉片，使用基因組提取試劑盒獲取葉片DNA，再依次使用總RNA提取試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取葉片cDNA。分別以葉片DNA和cDNA為模板，以Cas9-F/R為引物擴(kuò)增Cas9序列，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為764 bp。以葉片DNA為模板，以HmAP3-F1/R1為引物擴(kuò)增抗性芽HmAP3序列，擴(kuò)增產(chǎn)物送至測(cè)序公司 （北京擎科生物科技股份有限公司） 測(cè)序。使用DNAMAN比對(duì)測(cè)序結(jié)果與野生型序列差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 繡球‘杜麗’AP3基因克隆與序列分析

參考繡球‘Blue Sky’ AP3基因CDS序列，利用HmAP3-F1/HmAP3-R1引物 （表1），在繡球‘杜麗’cDNA文庫(kù)中克隆到了一段完全一致的核苷酸序列。克隆到的基因序列全長(zhǎng)546 bp，共編碼181個(gè)氨基酸，利用NCBI分析其氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)在30～123 bp處包含1個(gè)K-BOX保守結(jié)構(gòu)域 （圖1）。該氨基酸序列C端含有PI基序和euAP3基序，符合MADS-box家族特征，命名為HmAP3。將HmAP3與擬南芥AtAP3氨基酸序列比對(duì)，其相似度為58.8%；HmAP3與繡球‘Blue Sky’ AP3 的DNA序列相似度為100%。因此，推測(cè)該基因?yàn)槔C球‘杜麗’AP3基因。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示HmAP3在細(xì)胞核中表達(dá)。

2.2 繡球‘杜麗’AP3蛋白理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)分析

以擬南芥MADS-box類蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)為模型，預(yù)測(cè)HmAP3蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)該結(jié)構(gòu)中含有2條長(zhǎng)α-螺旋，螺旋間紐結(jié)為90°；其預(yù)測(cè)結(jié)果GMQE （全球模型質(zhì)量估計(jì)） 值為0.32，QMEAN得分為0.74±0.05，模型可信度和質(zhì)量較高（圖2）。繡球‘杜麗’的HmAP3蛋白分子式為C₉₂₇H₁₄₆₂N₂₆₈O₂₈₇S₇，分子量為21 177.85 D。該蛋白共包含181個(gè)氨基酸，不穩(wěn)定系數(shù)為38.79，屬穩(wěn)定蛋白。蛋白帶負(fù)電荷殘基總數(shù) （Asp+Glu）為28，帶正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）為25，理論等電點(diǎn)為6.17。蛋白脂肪指數(shù)為79.12，親水性 （GRAVY）為-0.791，為親水性蛋白。HmAP3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占比最高，為64.09%；其他結(jié)構(gòu)占比由高到低依次為無(wú)規(guī)則卷曲 （22.65%）、延伸鏈（8.84%）、β-折疊（4.42%） （圖3）。

2.3 繡球‘杜麗’AP3蛋白系統(tǒng)進(jìn)化與motif分析

將HmAP3氨基酸序列提交到NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，在比對(duì)結(jié)果中選取下載與該序列相似度較高的其他植物AP3氨基酸序列，在MEGA-X軟件上用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) （圖4）。從整體上來(lái)看，繡球等薔薇亞綱菊超目植物被聚為同一大支，說(shuō)明AP3蛋白在系統(tǒng)進(jìn)化過(guò)程中具有一定保守性。從各小分支來(lái)看，不同物種間的AP3序列存在一定差異，而同物種間的序列相似度則較高。相對(duì)而言，繡球與神秘果 （Synsepalum dulcificum）、灑金桃葉珊瑚 （Aucuba japonica var. borealis） 和歐洲枸骨 （Ilex aquifolium） 親緣關(guān)系最近。在模式植物中，繡球與煙草 （Nicotiana tabacum） 的親緣關(guān)系比擬南芥 （Arabidopsis thaliana） 更近。因此，使用煙草基因組作為預(yù)測(cè)繡球基因編輯靶點(diǎn)的參考基因組更為適宜。

在MEME-motif suite工具上對(duì)上述氨基酸序列進(jìn)行分析后，獲得了15個(gè)motif及其在序列中的相對(duì)位置 （圖4）。大部分植物AP3序列包含7個(gè)motif，其中有8個(gè)AP3序列包含8個(gè)motif，1個(gè)AP3序列包含9個(gè)motif。所有AP3序列C端較為保守，均含有motif 2、motif 4、motif 5、motif 6和motif 7，而N端多含motif 3。與其他植物相比，繡球AP3序列中含有特有的motif 12，此外僅灑金桃葉珊瑚AP3序列中含有這一基序，說(shuō)明HmAP3相對(duì)其他植物AP3蛋白可能會(huì)有更多功能。對(duì)同源基因來(lái)說(shuō)，其序列的motif大體相似，然而在不同物種間仍存在一定的差異，這些差異導(dǎo)致了不同物種間同源基因的功能差異。

2.4 CRISPR/Cas9基因編輯載體構(gòu)建

利用CRISPRdirect在HmAP3上共選取到2個(gè)特異性強(qiáng)的靶點(diǎn)，分別命名為HmAP3-Taget1 （5′- GATCTGTACCAGACGACAAT+GGG-3′） 和HmAP3-Taget2 （5′- TGAACGAAAGTATCGAGTAC+CGG-3′），其GC含量分別為45 %和40 %，其與PAM位點(diǎn)相鄰的12 bp在參考基因組 （煙草） 中均僅比對(duì)到1個(gè)位點(diǎn)，證明該靶點(diǎn)具有較強(qiáng)特異性。用引物HmAP3-F2/R2、HmAP3-F3/R3在質(zhì)粒上擴(kuò)增含有黏性末端的目的片段，與線性載體連接，用大腸桿菌轉(zhuǎn)化后挑取單菌落測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明目的片段已成功插入載體，插入片段與載體結(jié)構(gòu)如圖5所示。繡球?qū)Τ泵顾孛舾行院芨撸?jīng)2 mg·L^-1潮霉素篩選后，在侵染約2 000枚葉片后僅培育出9株抗性芽（圖6：A）。以抗性芽葉片DNA為模板，分別使用靶基因序列擴(kuò)增引物HmAP3-F1/HmAP3-R1和Cas9序列擴(kuò)增引物Cas9-F/Cas9-R對(duì)抗性芽進(jìn)行鑒定。擴(kuò)增和測(cè)序結(jié)果表明，9株抗性芽葉片基因組中有5株可克隆到Cas9序列，但其靶點(diǎn)序列均未發(fā)生突變 （圖6：B）。提取抗性芽葉片總RNA后反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再次克隆Cas9序列，發(fā)現(xiàn)所有樣品均無(wú)法擴(kuò)增出條帶。該現(xiàn)象說(shuō)明雖然載體序列已成功整合到載體基因組上，但是Cas9蛋白并未成功轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，因此，編輯靶點(diǎn)的序列沒(méi)有改變。

3 討論與結(jié)論

本研究克隆了繡球‘杜麗’的HmAP3基因，并對(duì)其核苷酸序列與氨基酸序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。研究發(fā)現(xiàn)HmAP3與模式植物擬南芥 （Yang et al.， 2003） 及園藝作物綠竹 （朱龍飛，2013）、葡萄 （胡曉燕等，2021）、菠蘿 （鄭雪文等，2021） 在特有的K-BOX結(jié)構(gòu)域上長(zhǎng)度相近、結(jié)構(gòu)相似，表明此結(jié)構(gòu)域在不同物種的AP3中高度保守。理化性質(zhì)分析結(jié)果表明HmAP3是穩(wěn)定的親水性蛋白，與鄭雪文等 （2021）的研究結(jié)果一致。在HmAP3蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型中，K-BOX形成長(zhǎng)α-螺旋結(jié)構(gòu)，與植物MADS-box家族中K-BOX結(jié)構(gòu)域特征一致，該結(jié)構(gòu)在AP3與其他蛋白結(jié)合形成四聚體的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用 （Yang amp; Jack， 2004）。

HmAP3蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明AP3基因在植物系統(tǒng)進(jìn)化過(guò)程中的保守性，其中繡球與金魚(yú)草、煙草和番茄AP3基因聚類在同一大分支，親緣關(guān)系較近，與Viaene等 （2009） 研究結(jié)果相似。Martino等 （2006） 和Liu等 （2004） 研究發(fā)現(xiàn)，番茄SlAP3與煙草NtAP3基因沉默后代表現(xiàn)出花萼輪數(shù)增多、花瓣消失的性狀。通過(guò)同源比對(duì)，推測(cè)繡球‘杜麗’HmAP3基因與其同源基因SlAP3、NtAP3功能相似，可能負(fù)責(zé)調(diào)控繡球花器官中花萼和花瓣的形成。

本研究構(gòu)建了2個(gè)繡球HmAP3單靶點(diǎn)載體，并在轉(zhuǎn)化獲得的抗性芽基因組中檢測(cè)到載體序列，但在抗性芽中未檢測(cè)到Cas9序列的表達(dá)和編輯位點(diǎn)序列突變。本研究與Ren等 （2013）的研究結(jié)果相似，他推測(cè)基因編輯效率與啟動(dòng)子活性有關(guān)，當(dāng)CRISPR/Cas9基因編輯載體中的啟動(dòng)子從nos-mini變?yōu)閁6b啟動(dòng)子時(shí)，遺傳突變率可從0提高至3.2%。在觀賞植物中，Kishi-Kaboshi等 （2019） 的研究也佐證了這一觀點(diǎn)，系統(tǒng)性比較了Ubiqutin、CaMV 35S和CmActin2啟動(dòng)子的表達(dá)活性差異后，發(fā)現(xiàn) CaMV 35S和Ubiqutin啟動(dòng)子在菊花愈傷組織中活性均低于菊花CmActin2啟動(dòng)子。本研究使用的Cas9序列啟動(dòng)子為Ubiqutin啟動(dòng)子，猜想其在繡球組織中的表達(dá)活性極低，導(dǎo)致Cas9序列在抗性芽中未表達(dá)。在下一步繡球基因編輯工作中，可將載體中啟動(dòng)子更換為繡球本源啟動(dòng)子，進(jìn)一步探究啟動(dòng)子活性對(duì)基因編輯成功率的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)繡球?qū)Τ泵顾氐母呙舾行砸彩怯绊慍RISPR/Cas9基因編輯效率的重要因素。本研究使用2 mg·L^-1潮霉素濃度對(duì)繡球抗性芽進(jìn)行篩選，再生率僅為0.45%，與蘋果 （賈東杰等，2013） 等在潮霉素篩選下的再生情況相符，推測(cè)繡球野生型基因組內(nèi)不含有潮霉素抗性基因。甘煌燦等 （2018） 提出可通過(guò)在再生篩選過(guò)程中逐漸增加潮霉素濃度的方法，提高抗性芽的成活率。后續(xù)的繡球抗性芽的篩選條件可通過(guò)調(diào)整不同再生階藍(lán)色表示α-螺旋，紫色表示無(wú)規(guī)則卷曲，綠色表示β-折疊，紅色表示延伸鏈。段潮霉素濃度的方式來(lái)進(jìn)一步優(yōu)化，以提高基因編輯效率。

本研究在繡球‘杜麗’中克隆到1個(gè)HmAP3基因，cDNA序列全長(zhǎng)546 bp，共編碼181個(gè)氨基酸，為穩(wěn)定的親水性蛋白，氨基酸序列結(jié)構(gòu)分析證明其具有MADS-box B 類基因亞家族特征，系統(tǒng)進(jìn)化分析表明HmAP3與煙草、番茄、金魚(yú)草親緣關(guān)系較近，基序組成結(jié)構(gòu)保守；以HmAP3為靶點(diǎn)，成功構(gòu)建2個(gè)以Cas9基因、sgRNA、潮霉素抗性基因?yàn)楣羌艿腃RISPR/Cas9基因編輯載體，并將載體序列整合到繡球基因組中。上述研究結(jié)果為進(jìn)一步研究HmAP3基因功能奠定了理論基礎(chǔ)，為重瓣繡球基因編輯輔助育種工作提供技術(shù)支撐。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）