摘 要:次生乳管是天然橡膠合成和貯存的場所,是由橡膠樹樹干樹皮中維管形成層細(xì)胞分裂分化而來。次生乳管的數(shù)量與天然橡膠產(chǎn)量直接相關(guān),而這些乳管的數(shù)量取決于形成層分化次生乳管的頻率(乳管分化能力),是橡膠樹產(chǎn)量育種的主要指標(biāo)。前期研究中,我們發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙?;福℉DA)抑制劑曲古抑菌素A(TSA)能誘導(dǎo)橡膠樹乳管分化且組蛋白去乙?;富颍℉bHDA6)能夠參與橡膠樹乳管分化調(diào)控。由于組蛋白乙?;揎椪{(diào)控橡膠樹次生乳管分化的分子機(jī)制尚未闡明,因此該文使用冠菌素(COR)誘導(dǎo)橡膠樹形成層分化產(chǎn)生次生乳管的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),以分離形成層組織為材料,構(gòu)建酵母雙雜交cDNA文庫,以HbHDA6基因?yàn)檎T餌來篩選酵母雙雜交文庫,確定與HbHDA6相互作用的蛋白。結(jié)果表明:(1)利用Gateway技術(shù)構(gòu)建的均一化COR誘導(dǎo)橡膠樹形成層組織的酵母雙雜交cDNA文庫,初級文庫的容量為6.34×106 CFU·mL-1,總單克隆數(shù)為1.27×107,文庫重組率為100%;次級文庫的容量為7.72×106 CFU·mL-1,總單克隆數(shù)為1.54×107,文庫重組率為100%。初級文庫和次級文庫的插入片段平均長度分別為1.1 kb和1.2 kb。(2)成功構(gòu)建了篩選 HbHDA6互作蛋白的pGBKT7-HbHDA6誘餌載體,并確認(rèn)無自激活活性。(3)使用該誘餌載體對構(gòu)建的酵母雙雜交cDNA文庫進(jìn)行篩選,并通過NCBI_BLAST比對和去除重復(fù)以后,獲得了22個(gè)與HbHDA6發(fā)生互作的蛋白,包括CLP1、ERF3、ERF4、HSP82、LARP6a、APT5、PP2A、FBA6等。該研究成果為解析組蛋白乙?;揎椪{(diào)控橡膠樹次生乳管分化的分子機(jī)制提供了理論基礎(chǔ),為轉(zhuǎn)基因改良橡膠樹的產(chǎn)膠潛力提供了候選基因,為高性能天然橡膠遺傳改良育種提供了新線索。
關(guān)鍵詞:巴西橡膠樹,次生乳管分化,維管形成層,酵母雙雜交,HbHDA6
中圖分類號:Q943 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:1000-3142(2024)02-0245-12
基金項(xiàng)目:海南省自然科學(xué)基金高層次人才項(xiàng)目(322RC781);國家自然科學(xué)基金(31800577);現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-33-YZ1)。
第一作者:張世鑫(1986-),博士,副研究員,主要從事橡膠樹乳管發(fā)育和分子育種研究,(E-mail) zhangshixin_1@163.com。
*通信作者:田維敏,博士,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事橡膠樹分子育種研究,(E-mail)wmtian@163.com。
Construction of yeast two-hybrid cDNA library in cambium tissue of Hevea brasiliensis and screening of HbHDA6 interacting proteins ZHANG Shixin 1, WU Shaohua 1, YANG Shuguang1, CHAO Jinquan1,
SHI Minjing1, GE Lixin1,2, JIANG Yi1,2, TIAN Weimin1*
( 1. Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / National Key Laboratory for Tropical Crop Breeding / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree, Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Hainan Key Laboratory for Cultivation amp;
Physiology of Tropical Crops, Haikou 571101, China; 2. Tibet Agricultural and Animal Husbandry University, Nyingchi 860000, Xizang, China )
Abstract: The secondary laticifer is the position for synthesis and storage of natural rubber (NR), which is differentiated from the vascular cambium cells of bark in stem of rubber trees (Hevea brasiliensis). The quantity of secondary laticifer is depended on the frequency of the secondary laticifer differentiation from cambia, which is the main index of yield breeding of rubber tree. In previous studies, we found trichostatin A (TSA), an inhibitor of histone deacetylase (HDA), can also induce laticifer differentiation, and the histone deacetylase gene (HbHDA6) is a participator in laticifer differentiation. Because of the molecular mechanism of secondary laticifer differentiation regulated by histone acetylation has not been clarified. Therefore, we construct a yeast two-hybrid cDNA library used the vascular cambium tissues treatment by coronatine (COR), and screening the yeast two-hybrid library by HbHDA6 gene as the bait, for determining the proteins interacting with HbHDA6. The results were as follows: (1) The homogenized yeast two-hybrid cDNA library of vascular cambium was" constructed by the technology of Gateway. The capacity of the primary library was 6.34×106" CFU·mL-1, the total number of clones was 1.27×107, and the capacity of secondary library was 7.72×106 CFU·mL-1, the total number of clones was 1.54×107, and the recombination rates of two libraries were 100%. The average length of inserted fragments was 1.1 kb and 1.2 kb in primary and secondary library, respectively. (2) The bait vector of pGBKT7-HbHDA6 for screening the proteins interacting with HbHDA6 was successfully constructed and confirmed no self-activation activity. (3) The pGBKT7-HbHDA6 bait vector was used to screen the constructed yeast two-hybrid cDNA library, and 22 proteins interacting with HbHDA6 were obtained by NCBI_BLAST comparison and removing duplicates, including CLP1, ERF3, ERF4, HSP82, LARP6a, APT5, PP2A, APT5, FBA6, etc. The results provide a theoretical basis for analyzing the molecular regulatory network of the secondary laticifer differentiation of rubber tree, and provide candidate genes for the rubber production potential of genetically modified and a new clue for the genetic improvement and breeding of high-performance NR.
Key words: Hevea brasiliensis, secondary laticifer differentiation, vascular cambium, yeast two-hybrid, HbHDA6
天然橡膠是關(guān)系國民生計(jì)的重要工業(yè)原料和戰(zhàn)略物資,世界所需的天然橡膠主要來自巴西橡膠樹(Hevea brasiliensis)(田維敏等,2015)。橡膠樹樹干樹皮中的次生乳管是天然橡膠合成和貯存的主要場所,是由維管形成層紡錘狀原始細(xì)胞分化而來(Gomez, 1982;Hao amp; Wu, 2000;Chao et al., 2023)。隨著形成層分化的次生乳管不斷向外推移,要經(jīng)過幼嫩—成熟—衰老—死亡,為維持產(chǎn)膠部位的乳管數(shù)量,需要形成層不斷分化出新的次生乳管。這些次生乳管的數(shù)量與天然橡膠產(chǎn)量直接相關(guān),次生乳管數(shù)量取決于維管形成層分化次生乳管的頻率(即次生乳管分化能力),是橡膠樹產(chǎn)量育種的主要指標(biāo)(田維敏等,2015;Chao et al., 2023)。前期研究中,我們團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)外施茉莉酸(jasmonic, JA)及其前體亞麻酸(linolenic acid,LA)能誘導(dǎo)形成層細(xì)胞分化成次生乳管(Hao amp; Wu, 2000;劉惠芳等,2001;Tian et al., 2003);我們后續(xù)又發(fā)現(xiàn)與JA的活性形式JA-Ile結(jié)構(gòu)相似的冠菌素(coronatine, COR)(Ichihara et al., 1977),在誘導(dǎo)橡膠樹次生乳管分化的效應(yīng)方面比茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)更好(張世鑫等,2011;Zhang amp; Tian,2015),并建立了一種穩(wěn)定的COR誘導(dǎo)橡膠樹萌條次生乳管分化的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(Zhang amp; Tian, 2015;Zhang et al., 2015, 2016;Wu et al., 2016, 2023;張世鑫等,2018)。最近,我們發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙?;福╤istone deacetylase,HDA)的抑制劑——曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)也能誘導(dǎo)橡膠樹次生乳管分化(Zhang et al., 2016),使用COR處理能夠顯著提高形成層區(qū)的組蛋白乙?;潭惹襀DA活性和含量也受影響?;谶@些工作基礎(chǔ),以及組蛋白乙?;揎椬鳛榛蜣D(zhuǎn)錄調(diào)控的重要方式,我們推測JA誘導(dǎo)橡膠樹次生乳管分化,可能是通過組蛋白乙酰化修飾調(diào)控橡膠樹次生乳管分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄而實(shí)現(xiàn)的。
酵母雙雜交技術(shù)(yeast two-hybrid technology)是研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典技術(shù)之一,是由Fields和 Song等人在研究真核生物基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中提出并初步建立的(Fields, 1993)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,在酵母雙雜交的基礎(chǔ)上又建立了酵母單雜交、膜體系酵母雙雜交、酵母三雜交等多項(xiàng)技術(shù),用于蛋白-蛋白、蛋白-DNA/RNA/配體之間相互作用的研究,在功能基因組學(xué)和互作組學(xué)研究中發(fā)揮重要作用。利用酵母雙雜交系統(tǒng)能夠快速、直接分析已知蛋白之間的相互作用,并能尋找、分離與已知蛋白相互作用的配體,在研究抗原和抗體相互作用、發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的新功能、篩選藥物作用位點(diǎn)及藥物對蛋白互作影響、建立基因組蛋白連鎖圖等方面應(yīng)用廣泛。與Pull down技術(shù)、凝膠阻滯技術(shù)(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)和表面等離子體共振技術(shù)(surface plasmon resonance, SPR)等體外的蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)相比,酵母雙雜交技術(shù)能夠更好地模擬細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境,可以更真實(shí)地反映蛋白質(zhì)之間的相互作用情況(Phizicky amp; Fields, 1995)。酵母雙雜交系統(tǒng)的建立是基于對真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程的認(rèn)識,真核生物中基因轉(zhuǎn)錄需要反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與,真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子含有兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域,即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(binding domain,BD)和DNA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain,AD),這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域能夠獨(dú)立分開且功能相互不影響。BD和AD分別單獨(dú)起作用時(shí),是不能激活轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的,只有當(dāng)BD和AD兩者在空間上充分接近時(shí),才能發(fā)揮完整的轉(zhuǎn)錄激活因子活性,促使下游基因的轉(zhuǎn)錄。酵母雙雜交技術(shù)的這種特點(diǎn)使其成為了鑒定與已知蛋白發(fā)生相互作用的未知蛋白質(zhì)的常用實(shí)驗(yàn)技術(shù),并且在解析蛋白與蛋白間的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起著重要作用(Paiano et al., 2019)。
酵母雙雜交cDNA文庫構(gòu)建技術(shù)在橡膠樹分子生物學(xué)研究中也有廣泛的應(yīng)用,如巴西橡膠樹膠乳酵母雙雜交cDNA表達(dá)文庫(楊子平等,2013)、巴西橡膠樹膠乳均一化酵母雙雜交cDNA文庫(余海洋等,2016)、橡膠葉片和膠乳的cDNA文庫(歐陽沫等,2016)、巴西橡膠樹地上部地下部均一化酵母雙雜交cDNA文庫(陳洪舉等,2017)、橡膠樹未開割樹和開割樹膠乳的酵母雙雜交cDNA文庫(晁金泉等,2021)、橡膠樹膜系統(tǒng)酵母雙雜交cDNA文庫(聶智毅等,2022)等。由于組蛋白乙?;揎椪{(diào)控橡膠樹乳管分化的分子機(jī)制尚未闡明,而酵母雙雜交文庫構(gòu)建和文庫篩選能夠獲得大量的蛋白質(zhì)相互作用信息,因此使用該技術(shù)構(gòu)建橡膠樹次生乳管分化分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有顯著的優(yōu)勢。本文使用冠菌素(COR)誘導(dǎo)橡膠樹形成層分化次生乳管的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),以分離形成層組織為材料,構(gòu)建酵母雙雜交cDNA文庫,以HbHDA6基因?yàn)檎T餌來篩選酵母雙雜交文庫,篩選與HbHDA6相互作用的蛋白。旨在通過酵母雙雜交技術(shù)篩選出組蛋白乙酰化修飾調(diào)控橡膠樹次生乳管分化的基因或轉(zhuǎn)錄因子,為解析橡膠樹次生乳管分化的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供理論基礎(chǔ),為轉(zhuǎn)基因改良橡膠樹的產(chǎn)膠潛力提供候選基因,為高性能天然橡膠遺傳改良育種提供新線索。
1 材料與方法
1.1 材料
植物材料為巴西橡膠樹無性系熱研7-33-97的一年生萌條,種植在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所的五隊(duì)增殖苗圃內(nèi),這些萌條每年都經(jīng)過鋸桿,并通過基部的潛伏芽重新生長新的萌條,并在一年內(nèi)生長5~6個(gè)伸長單位(extension unit, EU)(張世鑫等,2011)。
主要試劑和耗材:RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(DP441)、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(DP204)、質(zhì)粒小提試劑盒(DP103)、酵母質(zhì)粒提取試劑盒(DP112)[購于天根生化科技(北京)有限公司];mRNA分離及cDNA建庫使用的試劑,即FastTrack? MAG mRNA isolation Kit (K158002)、LR ClonaseTM Ⅱ Enzyme Mix (11791-020)、UltraPureTM Phenol∶Chloroform∶Isoamyl Alcohol (25∶24∶1, V/V/V) (15593-031)、5 M Ammonium Acetate (AM9070G)、PureLink? HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit (K2100-15)、ElectroMAXTM DH10BTM T1 Phage Resistant Cells (12033-015),以上均購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司;Carrier DNA、培養(yǎng)基YPDA、培養(yǎng)基YPD plus、SD/Trp、SD/Leu、SD/His/Leu/Trp (TDO)、SD/Ade/His/Leu/Trp (QDO)、Aureobasidin A、X-α-Gal均購自Clontech公司;FastPfu DNA Polymerase (AP221-01)購于北京全式金生物技術(shù)股份有限公司;冠菌素(coronatine, COR)、DMSO、乙酰丁香酮(acetosyringone)、MES、MgCl2、PEG、TE、LiAc等試劑均購于Sigma公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純,槍頭和離心管均為Axygen公司產(chǎn)品。
1.2 冠菌素(COR)處理植物材料
選取一年生橡膠樹萌條的第三伸長單位(EU3),節(jié)間長且健壯的樹干作為實(shí)驗(yàn)材料,在EU3樹干中部,使用單面刀片刮去面積為2 cm×4 cm的莖表皮及部分皮層,用面積略大的滅菌無塵紙包裹處理部位,施加含有6 μg·mL-1的COR溶液,用塑料封口膜纏繞并密封包裹。處理時(shí)間分別為0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、1 d、2 d和3 d。然后拆去塑料封口膜和無塵紙,切取處理部位的樹皮(帶部分木質(zhì)部),并立即分割成小塊,置于2 mL離心管中,液氮速凍。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的形成層區(qū)樣品取自5株橡膠樹萌條進(jìn)行混合,并且每個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行3組生物學(xué)重復(fù),即每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的共計(jì)處理15株橡膠樹萌條。
1.3 總RNA提取及mRNA 的純化
使用冰凍切片弦切的方法收集橡膠樹樹皮的形成層區(qū)組織,使用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(天根,DP441)提取總RNA。通過微量紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度和純度,使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性后,合格的總RNA樣品于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。將得到的不同時(shí)間段COR處理的形成層區(qū)組織總RNA進(jìn)行等量混合,利用磁珠法FastTrack? MAG mRNA isolation Kit (Invitrogen, K158096)對總RNA中的mRNA進(jìn)行分離純化,將mRNA進(jìn)行等量混合后,用于后續(xù)的酵母雙雜交文庫構(gòu)建。
1.4 酵母雙雜交文庫的構(gòu)建
用Gateway重組技術(shù),使用CloneMinerTM Ⅱ cDNA文庫構(gòu)建試劑盒能夠快速構(gòu)建cDNA文庫。操作流程:將分離純化并等量混合后的mRNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,先合成cDNA第一鏈后合成cDNA雙鏈,再將得到的雙鏈cDNA進(jìn)行分級分離并收集。使用LR ClonaseTM Ⅱ Enzyme Mix進(jìn)行BP重組反應(yīng);使用BTX指數(shù)衰減波電穿孔儀ECM630進(jìn)行電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌ElectroMAX DH10B感受態(tài)細(xì)胞中。將電轉(zhuǎn)化后的菌液,在搖床里37℃、220 r·min-1活化培養(yǎng)1 h。培養(yǎng)結(jié)束后,取一部分菌液涂布平板進(jìn)行初級文庫容量、重組率和插入片段長度的鑒定。剩余的菌液加入甘油,至終濃度20%,于-80℃保存,即得到COR誘導(dǎo)橡膠樹形成層組織的cDNA初級文庫菌液。
將上一步驟中驗(yàn)證合格的cDNA初級文庫,使用PureLink? HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit (Life, K2100-15)提取文庫質(zhì)粒。將得到的初級文庫質(zhì)粒,稀釋到300 ng·μL-1,使用LR ClonaseTM Ⅱ Enzyme Mix進(jìn)行文庫質(zhì)粒重組,并提取重組產(chǎn)物后使用BTX指數(shù)衰減波電穿孔儀ECM630將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌ElectroMAX DH10B感受態(tài)細(xì)胞中,然后進(jìn)行培養(yǎng),條件同上。取轉(zhuǎn)化后的10 μL菌液稀釋1 000倍,再取50 μL稀釋后的菌液,涂布LB平板(含鏈霉素抗性),37℃培養(yǎng)過夜。進(jìn)行次級文庫容量、重組率和插入片段長度的鑒定。剩余的菌液加入甘油,至終濃度20%,于-80℃保存,即得到COR誘導(dǎo)橡膠樹形成層組織的cDNA次級文庫菌液。文庫的細(xì)菌菌落總數(shù)(CFU)計(jì)算方法如下:
CFU濃度(CFU·mL-1)=平板上的克隆數(shù)/50 μL×1 000倍×1 000 μL;
文庫總CFU=CFU濃度×文庫菌液總體積(mL)。
1.5 HbHDA6誘餌質(zhì)粒構(gòu)建、鑒定及自激活檢測
HbHDA6誘餌質(zhì)粒構(gòu)建時(shí),先對含有目的基因HbHDA6的載體進(jìn)行PCR擴(kuò)增后,進(jìn)行Sfi I酶切,獲得目的基因HbHDA6的克隆片段。使用Sfi I酶切,獲得線性化的酵母雙雜交誘餌載體(pGBKT7),再將目的基因HbHDA6的克隆片段連接到線性化的誘餌載體(pGBKT7)上。
具體操作如下:根據(jù)HbHDA6基因的cDNA序列,設(shè)計(jì)引物時(shí)分別在其兩端添加Sfi I的酶切位點(diǎn)序列,用于擴(kuò)增HbHDA6基因的cDNA片段。引物序列為HbHDA6-F(5′-aaggccattacggccATGGGCGACACAACCGGTGGT-3′)和HbHDA6-R(5′-ccggccgaggcggccTCAAGAACGCGGATGCTCTTCTCTCT-3′)。并按照FastPfu DNA Polymerase (AP221-01)高保真酶體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增,使用Sfi I進(jìn)行HbHDA6擴(kuò)增片段的酶切和pGBKT7載體的線性化。使用Axygen膠回收試劑盒進(jìn)行酶切產(chǎn)物回收。將回收的酶切產(chǎn)物,連接轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10中,在37℃條件下恒溫培養(yǎng)過夜。從上述連接體系轉(zhuǎn)化平板(含鏈霉素抗性)上隨機(jī)挑取4個(gè)大腸桿菌轉(zhuǎn)化子接種于LB液體培養(yǎng)基,37℃、220 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)16 h后,用pGBKT7載體的通用引物pGBKT7-F(5′-TAATACGACTCACTATAGGGC-3′)和pGBKT7-R(5′-TAAGAGTCACTTTAAAATTT
GTAT-3′),進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證,并使用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測,對擴(kuò)增得到陽性條帶的克隆,進(jìn)行質(zhì)粒抽提(Axygen質(zhì)粒小量抽提試劑盒)和測序。插入片段測序結(jié)果在比對確認(rèn)正確后,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照表1構(gòu)建不同質(zhì)粒和涂布不同類型的平板,將各種質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母受體菌株AH109中,觀察并檢測結(jié)果。
從pGADT7+pGBKT7-HbHDA6共轉(zhuǎn)化AH109長出的酵母轉(zhuǎn)化子中,隨機(jī)挑取了6個(gè)菌落,進(jìn)行自激活檢測,包括對HIS3、ADE2和MEL1共3個(gè)報(bào)告基因的檢測。對HIS3、ADE2和MEL1報(bào)告基因的檢測采用點(diǎn)板培養(yǎng)的方法。將轉(zhuǎn)化子點(diǎn)板于SD-TL+X-α-Gal和SD-TLHA平板,30℃恒溫培養(yǎng)4 d,觀察其生長狀態(tài)。在預(yù)先配制好的SD-TLHA板上各涂布200 μL X-α-Gal溶液,待X-α-Gal溶液被平板培養(yǎng)基完全吸收后,將轉(zhuǎn)化子菌液進(jìn)行點(diǎn)板并培養(yǎng)。
1.6 pGBKT7-HbHDA6誘餌質(zhì)粒篩選酵母文庫
用含有測序正確pGBKT7-HbHDA6誘餌質(zhì)粒的AH109酵母轉(zhuǎn)化子作為受體菌來制備酵母感受態(tài)細(xì)胞。將COR處理橡膠樹形成層組織的cDNA初級文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細(xì)胞中,并將其涂在SD-Trp-Leu-His+5 mmol·L-1 3AT平板上并倒置培養(yǎng)。從SD-Trp平板挑取單克隆菌斑,接種在SD-Trp液體培養(yǎng)基中,在30℃、220 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)18 h,再轉(zhuǎn)接到Y(jié)PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng),使用紫外分光光度計(jì),測定菌液測定初始濃度為OD600=0.2;在30℃、220 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)4~5 h,中途使用紫外分光光度計(jì)測定菌液的濃度,當(dāng)菌液濃度達(dá)到OD600=0.6即停止培養(yǎng)。將菌液離心并棄上清,重懸菌體。按照加入試劑的體積從大到小,依次加入9.6 mL的50% PEG3350,1.44 mL的1 mol·L-1 LiAc,300 μL的ssDNA (10 mg·mL-1) ,以及25 μg的文庫質(zhì)粒DNA,并混勻體系。在30℃條件下水浴孵育30 min后,在42℃條件下水浴熱激25 min,在30℃條件下水浴復(fù)蘇1 h,將復(fù)蘇后的菌液離心并重懸菌體。從重懸菌液中取20 μL酵母培養(yǎng)物經(jīng)梯度稀釋后,分別涂在3塊SD-TL平板上,用于酵母文庫的轉(zhuǎn)化效率檢測。剩余的酵母培養(yǎng)物涂在SD-TLH + 5 mmol·L-1 3AT平板上,每塊平板涂200 μL,共涂40塊平板。在30℃條件下恒溫倒置培養(yǎng)3~4 d,觀察并記錄轉(zhuǎn)化結(jié)果,分析轉(zhuǎn)化效率。
1.7 陽性克隆鑒定和測序分析
在pGBKT7-HbHDA6誘餌質(zhì)粒篩選酵母雙雜交文庫的平板中,挑取陽性克隆的單菌落,轉(zhuǎn)接到SD-TL缺陷型培養(yǎng)基平板中,在30℃條件下恒溫倒置培養(yǎng)2~3 d。將在SD-TL缺陷型培養(yǎng)基平板上長出的初始陽性克隆轉(zhuǎn)化子分別用無菌水稀釋后,接種到SD-TL和SD-TLHA+X-α-Gal缺陷平板上,進(jìn)行HIS3、ADE2和MEL1報(bào)告基因的檢測,在30℃條件下恒溫培養(yǎng)3~4 d。
對HIS3、ADE2和MEL1報(bào)告基因進(jìn)行檢測,顯示結(jié)果為陽性對照在SD-TL和SD-TLHA+X-α-Gal缺陷型培養(yǎng)基平板上都能正常生長,并且SD-TLHA+X-α-Gal缺陷型培養(yǎng)基平板上的菌落呈現(xiàn)藍(lán)色;陰性對照由于不會激活HIS3和ADE2報(bào)告基因,雖然在SD-TL缺陷型培養(yǎng)基平板上可以正常生長,但菌落不呈現(xiàn)藍(lán)色,而在缺少Histidine和Adenine這兩種成分的SD-TLHA+X-α-Gal缺陷型培養(yǎng)基平板上不能生長。因此,初始陽性克隆能在SD-TLHA+X-α-Gal缺陷型培養(yǎng)基平板上生長并使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色,表明同時(shí)激活了HIS3、ADE2和MEL1 3個(gè)報(bào)告基因。
為了鑒定篩選到的陽性克隆的基因信息,將上述陽性克隆的菌株,分別接種于SD-TL缺陷型液體培養(yǎng)基中,在30℃、220 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)16 h。使用酵母質(zhì)粒提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司,DP112]提取并純化出酵母質(zhì)粒。將提取純化好的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增,在37℃、220 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)16 h,使用大腸桿菌質(zhì)粒小提試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司,DP103]提取大腸桿菌質(zhì)粒后并送樣至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行DNA測序。將DNA測序結(jié)果與NCBI_GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行BLAST比對分析,獲得與HbHDA6發(fā)生相互作用的基因信息。
2 結(jié)果與分析
2.1 橡膠樹樹皮的形成層區(qū)組織分離、總RNA提取和mRNA分離純化
使用冰凍切片弦切的方法分離COR處理的一年生橡膠樹萌條樹皮形成層區(qū)組織(圖1:A),通過光學(xué)顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)冰凍切片得到橡膠樹樹皮的形成層組織沒有雜質(zhì),并且絕大多數(shù)形成層區(qū)細(xì)胞呈長梭形且排列致密,幾乎沒有其他類型的細(xì)胞(圖1:B)。
利用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(DP441)提取的形成層組織的總RNA,使用Thermo NanoDrop2 000微量紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度和純度,發(fā)現(xiàn)總RNA的濃度較高,平均為1 642.98 ng·μL-1,A260/A280的平均值為2.11,A260/A230的平均值為2.13;經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果顯示28S rRNA和18S rRNA條帶清晰,兩個(gè)條帶的亮度比值約為2∶1,說明提取的總RNA沒有降解(圖1:C)。本實(shí)驗(yàn)中提取的COR不同時(shí)間段處理橡膠樹形成層組織的總RNA質(zhì)量較好,可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
將8個(gè)時(shí)間點(diǎn)的COR處理形成層區(qū)組織總RNA進(jìn)行等量混合后,利用磁珠法FastTrack? MAG mRNA isolation Kit (Invitrogen, K158096) 對總RNA中的mRNA進(jìn)行分離純化,得到的mRNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果顯示分化純化的mRNA呈彌散的條帶且均勻分布(圖1:D),表明分離純化得到的mRNA質(zhì)量較好,可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
2.2 cDNA初級文庫和次級文庫的構(gòu)建和鑒定
將COR處理橡膠樹形成層區(qū)組織的cDNA初級文庫菌液涂板并培養(yǎng)后(圖2:A),進(jìn)行cDNA初級文庫容量、重組率和插入片段長度的鑒定。結(jié)果表明,cDNA初級文庫轉(zhuǎn)化平板的容量(平板稀釋度為1∶1 000)=317/50 μL×1 000×1 000 μL=6.34×106 "CFU·mL-1,高于文庫構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)要求1×106 "CFU·mL-1;總克隆數(shù)為6.34×106 CFU·mL-1×2 mL≈1.27×107,也高于文庫構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)1×107。并對cDNA初級文庫的菌斑進(jìn)行檢測,隨機(jī)調(diào)取24個(gè)菌斑進(jìn)行PCR鑒定,發(fā)現(xiàn)插入效率為100%,插入片段長度分布于0.6~1.2 kb之間,平均插入片段長度為1.1 kb(圖2:C)。
將COR處理橡膠樹形成層區(qū)組織的cDNA次級文庫菌液涂板并培養(yǎng)后(圖2:B),進(jìn)行cDNA次級文庫容量、重組率和插入片段長度的鑒定。結(jié)果表明,cDNA次級文庫轉(zhuǎn)化平板的容量(平板稀釋度1∶1 000)=386/50 μL×1 000×1 000 μL=7.72×106 CFU·mL-1,高于文庫構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)要求1×106 CFU·mL-1;總克隆數(shù)為7.72×106 CFU·mL-1×2 mL≈1.54×107,也高于文庫構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)1×107。并cDNA次級文庫的菌斑進(jìn)行檢測,隨機(jī)挑取24個(gè)克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定,發(fā)現(xiàn)插入效率為100%,插入片段長度分布于1.0~1.6 kb之間,平均插入片段長度為1.2 kb(圖2:D)。
綜上所述,本研究構(gòu)建的COR處理橡膠樹萌條樹皮形成層區(qū)組織的酵母雙雜交cDNA文庫質(zhì)量較好,可用于后續(xù)的HbHDA6互作蛋白的篩選和鑒定實(shí)驗(yàn)。
2.3 HbHDA6誘餌質(zhì)粒構(gòu)建、鑒定及自激活檢測
將含有HbHDA6基因的載體進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得了約1.7 kb的條帶(圖3:A),經(jīng)過與目的基因的DNA序列進(jìn)行測序比對,顯示為HbHDA6的編碼框。經(jīng)過Sfi I酶切,獲得該目的基因HbHDA6的克隆片段,并與Sfi I酶切的線性化酵母雙雜交誘餌載體質(zhì)粒pGBKT7載體進(jìn)行連接,獲得酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒pGBKT7-HbHDA6。經(jīng)過菌落PCR檢測,發(fā)現(xiàn)條帶大小均為1.7 kb(圖3:B),并且測序結(jié)果顯示目的基因的DNA序列比對正確,可進(jìn)行后續(xù)的誘餌質(zhì)粒的自激活檢測實(shí)驗(yàn)。
通過自激活檢測實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對照菌株在SD-TL缺陷型平板上都能正常生長,而僅有陽性對照pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53可在SD-TLHA+X-α-Gal缺陷平板生長。然而,在含有目的基因的pGADT7+pGBKT7-HDA6轉(zhuǎn)化子中隨機(jī)挑選的6個(gè)菌落在SD-TLHA+X-α-Gal缺陷平板上均不能生長,生長狀態(tài)同陰性對照pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC一樣,MEL1檢測中結(jié)果也與陰性對照相同,因此不存在自激活(圖3:C)。
將COR處理橡膠樹萌條樹皮形成層區(qū)組織的酵母雙雜交cDNA文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)入,用含有正確pGBKT7-HDA6誘餌質(zhì)粒的AH109酵母轉(zhuǎn)化子作為受體菌來制備感受態(tài)細(xì)胞,從中取20 μL酵母培養(yǎng)物經(jīng)梯度稀釋后,分別涂3塊SD-TL平板來檢測文庫轉(zhuǎn)化效率(圖3:D)。對平板的菌斑進(jìn)行計(jì)數(shù),結(jié)果顯示HbHDA6基因篩選文庫的轉(zhuǎn)化子總數(shù)為 (3 978/20+2 038/2+286/0.2)×1/3×8 000≈7.06×106,轉(zhuǎn)化效率為7.06×106/25·μg-1≈2.82×105·μg-1。
HIS3、ADE2和MEL1報(bào)告基因的檢測結(jié)果顯示,陽性對照在SD-TL+X-α-Gal和SD-TLHA缺陷型培養(yǎng)基上都能正常生長,并使菌落呈藍(lán)色,而陰性對照由于不會激活HIS3和ADE2報(bào)告基因,在SD-TL缺陷型培養(yǎng)基上可以正常生長但菌落不顯藍(lán)色,而在缺少Histidine和Adenine這兩種成分的SD-TLHA培養(yǎng)基平板上不能生長。因此,本文獲得的24個(gè)初始陽性克隆,能在SD-TLHA生長并使菌落顯藍(lán)色,表明同時(shí)都激活了HIS3、ADE2和MEL1報(bào)告基因(圖3:E)。A和B分別為HbHDA6的PCR擴(kuò)增和連接誘餌質(zhì)粒后的電泳圖;C為HbHDA6誘餌質(zhì)粒自激活檢測結(jié)果;D為HbHDA6基因篩選的文庫轉(zhuǎn)化效率分析圖;E為酵母文庫篩選得到的陽性克隆檢測圖。
2.4 陽性克隆鑒定和互作蛋白分析
為了鑒定pGBKT7-HDA6誘餌質(zhì)粒篩選到的陽性克隆基因信息,將以上陽性克隆菌株分別接入SD-TL液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過夜并提取純化酵母質(zhì)粒,再將抽提得到的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10新鮮感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增,將含有陽性克隆的Top10轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增后抽提大腸桿菌質(zhì)粒,進(jìn)行DNA測序分析,并與NCBI_GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行BLAST比對分析。BLAST比對結(jié)果(表2)顯示,篩選到與HbHDA6基因相互作用的陽性克隆質(zhì)粒DNA,去除重復(fù)外,分別屬于22種蛋白編碼基因。
根據(jù)UniProt的蛋白信息預(yù)測,可將與HbHDA6互作的22種蛋白分為氧化還原酶、水解酶、蛋白/DNA/RNA結(jié)合、運(yùn)輸、異構(gòu)酶、染色質(zhì)調(diào)節(jié)劑和糖蛋白7個(gè)類別,其中水解酶、氧化還原酶、蛋白/DNA/RNA結(jié)合3個(gè)類別的蛋白較多。根據(jù)亞細(xì)胞定位的結(jié)果顯示這22種蛋白在細(xì)胞各個(gè)部位都有分布,其中亞細(xì)胞定位在細(xì)胞膜、葉綠體、線粒體和細(xì)胞核4個(gè)類別的蛋白相對較多。
3 討論與結(jié)論
從動植物組織或細(xì)胞中提取的總RNA和純化的mRNA是構(gòu)建酵母雙雜交cDNA文庫的起始材料,能夠獲得高質(zhì)量的總RNA和mRNA是構(gòu)建高質(zhì)量酵母雙雜交cDNA文庫的前提(Gao et al., 2014)。本研究中的橡膠樹樹皮的維管形成層組織是夾在韌皮部和木質(zhì)部之間,為幾層至十幾層形成層紡錘狀細(xì)胞組成且排列精密,較難獲取到完整且純凈的形成層組織。前期研究中,我們發(fā)現(xiàn)橡膠樹萌條形成層細(xì)胞層數(shù)有明顯規(guī)律,在海南島每年春季新梢生長期(3—4月),樹干的形成層區(qū)開始分裂分化活動,此時(shí)形成層的細(xì)胞層數(shù)最少(約4層)(Wu et al., 2002),而7—8月正值高溫高濕環(huán)境,利于橡膠樹萌條生長和維管形成層細(xì)胞分裂活動,此時(shí)形成層的細(xì)胞層數(shù)量多(10~11層)(張世鑫等,2011)。本文在7—8月時(shí),采集萌條EU3的節(jié)間樹皮樣品,此時(shí)的形成層細(xì)胞量多且EU3的次生韌皮部未分化出次生乳管,能夠獲得量多且純凈的形成層區(qū)組織。使用冰凍切片弦切獲取形成層區(qū)組織,光學(xué)鏡檢發(fā)現(xiàn)冰凍切片得到橡膠樹樹皮的形成層區(qū)組織沒有雜質(zhì),絕大多數(shù)形成層區(qū)細(xì)胞呈長梭形且排列緊密。因此,從有限的組織材料中,也能提取出含量較高、質(zhì)量較好總RNA。后續(xù)使用成熟的磁珠法技術(shù)分離純化mRNA,獲得的mRNA捕獲率和成功率都很高(Albretsrn et al., 1990),保證了后續(xù)構(gòu)建酵母雙雜交cDNA文庫研究所需的高質(zhì)量總RNA和mRNA。使用mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,在均一化前后都進(jìn)行一輪LD-PCR,這樣通過兩輪的LD-PCR放大,不但能夠保證在起始總RNA較少的情況下純化收集到足夠量的cDNA用于文庫構(gòu)建,而且能夠使低豐度的基因得到增加,相應(yīng)地提高了篩庫篩到低豐度基因的概率(楊子平等,2013;余海洋等,2016)。
對酵母雙雜交cDNA文庫質(zhì)量評判主要從3個(gè)重要的數(shù)據(jù)來分析,分別為酵母雙雜交文庫的單克隆數(shù)、重組率和插入片段長度。酵母雙雜交文庫的單克隆數(shù)代表了構(gòu)建的cDNA文庫完整性和覆蓋度,插入片段的長度代表了cDNA文庫包含基因的完整性(Van amp; Beyaert, 1996)。cDNA文庫的單克隆是保證cDNA文庫完整性和覆蓋度的一個(gè)重要指標(biāo),文庫單克隆數(shù)大于1×106 是文庫篩選所必須的(李可琪等,2016)。一方面,本文中利用GatewayTM技術(shù)構(gòu)建了茉莉酸誘導(dǎo)橡膠樹次生乳管分化形成層組織的均一化酵母雙雜交cDNA文庫,初級文庫容量為6.34×106 CFU·mL-1,總單克隆數(shù)為1.27×107,次級文庫的容量為7.72×106 CFU·mL-1,總單克隆數(shù)為1.54×107,文庫重組率均為100%,這些數(shù)值均要高于酵母雙雜交cDNA文庫構(gòu)建的基本要求。另一方面,構(gòu)建的酵母雙雜交cDNA初級文庫和次級文庫的插入片段平均長度分別為1.1 kb和1.2 kb,這個(gè)數(shù)值是接近于本文使用的橡膠樹熱研7-33-97基因組序列中公布的CDS平均長度(Tang et al., 2016)。由此可見,本文構(gòu)建的COR處理橡膠樹萌條樹皮形成層組織的酵母雙雜交文庫的單克隆數(shù)、重組率和插入片段長度均達(dá)到較高水平,滿足酵母雙雜交文庫篩選的工作。
前期研究中,本團(tuán)隊(duì)最早發(fā)現(xiàn)外施茉莉酸(JA)及其前體亞麻酸(LA)能誘導(dǎo)形成層細(xì)胞分化次生乳管(Hao amp; Wu, 2000;Tian et al., 2003),與茉莉酸的活性形式JA-Ile結(jié)構(gòu)相似的COR可以與COI1受體結(jié)合,激活JA信號途徑(Katsir et al., 2008),其誘導(dǎo)橡膠樹乳管分化的效應(yīng)比MeJA更好(張世鑫等,2011)。據(jù)此,我們建立了一種穩(wěn)定的COR誘導(dǎo)橡膠樹萌條次生乳管分化的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),在COR處理后的5 d內(nèi)可以觀察到誘導(dǎo)形成的次生乳管(Zhang amp; Tian, 2015;Zhang et al., 2015, 2016;Wu et al., 2016, 2023;張世鑫等,2018)。近期我們發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙酰化酶(HDA)的抑制劑——曲古抑菌素A(TSA)不但能夠誘導(dǎo)橡膠樹次生乳管分化(Zhang et al., 2016),而且COR處理能夠顯著提高形成層區(qū)的組蛋白乙?;潭群虷DA活性,尤其是HDA6的含量和基因表達(dá)都受COR的影響(未發(fā)表資料)。基于這些工作基礎(chǔ)以及組蛋白乙?;揎椬鳛榛虮磉_(dá)調(diào)控的重要方式,本文構(gòu)建了COR處理橡膠樹萌條樹皮形成層組織的酵母雙雜交文庫,并通過HbHDA6誘餌載體進(jìn)行酵母雙雜交文庫篩選,共篩選到與HbHDA6基因相互作用的22種蛋白。根據(jù)UniProt的蛋白信息預(yù)測,這些蛋白可分為氧化還原酶、水解酶、蛋白/DNA/RNA結(jié)合、運(yùn)輸、異構(gòu)酶、染色質(zhì)調(diào)節(jié)劑和糖蛋白7個(gè)類別,其中水解酶、氧化還原酶、蛋白/DNA/RNA結(jié)合3種類別的蛋白較多。亞細(xì)胞定位結(jié)果,顯示主要集中在細(xì)胞膜、葉綠體、線粒體和細(xì)胞核等。下一步,我們將對HbHDA6與這22個(gè)互作蛋白進(jìn)行點(diǎn)對點(diǎn)酵母雙雜交驗(yàn)證,解析這些蛋白的相互作用,為后續(xù)篩選組蛋白乙?;揎椪{(diào)控橡膠樹次生乳管分化的靶標(biāo)蛋白奠定基礎(chǔ),為構(gòu)建橡膠樹次生乳管分化的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供理論依據(jù)。
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(責(zé)任編輯 周翠鳴)