中國(guó)沙棘HrANR基因及黃酮類累積與抗旱的關(guān)系

摘 要：花青素還原酶（anthocyanidin reductase， ANR）是合成黃酮類物質(zhì)的關(guān)鍵酶之一，為明確其編碼基因結(jié)構(gòu)及干旱脅迫下的表達(dá)模式和黃酮類物質(zhì)含量及二者之間的相關(guān)性，該文從中國(guó)沙棘轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選獲得1個(gè)ANR基因，命名為HrANR基因。采用生物信息學(xué)軟件對(duì)基因序列及編碼蛋白進(jìn)行分析，并對(duì)不同脅迫下各組織中HrANR基因的表達(dá)量和葉中黃酮類化合物含量進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明：（1）中國(guó)沙棘HrANR基因ORF為1 017 bp，編碼338個(gè)氨基酸，為穩(wěn)定的親水性蛋白，其ANR同源蛋白具有明顯的科屬特性。（2）干旱脅迫下HrANR基因在中國(guó)沙棘根、莖、葉中均有表達(dá)，但表達(dá)趨勢(shì)不同，其中在根中的表達(dá)呈先升高后降低再升高的趨勢(shì)，在莖中呈持續(xù)下降的趨勢(shì)，在葉中呈先升高后持續(xù)降低的趨勢(shì)。（3）通過蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得不同脅迫程度下中國(guó)沙棘葉內(nèi)黃酮類的含量，表明黃酮類含量呈先持續(xù)上升，隨后略有下降，復(fù)水后上升至最高點(diǎn)的變化趨勢(shì)，表明干旱脅迫初期葉黃酮類含量與干旱脅迫呈正相關(guān)，在嚴(yán)重脅迫下黃酮類含量與脅迫呈負(fù)相關(guān)。（4）葉和莖的HrANR基因表達(dá)量與黃酮類含量呈負(fù)相關(guān)（P_葉=-0.751，P_莖=-0.934），根中呈正相關(guān)（P_根=0.444）。綜上表明，中國(guó)沙棘HrANR基因的表達(dá)及黃酮類含量變化與其抗旱性密切相關(guān)，其結(jié)果為中國(guó)沙棘抗旱機(jī)制的闡明提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：中國(guó)沙棘，花青素還原酶，干旱脅迫，表達(dá)模式，黃酮類

中圖分類號(hào)：Q943 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-3142（2024）02-0235-10

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（31660071）；青海省科技廳項(xiàng)目（2024-ZJ-941）；青海省“高端創(chuàng)新人才千人計(jì)劃”項(xiàng)目 （2022年度）。

第一作者：劉瑞（1995-），碩士研究生，主要從事植物遺傳育種研究，（E-mail）18714520216@163.com。

^*通信作者：馬玉花（1978-），博士，教授，主要從事森林培育理論與技術(shù)、植物資源開發(fā)利用的研究，（E-mail）qhxnmyh@163.com。

Correlation of HrANR genes and flavonoid accumulation with drought resistance in sea buckthorn （Hippophae rhamnoides subsp. sinensis）

LIU Rui， ZHAO Lang， YE Guisheng， MA Yuhua^*

（ College of Agriculture and Husbandry， Qinghai University， Xining 810016， China ）

Abstract： Anthocyanidin reductase is one of the key enzyme involved in the synthesis of flavonoids. In order to explore the structure of ANR gene， ANR enzyme expression pattern and flavonoid content under drought stress and their correlation， a HrANR gene identified from RNA-seq data of sea buckthorn was screened and analyzed by bioinformatics soft， the expression patterns of HrANR gene in different tissues and of flavonoid contents in leaves were performed. The results were as follows： （1） The ORF of HrANR gene was 1 017 bp， which encoded 338 amino acids. It was a stable hydrophilic protein， and the homologous protein had significant family and genus characteristics. （2） HrANR gene was expressed in roots， stems and leaves of sea buckthorn under drought stress， but the expression trends were different， with an increase followed by a decrease and then an increase in roots， a continuous decrease in stems， and an increase followed by a continuous decrease in leaves. （3） The flavonoid contents in" leaves of sea buckthorn under different levels of stress showed a trend that first increased continuously and then decreased slightly， increased to the highest point after rehydration. The above results indicated that the expression of HrANR gene and the changes of flavonoid content were closely related to the drought resistance of sea buckthorn. The flavonoid content in leaves was positively correlated with drought stress at the beginning of drought stress and negatively correlated with drought stress under severe stress. （4） Leaf expression， stem expression and flavonoid content of HrANR gene were negatively correlated （P_leaf=-0.751， P_stem=-0.934） and root expression was positively correlated with flavonoid content （P_root=0.444）. The above results indicate that the expression of HrANR genes and changes of flavonoid content in sea buckthorn are closely related to drought resistance， and it provides a reference for elucidating the drought resistance mechanism of sea buckthorn.

Key words： Hippophae rhamnoides subsp. sinensis， anthocyanidin reductase， drought stress， expression pattern， flavonoid

植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中經(jīng)常會(huì)遭受干旱、低溫、鹽堿及病蟲害等影響，其中干旱的危害居眾多生物和非生物脅迫之首，持續(xù)影響全球生態(tài)環(huán)境（Wang et al.， 2017；張寧，2021）。在受到干旱脅迫時(shí)，植物葉片最先反應(yīng)，通過關(guān)閉氣孔以減少蒸騰量、累積滲透調(diào)節(jié)物以維持細(xì)胞膨壓從而避免細(xì)胞器受損，此外，葉片還可通過累積酚類、萜類和生物堿等次生代謝產(chǎn)物來適應(yīng)周圍環(huán)境（Xie et al.，2020）。中國(guó)沙棘（Hippophae rhamnoides subsp. sinensis）是中國(guó)特有的沙棘屬沙棘（H. rhamnoides）種內(nèi)亞種，也是中國(guó)栽培和種植歷史最悠久的一個(gè)亞種（Wang et al.， 2014），具有很強(qiáng)的抗旱性且能夠保土固沙，在我國(guó)氣候干旱的黃土高原和青藏高原廣泛分布。

在沙棘中發(fā)現(xiàn)的黃酮類化合物50余種（周浩楠等，2020），其具有抗氧化、降血糖、降血壓及增強(qiáng)免疫等功能（陳秋榮，2012；張東和鄔國(guó)棟，2019；祁建宏和董芳旭，2020）。黃酮類化合物主要存在于植物的果實(shí)、根、莖、葉等部位，國(guó)內(nèi)學(xué)者通過對(duì)沙棘果渣、葉片、果實(shí)等不同部位的黃酮類化合物進(jìn)行分離、鑒定（康健等，2017；洪道鑫等，2017；魏增云等，2020），發(fā)現(xiàn)其葉片與果實(shí)中活性物質(zhì)一致且葉中含量最多（王軍憲等，1997）。類黃酮合成包括花青素、黃酮醇、原花青素等途徑，其中ANR基因編碼的花青素還原酶（anthocyanidin reductase， ANR）是以苯丙氨酸為底物合成原花色素的關(guān)鍵酶之一，作用于花青素形成表兒茶素，在木本植物中，如茶樹（Muralidaran et al.， 2014）、篤斯越橘（宋冰雪等，2017）、芒果（李先良等，2017）、葡萄（Zhu et al.， 2014）中均克隆出了ANR 基因，在香椿（隋娟娟等，2021）、紫花苜蓿（Xie et al.， 2004）、川桑（李軍等，2016）中的發(fā)現(xiàn)并證明其表達(dá)量與植物適應(yīng)性密切相關(guān)。高國(guó)日（2018）通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)中國(guó)沙棘主要通過以ABA依賴信號(hào)途徑為主的信號(hào)傳遞途徑和以黃酮類合成途徑為主的活性氧自由基清除途徑響應(yīng)干旱脅迫。上述研究結(jié)果表明，中國(guó)沙棘中黃酮類物質(zhì)對(duì)于其應(yīng)對(duì)干旱脅迫起著重要的作用，但目前在沙棘中黃酮類化合物研究?jī)H停留在提取純化和活性分析方面，有關(guān)中國(guó)沙棘黃酮類物質(zhì)合成相關(guān)基因與干旱脅迫的相關(guān)性及其與黃酮類含量變化間關(guān)系的研究尚未見報(bào)道。

本研究以中國(guó)沙棘轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出的差異表達(dá)HrANR基因?yàn)檠芯繉?duì)象，設(shè)計(jì)特異性引物，通過PCR擴(kuò)增獲取HrANR基因全序列并送測(cè)序；依托生物信息學(xué)軟件分析HrANR基因的序列信息及進(jìn)化關(guān)系；在以上基礎(chǔ)上采用回流法提取中國(guó)沙棘葉總黃酮，利用紫外分光光度計(jì)法測(cè)量總黃酮含量并通過統(tǒng)計(jì)軟件分析含量與基因表達(dá)的關(guān)系，擬討論以下幾個(gè)問題：（1）中國(guó)沙棘HrANR基因序列信息及其同源性；（2）干旱脅迫下HrANR基因的時(shí)間表達(dá)特性；（3）HrANR基因的時(shí)空表達(dá)與總黃酮含量是否存在直接關(guān)系。旨在為黃酮類與中國(guó)沙棘抗旱性之間的關(guān)系闡明提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采集青海省西寧市湟源縣（101°14′11″ E、36°46′24″ N，海拔3 010 m）的中國(guó)沙棘種子在青海省瑪可河育苗基地播種育苗，苗木培養(yǎng)采用張丹等（2021）的方法 ，待幼苗生長(zhǎng)至20 cm左右時(shí)，選擇健康且無(wú)病蟲害的一部分幼苗采集葉片進(jìn)行HrANR基因的擴(kuò)增，另外一部分進(jìn)行干旱脅迫處理。

1.2 干旱脅迫處理

選擇長(zhǎng)勢(shì)一致且無(wú)病蟲害的幼苗，分為對(duì)照（CK）組和干旱脅迫（drought stress， DS）處理組，CK組照常澆灌，DS組停止?jié)菜敝撩缒救彼?。在干旱脅迫處理前將苗木灌水澆透，24 h后開始試驗(yàn)，在脅迫第9天復(fù)水（預(yù)試驗(yàn)中，DS組在第10天進(jìn)行復(fù)水處理的幼苗不能恢復(fù)直至枯死），于每日9點(diǎn)采樣，每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)平行對(duì)照。分別在脅迫處理的0 d（CK）、3 d（DS1）、6 d（DS2）、9 d（DS3）、復(fù)水48 h（RW）采集樣本用于后續(xù)試驗(yàn)，其中一部分中國(guó)沙棘的根莖葉組織分別液氮速凍后存于-80℃，用于基因表達(dá)模式研究，另外一部分采集葉片干燥后用于黃酮類含量分析，每個(gè)組織每個(gè)處理各3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 總RNA的提取及cDNA的合成

RN38植物RNA試劑盒（大連艾德萊生物科技有限公司，50次）提取中國(guó)沙棘各組織總RNA。對(duì)微量核酸蛋白測(cè)定儀（美國(guó)，賽默飛世爾科技，NanoDrop）和2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格的RNA用PrimeScript^? Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa，6210A，50次）反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

1.4 HrANR基因的擴(kuò)增

根據(jù)前期中國(guó)沙棘全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（PLoS ONE， https：//doi.org/10.1371/journal.pone.0202213）獲得的HrANR基因序列設(shè)計(jì)引物HrANR-F：5′-ATAAATCGTCAACGAACC-3′和HrANR-R：5′-TTCATACCCTAACTTCTA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 017 bp，使用rTaq酶（TaKaRa，DR100A，250U）以中國(guó)沙棘葉的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，對(duì)獲得的條帶單一大小符合預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.5 生物信息學(xué)分析

核苷酸和氨基酸序列特征用Editseq分析。HrANR基因編碼蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、穩(wěn)定性等采用ProtParam （https：//web. expasy.org/protparam/）進(jìn)行分析；利用Kyte-Doolittle分析HrANR蛋白的疏水性，利用Predict protein（http：//www.predictprotein.org/）和Swiss model（https：//swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行HrANR蛋白二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)的分析；利用SignalP 5.0（SignalP-5.0-Services-DTU Health Tech）進(jìn)行HrANR蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)；采用TMHMM（https：//services. healthtech.dtu.dk/service.php？ TMHMM-2.0）進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測(cè)；采用在線分析網(wǎng)站Predict protein（https：//www.predictprotein. org/）進(jìn)行蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；利用DNAMAN進(jìn)行同源蛋白序列分析；利用NCBI中的Blastp進(jìn)行同源序列的搜索，使用MEGA 6.0構(gòu)建NJ進(jìn)化樹；利用Megalin計(jì)算同源性。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析

通過在線軟件設(shè)計(jì)熒光定量引物HrANR-DL-F：5′-AATTCACTTACAGGCACAGGGTTGG和HrANR-DL-R：5′-AGCTAGTGTCTTGGAGGCAGGATAG-3′。選擇在不同脅迫下能穩(wěn)定表達(dá)的基因作為內(nèi)參基因，根內(nèi)參基因選擇TATA （F： 5′-AAGTTGGCAGCACGAAAGTATG-3′，R： 5′-GGGGAATTTAACATCACAAGAACC-3′），葉內(nèi)參基因選擇HIS3（F： 5′-CCGTAAATCAGCCCCAACC-3′，R： 5′-GAACAAGCCTCTGGAATGGAA-3′），莖內(nèi)參基因選擇PEPC（F： 5′-GTCGTCCATCAAAACGCAAG-3′，R： 5′-AAGCCAAGCCACACAGGTAAA-3′）。在Q2000 B熒光定量PCR儀（杭州朗基）上進(jìn)行qRT-PCR，3次生物學(xué)重復(fù)。

1.7 中國(guó)沙棘葉片黃酮類提取及含量測(cè)定

將干旱脅迫處理的中國(guó)沙棘葉片使用冷凍干燥機(jī)（上海BILON-FD80A）干燥后，使用組織搗碎機(jī)（常州，JTLIANGYHOU-JJ-2）粉碎，過80目篩，石油醚脫脂后使用王樹林（2008）的方法提取黃酮類兩次，合并提取液，第一次使用50%乙醇（物料比1∶10）在70℃下回流2.0 h，第二次使用50%乙醇（物料比1∶8）在70℃下回流1.5 h。黃酮類化合物的含量用紫外分光光度計(jì)［型號(hào)DR6000，美國(guó)哈希公司（HACH）］進(jìn)行測(cè)定，本應(yīng)測(cè)量280 nm處原花色素含量，而該方法只適應(yīng)純度較高的原花色素溶液，因?yàn)閮翰杷卦诖瞬ㄩL(zhǎng)有最大吸收，所以測(cè)量510 nm處總黃酮含量，使用馮智鵬等（2017）的方法通過蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品鑒定所）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

熒光定量使用2^-ΔΔCt法計(jì)算各個(gè)樣本HrANR基因的相對(duì)表達(dá)量，黃酮類提取使用Excel建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并使用Microsoft Excel 2010和SPSS 22進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，圖表利用Sigmaplot 14.0制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 HrANR基因的克隆及序列分析

以中國(guó)沙棘葉的總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，以HrANR-F、HrANR-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了單一條帶的擴(kuò)增結(jié)果（圖1）。對(duì)擴(kuò)增得到的基因測(cè)序后得到HrANR基因的序列，采用DNAMAN分析表明其ORF長(zhǎng)度為1 017 bp。

2.2 編碼氨基酸序列分析及編碼蛋白生物信息學(xué)分析

HrANR基因編碼338個(gè)氨基酸，其中Leu數(shù)量最多（10.1%），Trp數(shù)量最少（0.9%）；其中帶負(fù)電荷氨基酸殘基（Asp + Glu）共38個(gè)，帶正電荷氨基酸殘基（Arg + Lys）有35個(gè)；編碼蛋白分子量為36 660.19 Da，理論等電點(diǎn)（pI）為6.03，為親水性蛋白（圖2），其中194位的異亮氨酸疏水性最強(qiáng)（2.178），而43位的谷氨酸親水性最強(qiáng)（-2.633）。使用Predict protein預(yù)測(cè)中國(guó)沙棘HrANR蛋白，結(jié)果表明該蛋白亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)中，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該基因編碼蛋白中α-螺旋占40.83%，無(wú)規(guī)則卷曲占37.57%，延伸鏈占14.20%，β-折疊為7.40%（圖3），因此說明α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲是HrANR蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)象單元。由圖4 Swiss model預(yù)測(cè)的中國(guó)沙棘HrANR蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型可知，預(yù)測(cè)結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)一致。根據(jù)SignalP 5.0對(duì)HrANR蛋白信號(hào)肽的預(yù)測(cè)結(jié)果可知，該蛋白信號(hào)肽存在的可能性為0.15%，說明中國(guó)沙棘HrANR蛋白不存在信號(hào)肽，屬于非分泌蛋白。利用TMHMM進(jìn)行中國(guó)沙棘HrANR蛋白跨膜區(qū)的預(yù)測(cè)，結(jié)果表明其無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，這與亞細(xì)胞定位結(jié)果中該蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)的結(jié)果一致。

2.3 HRANR同源蛋白的同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹

通過NCBI查找到11個(gè)與HrANR蛋白同源 ［12，中國(guó)沙棘（Hippophae rhamnoides subsp. sinensis）］的序列，即香椿（Toona sinensis，1，QWB49502.1）、荔枝（Litchi chinensis，2，QRV61380.1）、巴西海島棉（Gossypium barbadense，3，ALF38091.1）、烏蘇里楊（Populus ussuriensis，4，UNN46810.1）、藥蜀葵（Althaea officinalis，5，UOI87834.1）、龍眼（Dimocarpus longan，6，QRV61373.1）、可可（Theobroma cacao，7，ADD51354.1）、杧果（Mangifera indica，8，AXN94092.1）、越橘（Vaccinium corymbosum，9，AYC35398.1）、葡萄（Vitis bellula，10，AFG28175.1）、銀杏（Ginkgo biloba，11，AAU95082.1）。對(duì)上述植物的ANR氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)（圖5）、分析序列同源性（圖6），并繪制NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖7）。使用DNAMAN軟件對(duì)多重序列快速比對(duì)，結(jié)果表明其序列一致性達(dá)83.36%，Megalin多重序列間單鏈一致性在57.7%～97.0%之間，其中香椿與中國(guó)沙棘HrANR編碼蛋白一致性最高，達(dá)84.2%，與銀杏差異性最大，達(dá)54.1%。從系統(tǒng)進(jìn)化樹關(guān)系上看，12個(gè)物種聚為兩大類4個(gè)分支，其中中國(guó)沙棘與被子植物聚為一類，裸子植物銀杏單獨(dú)一簇，與圖6差異性關(guān)系相符且符合進(jìn)化規(guī)律；另外，無(wú)患子科荔枝與龍眼聚為一組，錦葵科藥蜀葵和巴西海島棉聚為一組。以上表明ANR蛋白具有明顯的科屬特性。

2.4 HrANR基因的表達(dá)量分析

對(duì)不同程度干旱脅迫下的中國(guó)沙棘的根、莖、葉分別進(jìn)行qRT-PCR以檢測(cè)HrANR基因的表達(dá)情況。由圖8可知，中國(guó)沙棘根中HrANR基因表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢(shì)，在DS2時(shí)達(dá)到最小值，而后增加的趨勢(shì)，復(fù)水后表達(dá)量繼續(xù)上升并達(dá)到最大值；隨著干旱的加劇，莖中HrANR基因表達(dá)量呈持續(xù)下降的趨勢(shì)，復(fù)水后也未能恢復(fù)并繼續(xù)下降；葉中HrANR基因表達(dá)量呈脅迫初期上升而后在重度脅迫以及復(fù)水后均持續(xù)下降的趨勢(shì)。方差分析表明中國(guó)沙棘不同干旱脅迫處理的根、莖、葉中HrANR基因的表達(dá)差異極顯著（P＜0.01）。

2.5 不同脅迫下中國(guó)沙棘葉中的黃酮類含量

將不同脅迫程度的兩次葉片提取液合并后，左側(cè)為物種名，右側(cè)數(shù)字代表堿基位數(shù)。

吸取5 mL提取液稀釋5倍后與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液（標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.410 8x-0.003 3（R²=0.998 6）通過紫外分光光度計(jì)在510 nm處比對(duì)，測(cè)定黃酮類化合物含量，結(jié)果見圖9。由圖9可知，在脅迫前期葉片中黃酮類含量逐漸上升，在DS2達(dá)到峰值（3.38 mg·mL^-1），在DS3中略有下降，而復(fù)水后又上升至最大值（3.98 mg·mL^-1），不同脅迫程度下中國(guó)沙棘葉中黃酮類含量的變化差異極顯著（P＜0.01）。圖8和圖9中HrANR基因在葉中的表達(dá)模式和黃酮類含量累積的趨勢(shì)并不一致，通過SPSS分析，HrANR基因的葉表達(dá)量、莖表達(dá)量和黃酮類含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（皮爾森相關(guān)系數(shù)：P_葉=-0.751，P_莖=-0.934），根表達(dá)量與黃酮類含量呈正相關(guān)關(guān)系（P_根=0.444）。

3 討論與結(jié)論

干旱脅迫影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，為了適應(yīng)脅迫，植株會(huì)迅速做出一系列生理生化響應(yīng)以避免細(xì)胞器受損。研究表明脅迫下植株的機(jī)體防御、信號(hào)傳遞、生長(zhǎng)發(fā)育均與次生代謝產(chǎn)物相關(guān)（Shao et al.， 2009），其中ANR基因通過編碼原花色素生物合成途徑的酶而直接影響生物體總黃酮含量的變化，從而響應(yīng)脅迫。中國(guó)沙棘作為藥用沙棘的主要來源，其葉中含有大量的黃酮類物質(zhì)，不僅具有極高的藥用價(jià)值，同時(shí)高黃酮含量對(duì)中國(guó)沙棘應(yīng)對(duì)干旱等逆境脅迫具有重要的作用（Li et al.， 2022）。研究干旱脅迫下ANR基因的表達(dá)情況及其與黃酮類物質(zhì)累積的關(guān)系，不僅有助于闡明中國(guó)沙棘抗旱分子機(jī)制，還可應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際，通過環(huán)境調(diào)控直接影響中國(guó)沙棘葉中ANR基因的表達(dá)，以達(dá)到控制沙棘葉片黃酮產(chǎn)量，可為開辟沙棘高黃酮類含量植株定向培育提供新的途徑。

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其功能，本研究發(fā)現(xiàn)中國(guó)沙棘HrANR蛋白與杉木（王培等，2019）一樣，是不具有信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)、 定位于細(xì)胞質(zhì)中的親水性蛋白，二級(jí)結(jié)構(gòu)與紅花（魯?shù)ささ龋?022）、篤斯越橘（宋冰雪等，2017）相似，均以α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主；同源多重序列比較發(fā)現(xiàn)與香椿同源性最高，說明親緣性最近，推測(cè)其蛋白結(jié)構(gòu)和功能更相近，并且NJ進(jìn)化樹中12個(gè)物種存在明顯種屬特性，在分支內(nèi)平行進(jìn)化，符合形態(tài)學(xué)分類結(jié)果（中國(guó)植物志編輯委員會(huì)，1983）。

馬敬等（2012）發(fā)現(xiàn)在花生不同組織中ANR基因表達(dá)量會(huì)有所差異；魯?shù)ささ龋?022）對(duì)紅花中ANR基因的研究表明其表達(dá)量在根和莖中較低；朱燦燦等（2010）在銀杏中發(fā)現(xiàn)隨著干旱時(shí)間的延長(zhǎng)其體內(nèi)ANR基因的表達(dá)量波動(dòng)變化，但總體是增加的趨勢(shì)；魯曉翔（2012）認(rèn)為一定范圍內(nèi)，植物的抗氧化性與ANR基因表達(dá)量成正比。本研究中HrANR基因在干旱脅迫的中國(guó)沙棘根莖葉中的表達(dá)趨勢(shì)呈不同趨勢(shì)，其中在葉中呈先上升后下降的趨勢(shì)，莖中則隨著干旱脅迫的加劇持續(xù)下降，而在根中則為先升后降而后持續(xù)上升的波動(dòng)趨勢(shì)，表明在脅迫過程中HrANR基因的表達(dá)對(duì)于干旱脅迫是一個(gè)動(dòng)態(tài)適應(yīng)過程，ANR基因與中國(guó)沙棘應(yīng)對(duì)干旱脅迫關(guān)系密切。

黃酮類物質(zhì)包括黃烷酮、兒茶素和花青素（Leonard et al.，2006），黃酮類化合物本身具有抗氧化性，干旱可以誘導(dǎo)植物體內(nèi)黃酮類化合物的累積從而提高植物的耐旱性以使其適應(yīng)環(huán)境（Foyer et al.，2010），表明黃酮類物質(zhì)對(duì)植物的應(yīng)激和抗逆性具有重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯（Watkinson et al.，2006）和淫羊藿（石進(jìn)校等，2004）的抗旱性均與黃酮類含量明顯相關(guān)，其中研究表明花青素抗氧化性遠(yuǎn)高于V_C、V_E和β胡蘿卜素（魯曉翔，2012）。Li等（2022）研究發(fā)現(xiàn)ANR基因的過表達(dá)可以促進(jìn)花青素的累積，從而提高植物的抗旱能力。在本研究中，干旱脅迫初期葉黃酮類含量與干旱脅迫呈正相關(guān)，而HrANR基因的表達(dá)與之對(duì)應(yīng)，呈上升趨勢(shì)，在嚴(yán)重脅迫下二者與干旱脅迫均呈負(fù)相關(guān)，說明在一定程度的干旱脅迫下，中國(guó)沙棘可通過HrANR基因等黃酮類合成相關(guān)基因的表達(dá)以累積黃酮類來加強(qiáng)氧自由基的清除能力從而對(duì)脅迫進(jìn)行響應(yīng)，與孟慶華等（2012）的研究結(jié)果一致。而當(dāng)干旱持續(xù)一定的時(shí)間后，脅迫程度可能已超過中國(guó)沙棘自身干旱脅迫承受能力，嚴(yán)重的脅迫使毒害物質(zhì)含量增加，使中國(guó)沙棘生長(zhǎng)受到嚴(yán)重影響，各種保護(hù)物質(zhì)的合成亦受到了抑制。同時(shí)在變化趨勢(shì)上，葉片中HrANR基因在第6天開始呈下降趨勢(shì)，而黃酮類含量下降則有延遲（在脅迫第9天時(shí)開始呈下降的趨勢(shì)）。復(fù)水后中國(guó)沙棘葉中黃酮類含量與HrANR基因的表達(dá)情況相反，其中黃酮類含量在復(fù)水后急劇上升，而HrANR基因在葉中的表達(dá)仍然呈下降的趨勢(shì)，與之相反，中國(guó)沙棘根中HrANR基因的表達(dá)在復(fù)水后則呈急劇上升的趨勢(shì)，推測(cè)由于復(fù)水時(shí)間較短，中國(guó)沙棘根系吸收的水分先滿足根系自身的需要，地上部分依舊處于缺水狀態(tài)，而根系中通過HrANR基因等更多的表達(dá)而合成大量的黃酮類物質(zhì)被運(yùn)輸至葉片發(fā)揮作用，從而使葉片中黃酮類含量上升。上述結(jié)果表明，中國(guó)沙棘HrANR基因及黃酮類含量變化與其抗旱性密切相關(guān)。

基因表達(dá)量是基于轉(zhuǎn)錄水平的，而RNA很不穩(wěn)定，尤其是在重度脅迫下（本研究中干旱脅迫第6天和第9天），其半衰期更短、更易降解，而基因的表達(dá)產(chǎn)物較穩(wěn)定（楊榮武，2017），因而在基因表達(dá)量下降時(shí)表達(dá)產(chǎn)物依然能夠因?yàn)槌掷m(xù)的累積而保持上升的趨勢(shì)，從而持續(xù)發(fā)揮抗旱功能，這可能是本研究中中國(guó)沙棘中黃酮類含量與ANR基因表達(dá)不一致的原因之一。另外，植物通過篩管自上而下運(yùn)輸有機(jī)物，在本研究中，干旱脅迫第9天根中HrANR基因的表達(dá)量急劇上升且在復(fù)水后持續(xù)呈上升趨勢(shì)，致使根系不斷累積黃酮類物質(zhì)，而根系中合成的黃酮類物質(zhì)通過篩管運(yùn)輸至葉片，這可能是導(dǎo)致葉片中黃酮類含量與HrANR基因的表達(dá)在復(fù)水后不一致的另一主要原因。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于沙棘干旱脅迫相關(guān)基因的研究較多，但多針對(duì)于ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、CA²⁺信號(hào)途徑、MAPK蛋白激酶途徑等，對(duì)于次生代謝產(chǎn)物與抗旱性之間相關(guān)性的研究?jī)H有孫坤等（2015）對(duì)肋果沙棘的研究。為進(jìn)一步明確HrANR基因與中國(guó)沙棘抗旱性的關(guān)系，有必要對(duì)干旱脅迫下其他黃酮類合成相關(guān)基因的表達(dá)量與黃酮類含量的關(guān)系進(jìn)行綜合評(píng)估，同時(shí)通過轉(zhuǎn)基因手段獲得過表達(dá)植株研究HrANR基因的抗旱功能，為中國(guó)沙棘抗旱機(jī)理的闡明提供依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）