馬尾松HDR基因克隆及其對旱與鹽脅迫的響應(yīng)

摘 要：干旱和土地鹽漬化是制約林業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素，植物在遭受生物或非生物脅迫時，會在葉片釋放萜類等揮發(fā)性物質(zhì)。1-羥基-2-甲基-2-（E）-丁烯基-4-焦磷酸還原酶（HDR）是MEP途徑的末端活性酶，具有提供前體萜類物質(zhì)和主要限速作用。為探究馬尾松HDR基因是否參與干旱和鹽脅迫條件下的脅迫響應(yīng)，該研究克隆了馬尾松HDR基因開放閱讀框，并初步分析了其生物信息、組織特異性表達水平和初步功能。結(jié)果表明：（1）PmHDR基因編碼區(qū)長度為1 458 bp，編碼485個氨基酸，其編碼蛋白包含LytB/IspH基因超家族的核心序列和PLN02821多功能結(jié)構(gòu)域，屬于HDR家族。（2）PmHDR密碼子使用偏好性較弱，偏好使用A/U結(jié)尾的密碼子，煙草、擬南芥與釀酒酵母更適合作為其異源表達受體。（3）qRT-PCR結(jié)果顯示，PmHDR基因在馬尾松老葉中表達量最高，其次為幼葉、幼莖和老莖，在根中表達量最低。（4）構(gòu)建基因表達載體pBI121-PmHDR并轉(zhuǎn)化擬南芥，轉(zhuǎn)基因擬南芥對干旱和鹽脅迫表現(xiàn)出更強的抗逆性。以上研究結(jié)果表明PmHDR參與了植物干旱和鹽脅迫的響應(yīng)和調(diào)節(jié)，并為馬尾松抗逆育種提供了一定的理論支持。

關(guān)鍵詞：馬尾松，PmHDR，萜類化合物，基因克隆，脅迫響應(yīng)

中圖分類號：Q943 文獻標識碼：A 文章編號：1000-3142（2024）02-0216-19

基金項目：國家“十四五”重點研發(fā)計劃課題（2022YFD2200202）; 江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目（PAPD）。

第一作者：王嘉雯（2000-），碩士研究生，研究方向為觀賞植物種質(zhì)資源與遺傳育種，（E-mail）wang_jiawen2276@163.com。

^*通信作者：季孔庶，博士，教授，研究方向為林木遺傳育種、園林植物遺傳育種，（E-mail）ksji@njfu.edu.cn。

Cloning of HDR gene in Pinus massoniana and its response to drought and salt stresses

WANG Jiawen， YAO Sheng， SU Huan， LIU Kexin， ZHU Peihuang， JI Kongshu^*

（ State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding/Key Open Laboratory of Forest Genetics and Gene Engineering of National Forestry and Grassland Administration/Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China， Nanjing Forestry University， Nanjing 210037， China ）

Abstract：" Drought and land salinization are inhibiting factors for the sustainable development of forestry， and the plants will release volatile substances such as terpenoids during biological or non-biological stress. The 1-hydroxy-2-methyl-2-（E）-buteny-4-pyrophosphate reductase is the terminal active enzyme of the MEP pathway， which provides precursor terpenoids and has the main rate-limiting effect. In order to investigate whether HDR gene of Pinus massoniana is involved in stress response under drought and salt stress， the open reading frame of PmHDR gene was cloned， and bioinformation， tissue specific expression and preliminary function were analyzed. The results were as follows： （1） The coding region length of PmHDR gene is 1 458 bp， encoding 485 amino acids， and its encoded protein contains the core sequence of LytB/IspH gene superfamily and PLN02821 multifunctional structural domain， which belongs to the HDR family. （2） The PmHDR codon use preference was weak， with a preference for codons ending in A/U. Nicotiana tabacum， Arabidopsis thaliana and Saccharomyces cerevisiae were more suitable as its heterologous expression receptors. （3） Results of qRT-PCR showed that the PmHDR gene was most highly expressed in old needles of Pinus massoniana， followed by young needles， young stem and old stem and least expressed in root. （4） The gene expression vector pBI121-PmHDR was constructed and transformed into Arabidopsis thaliana. The transgenic A. thaliana showed greater resistance to drought and salt stress. These results indicate that PmHDR is involved in plant response and regulation to drought and salt stress， and provide some theoretical supports for Pinus massoniana stress-resistance breeding.

Key words： Pinus massoniana， PmHDR， terpenoids， gene cloning， stress response

馬尾松（Pinus massoniana）為松科松屬高大喬木，是我國古老的本土針葉樹種，也是我國特有的速生樹種之一，廣泛分布于秦嶺—淮河以南，云貴高原以東17個省、自治區(qū)、直轄市，為我國分布面積最廣的針葉林樹種（李愛民等，2008）。隨著全球氣候變暖，水資源短缺問題日益嚴重，大范圍持續(xù)性干旱和土地鹽漬化對我國的農(nóng)林生產(chǎn)造成了嚴重威脅，使植物生長受限且使植物體內(nèi)的有機物成分發(fā)生改變，影響其價值與產(chǎn)量（Pichler amp; Oberhuber， 2007；張金鳳等，2021），對我國的農(nóng)林生產(chǎn)造成了嚴重威脅，因此提高樹木對干旱和鹽脅迫的抗性一直是森林培育的主要目標之一。馬尾松作為我國重要的木材、采脂樹種和荒山造林先鋒樹種之一（徐向華和丁貴杰，2006），具有較強的抗逆性，但仍被重度干旱脅迫顯著抑制了高和生物量的增長，嚴重影響其生長和繁殖（全文選和丁貴杰，2017），因此研究馬尾松對干旱和鹽脅迫的適應(yīng)機制至關(guān)重要。

植物在遭受生物或非生物脅迫時，會在葉片釋放揮發(fā)性物質(zhì)，包括萜烯類和脂肪酸衍生物等，這些物質(zhì)具有直接和間接的信號調(diào)控作用（Laothawornkitkul et al.，2008），能夠及時激活脫落酸（ABA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、油菜素內(nèi)酯（BR）等植物激素的合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達，以緩解或適應(yīng)脅迫環(huán)境（閻秀峰等，2007；Obata amp; Fernie， 2012）。其中，萜類化合物響應(yīng)干旱脅迫的程度較高，在植物抵抗逆境脅迫的過程中起到重要作用（Rastogi et al.，2019）。萜類化合物是植物次生代謝產(chǎn)物中最豐富、結(jié)構(gòu)最多樣化的一類（羅永明等，2003），其以異戊二烯為基本單位，共同前體物為異戊烯焦磷酸（IPP）和其異構(gòu)體二甲烯焦磷酸（DMAPP）（Nisar et al.， 2015; 孫麗超等，2017）。IPP和DMAPP在生物體內(nèi)的合成主要有甲羥戊酸途徑（MVA pathway）和丙酮酸途徑（MEP pathway）兩種途徑（趙樂等，2016；陳曉明，2018）。其中，MVA途徑主要參與倍半萜的合成（Eisenreich et al.， 2001），MEP途徑主要參與單萜、二萜和類胡蘿卜素等的合成（Rohmer，1999；張藝丹等，2019）。1-羥基-2-甲基-2-（E）-丁烯基-4-焦磷酸還原酶（HDR）是MEP途徑的末端活性酶，催化1-羥基-2-甲基-2-（E）-丁烯基-4-焦磷酸（HMBPP）發(fā)生還原反應(yīng)并以5∶1的比例生成IPP與DMAPP的混合物，具有提供前體萜類物質(zhì)和主要限速作用（Peng et al.， 2011；王穎等，2014）。

Cunningham等（2000）早期發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中，HDR基因?qū)EP途徑有限制性作用；在番茄（Lycopersicon esculentum）果實成熟和擬南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗脫硫這兩個大量產(chǎn)生類胡蘿卜素的過程中，HDR轉(zhuǎn)錄水平明顯增加，說明HDR表達與類胡蘿卜素的積累有關(guān)（Botella-Pavía et al.，2004）；張雯等（2008）對銀杏（Ginkgo biloba）的研究顯示，轉(zhuǎn)入HDR基因的銀杏與野生型銀杏相比，總內(nèi)酯含量顯著提高；Chen等（2010）對蘿芙木（Rauvolfia verticillata）的研究發(fā)現(xiàn)，MeJA、乙酰水楊酸（ASA）、ABA、紫外光（UV）等激發(fā)子可以誘導(dǎo)上調(diào)HDR基因的轉(zhuǎn)錄水平；在鐵皮石斛（Dendrobium officinale）中，HDR基因的表達受水楊酸（SA）和ABA的調(diào)控，但不受MeJA影響（吳秋菊等，2015）。這些已有的研究均表明HDR基因在MEP途徑中具有重要的限制調(diào)控作用，與植物類胡蘿卜素、內(nèi)酯等萜類化合物的合成密切相關(guān)且受調(diào)控非生物脅迫響應(yīng)的ABA、SA等植物激素誘導(dǎo)，說明其可能參與植物對非生物脅迫的響應(yīng)（Wang et al.， 2008; Huang et al.， 2009; Sun et al.， 2009; 王毅等， 2015）。

在馬尾松中，MEP途徑上游關(guān)鍵酶1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶的編碼基因PmDXS和1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶的編碼基因PmDXR已被成功克隆，并對其進行了功能和表達分析。DXR是MEP途徑的第一個關(guān)鍵酶，對PmDXS基因的研究結(jié)果顯示，用機械損傷、15%滲透劑、H₂O₂、乙烯利、MeJA、SA 6種非生物脅迫或激素處理馬尾松后，PmDXS基因的表達量在短時間內(nèi)均有所上調(diào)；在400 mmol·L^-1 NaCl、800 mmol·L^-1 D-甘露醇（D-mannitol）、pH 5.0、pH 9.0等非生物脅迫環(huán)境下，TransB/pET28a-PmDXS重組菌生長狀況顯著優(yōu)于對照，表明PmDXS基因在干旱和鹽脅迫中具有正調(diào)控效應(yīng)（李榮，2021）。綜上結(jié)果表明，PmDXS基因參與非生物脅迫應(yīng)答，在馬尾松的逆境脅迫響應(yīng)中起一定作用。DXR是催化MEP途徑第二步反應(yīng)的關(guān)鍵限速酶，朱靈芝（2021）對PmDXR基因的研究結(jié)果顯示，相比于野生型擬南芥，PmDXR轉(zhuǎn)基因擬南芥的生長發(fā)育在不同濃度NaCl、SA、MeJA、D-mannitol的脅迫條件下受到的抑制較小，說明PmDXR基因也在一定程度上參與馬尾松逆境脅迫響應(yīng)。因此，作為MEP途徑的末端限速酶HDR的編碼基因，PmHDR極有可能參與馬尾松在干旱和鹽等非生物脅迫的響應(yīng)過程。本文將克隆馬尾松PmHDR基因序列，對其進行生物信息學(xué)分析和組織特異性表達分析，并構(gòu)建基因表達載體轉(zhuǎn)化擬南芥，對比分析轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型在干旱和鹽脅迫條件下的生長情況，擬探討以下問題：（1）PmHDR蛋白理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、所屬基因家族及物種間的進化關(guān)系；（2）PmHDR基因的組織特異性表達模式；（3）PmHDR是否參與干旱和鹽脅迫等非生物脅迫環(huán)境下的脅迫響應(yīng)。以期為進一步闡明馬尾松萜類化合物形成過程關(guān)鍵酶基因的潛在生物學(xué)功能提供幫助，并為馬尾松抗逆育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2年生馬尾松實生苗和擬南芥種子，均取自南京林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種全國重點實驗室。

大腸桿菌Trelief^TM 5α感受態(tài)細胞和pClone007 Blunt載體購自北京擎科生物科技股份有限公司；根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞購自上海唯地生物技術(shù)有限公司；Plant Total RNA Isolation Kit、Gel DNA Extraction Mini Kit、Plant DNA Isolation、ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix、ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；BamH I、Sac I、QuickCut Buffer購自Takara；PCR Master Mix和1st Strand cDNA Synthesis SuperMix購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；DNA ladder、Loading buffer For Agarose Gels和TAE Buffer購自上海捷瑞生物工程有限公司。

試驗中引物合成和序列測序由南京擎科生物科技股份有限公司和上海杰李生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 PmHDR基因的克隆 參照南京諾唯贊FastPure Plant Total RNA Isolation Kit的說明書提取2年生馬尾松總RNA，使用Nanodrop One超微量紫外分光光度儀檢測RNA的濃度和純度，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。選取純度高且完整性較好的RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，于-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)火炬松（Pinus taeda）同源基因序列，使用DNAMAN軟件設(shè)計PmHDR特異性引物，分別為PmHDR-F（5′-ATGCCTTCGAGCCTCAGCTTTGC-3′）、PmHDR-R（5′-TACCGTCTGCAACGCCTCCTCAT-3′）。以逆轉(zhuǎn)錄獲得的馬尾松cDNA第一鏈為模板進行PCR反應(yīng)，擴增體系總體積為50 μL，包括高保真酶20 μL，上游和下游引物各1 μL，cDNA 2.5 μL，ddH₂O 25.5 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，60℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用Gel DNA Extraction產(chǎn)物回收試劑盒進行回收純化，實施連接克隆載體（pClone007）并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Trelief^TM5α感受態(tài)細胞中，培養(yǎng)單菌落，通過菌落PCR篩選陽性克隆送至南京擎科生物科技有限公司測序。

1.2.2 PmHDR基因的生物信息學(xué)分析 利用在線軟件對PmHDR基因及其編碼蛋白進行生物信息學(xué)分析，具體網(wǎng)址見表1；利用DNAMAN軟件對PmHDR蛋白進行同源性比對；運用MEGA 7.0的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.2.3 PmHDR同義密碼子偏好性分析 利用CodonW 1.4.2軟件計算PmHDR密碼子的使用特性參數(shù)，包括A3s、U3s、C3s、G3s、相對同義密碼子使用度（relative synonymous codon usage， RSCU）、有效密碼子數(shù)（effective number of codons， ENC）、密碼子適應(yīng)系數(shù)（codon adaptation index， CAI）、最優(yōu)密碼子使用頻率（frequency of optimal codons， FOP）、GC含量和密碼子第3位上的GC含量（GC3s）等。運用EMBOSS中的CUSP在線軟件計算密碼子的使用頻率。

擬南芥、煙草（Nicotiana tabacum）、大腸桿菌（Escherichia coli）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的基因組密碼子使用頻率數(shù)據(jù)來自密碼子使用統(tǒng)計數(shù)據(jù)庫（http：//www. kazusa.or.jp/codon）。

1.2.4 PmHDR基因的表達分析 剪取2年生馬尾松根、幼葉、老葉、幼莖、老莖5個部位的樣品，分別使用液氮研磨，提取各樣品總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop One超微量紫外分光光度儀檢測各RNA的濃度和質(zhì)量，將符合要求的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用Nanodrop One測定cDNA濃度，并將各cDNA稀釋至10 ng·μL^-1。

根據(jù)克隆所得PmHDR基因序列，使用Primier 5.0軟件設(shè)計實時熒光定量PCR（qPCR）引物q-PmHDR-F（5′-AGAAATCGCAGAGCAGAA-3′）和q-PmHDR-R（5′-CAACGCCTCCTCATCCTT-3′），以TUA（GenBank：KM496535.1）為內(nèi)參基因，用SYBR Green進行實時熒光定量表達分析。反應(yīng)體系共10 μL，包括cDNA模板1 μL、上下游引物各0.2 μL、SYBR Green Real-time PCR Master Mix （2×）5 μL、無菌水3.6 μL。qPCR反應(yīng)在ABI StepOne Plus熒光定量PCR儀上進行，反應(yīng)程序使用兩步法：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，40次循環(huán)，分別設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)，PCR反應(yīng)結(jié)束后進行熔解曲線分析。使用SPSS 26軟件進行數(shù)據(jù)分析并作圖，采用鄧肯多重比較法分析各組織表達量差異顯著性。

1.2.5 基因表達載體構(gòu)建 使用pBI121-GUS質(zhì)粒作為真核表達載體，根據(jù)測序得到的PmHDR基因序列，選擇BamH I和Sac I兩個酶切位點，設(shè)計去除終止密碼子且含有酶切位點序列的重組引物PmHDR-BamHI-F （5′-ACGGGGGACTCTAGAGGATCC

ATGCCTTCGAGCCTCAGCTT-3′）和PmHDR-SacI-R（5′-CGATCGGGGAAATTCGAGCTCCCGTCTGCAACGC

CTCCT-3′）。以馬尾松cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物質(zhì)量和大小，并切膠回收得到含酶切位點的PmHDR基因ORF片段。

用限制性核酸內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Sac I對pBI121-GUS質(zhì)粒進行雙酶切，將酶切后的質(zhì)粒切膠回收后，與PmHDR基因片段連接，并立即轉(zhuǎn)化Trelief^TM 5α大腸桿菌，于含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜，挑取單菌落進行PCR陽性檢測，將陽性單克隆擴繁后送至南京擎科生物科技股份有限公司進行測序，并由其返還重組載體質(zhì)粒pBI121-PmHDR。

1.2.6 遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥及脅迫處理 用重組質(zhì)粒凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，擴大培養(yǎng)陽性單菌落，花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥。收取擬南芥種子，依次用75%乙醇和20%次氯酸鈉消毒，均勻播種在含有50 mg·mL^-1 Kana抗生素的MS固體培養(yǎng)基上進行抗性篩選，將其中長勢良好的擬南芥幼苗移栽至營養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)。分別采集野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片，液氮研磨，使用南京諾唯贊生物科技股份有限公司生產(chǎn)的FastPure Plant DNA Isolation提取基因組DNA，并以其為模板，用PmHDR-BamHI-F和PmHDR-SacI-R做引物，進行PCR擴增，篩選出PmHDR轉(zhuǎn)基因擬南芥。重復(fù)篩選1次，采集擬南芥種子。

分別配制含50 mmol·L^-1 NaCl和含5、10、50、100 mmol·L^-1 D-mannitol的MS固體培養(yǎng)基，將野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥消毒后分別點播在培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基播種20個種子。培養(yǎng)10 d后，觀察擬南芥發(fā)芽及生長狀況，從每個培養(yǎng)基中挑選10個成功發(fā)芽的擬南芥，測量并記錄其胚根長，使用RStudio軟件對根長數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PmHDR基因的克隆及序列比對

擴增獲得PmHDR基因中間片段序列，長度為1 458 bp，與瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果相符（圖1）。

M代表DNA Marker，1和2代表PmHDR基因。

通過NCBI的Blastn在線軟件，將PmHDR基因序列與其他物種進行比對。輸出結(jié)果顯示，共有5種植物基因序列與PmHDR相似度高于85%，分別為赤松（Pinus densiflora）、火炬松（P. taeda）、白云杉（Picea glauca）、北美云杉（P. sitchensis）和日本落葉松（Larix kaempferi），其中赤松和火炬松的IDS1基因與PmHDR基因序列相似度在98%以上。

通過NCBI的Blastp在線軟件對PmHDR的氨基酸序列進行比對，結(jié)果顯示PmHDR與赤松、火炬松的氨基酸序列相似度最高，在97%以上，與北美云杉、日本落葉松、銀杏、川桑（Morus notabilis）、澳洲堅果（Macadamia integrifolia）、胡桃（Juglans regia）、鳳梨（Ananas comosus）等物種的相似度也均高于78%，說明HDR基因在進化過程中較為保守。選取與PmHDR氨基酸序列相似度較高的幾個物種，通過DNAMAN軟件進行氨基酸序列比對（圖2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)PmHDR的氨基酸序列與其他物種一致，均含有4個保守的半胱氨酸殘基活性位點，Lu等（2008）研究表明這些活性位點可能參與催化過程中鐵硫鍵的形成。

2.2 PmHDR的生物信息學(xué)分析

2.2.1 蛋白一級結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)分析 PmHDR編碼蛋白的分子式為C₂₄₁₅H₃₈₄₄N₆₅₄O₇₄₄S₁₉，理論分子質(zhì)量為54.55 kD，理論等電點為5.98，由485個氨深藍色區(qū)域代表幾個物種的氨基酸序列完全一致，粉色區(qū)域代表氨基酸序列高度保守，淺藍色與白色區(qū)域代表氨基酸序列差異較大?！戆腚装彼釟埢Ｊ匚稽c。

基酸組成，共包含71個負電荷氨基酸堿基和65個正電荷氨基酸堿基。該蛋白中含量最多的氨基酸為賴氨酸（Lys），占總氨基酸的9.3%；含量最少的為半胱氨酸（Cys），僅占1.4%（圖3：A）。蛋白脂A. PmHDR編碼蛋白的氨基酸組成; B. PmHDR編碼蛋白的親疏水性預(yù)測。

肪系數(shù)為80.99，總平均親水性為-0.447，說明該蛋白是親水性蛋白（圖3：B）；不穩(wěn)定系數(shù)為28.98，說明該蛋白為穩(wěn)定蛋白。

2.2.2 保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測與分析 PmHDR的氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示，PmHDR編碼蛋白在第60至第483個氨基酸殘基處具有PLN02821多功能結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?qū)儆贚ytB/IspH基因超家族（Accession：cl19123），該家族成員可將1-羥基-2-甲基-2-（E）-丁烯基-4-焦磷酸（HMBPP）轉(zhuǎn)化為異戊烯焦磷酸（IPP）和二甲烯焦磷酸（DMAPP），由此可預(yù)測PmHDR編碼蛋白具有還原HMBPP的功能（圖4：A）。

2.2.3 亞細胞定位預(yù)測 使用在線軟件Cell-PLoc 2.0和IncLocator對PmHDR的亞細胞定位進行預(yù)測，結(jié)果均顯示PmHDR編碼蛋白位于葉綠體中的可靠性較高。

2.2.4 蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)及信號肽分析 利用在線軟件TMHMM Server v.2.0對PmHDR編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)及跨膜方向進行預(yù)測分析，結(jié)果顯示該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)，全部位于膜外（圖4：B）。

使用在線工具SignalP 5.0 Server對PmHDR編碼蛋白進行信號肽預(yù)測分析，結(jié)果顯示其不含有信號肽，表明其為非分泌蛋白（圖4：C）。

2.2.5 蛋白質(zhì)磷酸化位點和糖基化位點分析 使用NetPhos 3.1 Server在線軟件進行磷酸化位點的預(yù)測分析，結(jié)果顯示PmHDR編碼蛋白中共有47個磷酸化位點，包括23個絲氨酸（S）、20個蘇氨酸（T）、4個酪氨酸（Y）（圖4：D）。

分別使用YinOYang 1.2和NetNGlyc 1.0 Server在線軟件進行O-糖基化和N-糖基化進行預(yù)測分析，結(jié)果顯示PmHDR編碼蛋白中共有3個N-糖基化位點，分別為第129個、第172個、第397個氨基酸（圖4：E）；共有4個O-糖基化位點，分別為第4（S）個、34（S）個、58（T）個、236（S）個氨基酸（圖4：F）。

2.2.6 蛋白二級結(jié)構(gòu)分析 PmHDR編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示：該蛋白中含有α螺旋211個，占比43.51%；含有無規(guī)則卷曲164個，占比33.81%；含有延伸鏈78個，占比16.08%；含有β轉(zhuǎn)角32個，占比6.60%（圖5）。

2.2.7 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 采用同源建模法進行PmHDR編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示PmHDR編碼蛋白與同源模板c3dnfB ［1-羥基-2-甲基-2-（E）-丁烯基-4-焦磷酸還原酶］的序列相似度為33%，置信度為100%（圖6）。

2.2.8 系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建 通過鄰接法（neighbor-joining）將PmHDR氨基酸序列與其他物種進行比對并構(gòu)建進化樹，PmHDR與裸子植物聚在一支，與赤松、火炬松同源性更高（圖7）。

2.3 PmHDR密碼子偏好性分析

2.3.1 GC、GC3s、ENC、CAI和FOP分析 使用CodonW 1.4.2對PmHDR的A3s、U3s、C3s、G3s、ENC、CAI、FOP等參數(shù)進行分析，結(jié)果分別為0.400、A. PmHDR基因保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測; B. PmHDR編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測; C. PmHDR編碼蛋白的信號肽預(yù)測; D. 磷酸化位點預(yù)測; E. N-糖基化位點預(yù)測; F. O-糖基化位點預(yù)測。

0.468、0.272、0.155、47.77、0.215、0.363。其中，ENC常用于分析基因的密碼子使用偏好，其值范圍為20～61，ENC值越小表示基因密碼子偏好性越強，一般認為ENC值小于35表示基因密碼子使用偏好性顯著（Mensah et al.， 2019）。PmHDR基因的ENC值為47.77，說明PmHDR基因的密碼子選擇偏好性較弱。CAI為編碼該蛋白的所有密碼子相對于這條基因都使用最優(yōu)密碼子情況下的適應(yīng)系數(shù)，F(xiàn)OP為最優(yōu)密碼子和其同義密碼子的比值，二者值介于0～1，其值越高，表示密碼子偏好性越強，基因表達水平越高。PmHDR基因的CAI為0.215，F(xiàn)OP為0.363，均更趨近于0，進一步說明PmHDR基因?qū)γ艽a子的選擇偏好性弱，表達水平較低。此外，使用EMBOSS中的CUSP在線軟件計算總GC含量和GC3s，結(jié)果顯示 PmHDR編碼氨基酸時密碼子GC含量和GC3s值分別為39.92%和34.77%，說明密碼子偏好以A/U結(jié)尾。

2.3.2 相對同義密碼子使用度分析 在PmHDR基因選擇的密碼子中，有28個密碼子的RSCU值大于1.0，為PmHDR偏好密碼子（表2），CCA、AGA、GGA、ACU和CUU 5個密碼子RSCU值大于2.0，偏好性較強，其中編碼精氨酸（Arg）的AGA密碼子RSCU值為2.70，偏好性極強。編碼脯氨酸（Pro）的CCC、CCG和編碼Arg的CGG密碼子的RSCU值為0，說明它們可能不參與PmHDR基因的翻譯過程。PmHDR基因偏好密碼子中絕大多數(shù)G/C結(jié)尾的密碼子RSCU值較低，也進一步表明PmHDR基因的密碼子偏好以A/U結(jié)尾，表達水平較低。

2.3.3 PmHDR外源宿主的選擇 將PmHDR基因的密碼子使用頻率分別與擬南芥、煙草、釀酒酵母和大腸桿菌等模式物種的基因組進行比較分析（表3），將比值大于等于2.0和小于等于0.5作為篩選密碼子偏好性差異較大的標準，以此統(tǒng)計差異個數(shù)。與2種模式植物的基因組相比，PmHDR基因的絕大部分密碼子使用偏好性差異較小，與擬南芥和煙草基因組密碼子的使用頻率差異較大的分別有16和14個，說明在進行PmHDR遺傳轉(zhuǎn)化試驗時，煙草和擬南芥均可作為異源表達的受體。與2種微生物的基因組相比，PmHDR與大腸桿菌密碼子偏好性差異很大，使用頻率差異較大的密碼子有24個，而與釀酒酵母相比使用頻率差異較大的密碼子只有14個，密碼子偏好性差異顯著小于大腸桿菌，說明釀酒酵母更適合作為PmHDR微生物內(nèi)異源表達試驗的受體。

2.4 PmHDR的組織特異性表達分析

通過實時熒光定量表達技術(shù)，分析PmHDR基因在成年馬尾松根、幼葉、老葉、幼莖、老莖中的表達情況。結(jié)果表明，PmHDR基因在馬尾松根中表達量最低，在老葉中表達量最高，為根中表達量的122.2倍，在幼葉、幼莖、老莖中的表達量分別為根的21.2倍、6.5倍和6.0倍（圖8）。

2.5 脅迫處理下擬南芥生長觀測

將轉(zhuǎn)基因擬南芥種子播種在含Kana抗生素的MS固體培養(yǎng)基上進行篩選，并選取其中正常生長發(fā)育的植株幼苗轉(zhuǎn)移至營養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)2～3周后進行分子鑒定（圖9），結(jié)果顯示被選擇的8株轉(zhuǎn)基因擬南芥中有6株檢測結(jié)果為陽性，因此采集這6株擬南芥的種子，開展后續(xù)實驗。

利用D-mannitol和NaCl分別對擬南芥進行干旱脅迫和鹽脅迫處理，將野生型和PmHDR轉(zhuǎn)基因擬南芥種子分別點播在含有不同濃度D-mannitol和NaCl的MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d，觀察并記錄各個培養(yǎng)基中擬南芥的生長發(fā)育情況（圖10）。

結(jié)果表明，在正常培養(yǎng)條件（無脅迫處理）下，轉(zhuǎn)基因擬南芥的胚根長略大于野生型擬南芥，但差異不顯著；與之相比，經(jīng)5、10、50、100 mmol·L^-1 D-mannitol和50 mmol·L^-1 NaCl處理的擬南芥生長受到不同程度的抑制，其中野生型擬南芥平均胚根長分別減小35.49%、39.26%、53.59%、77.08%、77.06%，轉(zhuǎn)基因擬南芥平均胚根長分別減小11.03%、7.40%、21.88%、59.09%、20.10%。在D-mannitol和NaCl脅迫處理下，轉(zhuǎn)基因擬南芥的胚根長顯著大于野生型擬南芥，說明轉(zhuǎn)基因擬南芥受D-mannitol和NaCl脅迫影響小，對干旱和鹽脅迫表現(xiàn)出更強的抗逆性（圖11）。不同小寫字母表示差異顯著（Plt;0.05）。

3 討論與結(jié)論

萜類化合物是植物次生代謝產(chǎn)物中最豐富、結(jié)構(gòu)最多樣化的一類，在植物生長發(fā)育和抵抗逆境脅迫的過程中到重要作用。1-羥基-2-甲基-2-（E）-丁烯基-4-焦磷酸還原酶（HDR）是萜類化合物合成中MEP途徑的末端活性酶，具有提供前體萜類物質(zhì)和主要限速作用。為探究馬尾松對干旱和鹽脅迫的響應(yīng)，本文研究并克隆了PmHDR基因。萜類化合物生物合成MEP途徑上游關(guān)鍵酶的編碼基因PmDXS和PmDXR已被成功克隆和分析，發(fā)現(xiàn)二者均在一定程度上參與了馬尾松對非生物脅迫的響應(yīng)（李榮，2021；朱靈芝，2021）。

PmHDR蛋白可能在一定程度上促進馬尾松的生長發(fā)育和逆境響應(yīng)過程。本文研究發(fā)現(xiàn)PmHDR基因長度為1 458 bp，編碼485個氨基酸，其編碼蛋白包含LytB/IspH基因超家族的核心序WT. 野生型擬南芥; 1～8. 轉(zhuǎn)基因擬南芥。

列和PLN02821多功能結(jié)構(gòu)域，屬于HDR家族，這說明PmHDR蛋白參與催化萜類化合物的生物合成。對PmHDR蛋白進行結(jié)構(gòu)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該蛋白富含α螺旋與不規(guī)則卷曲，三級結(jié)構(gòu)呈“苜蓿葉”形，與其他物種中的HDR蛋白結(jié)構(gòu)相似；4個保守的半胱氨酸殘基可能處于“苜蓿葉”中間位置，構(gòu)成鐵硫建形成酶的催化中心，從而參與維持細胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)（劉苗苗等，2017）。

研究不同植物HDR基因表達和功能時，需要根據(jù)物種特性及其主要萜類化合物的類型和功能有針對性地進行分析和驗證。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PmHDR基因在馬尾松各個組織中均有表達，但在WT. 野生型擬南芥;" PmHDR. 轉(zhuǎn)基因擬南芥。下同。

老葉中表達量明顯高于其他部位，其次為幼葉、幼莖和老莖，在根中表達量最低，這與鐵皮石斛（吳秋菊等，2015）和甘薯（Dioscorea esculenta）（Wang et al.， 2012）中HDR的表達特征較為相似。而在其他研究中出現(xiàn)了不同結(jié)果，例如，在蘿芙木（Chen et al.， 2010）中，HDR基因在花中表達量最高，果實次之；在秦艽（Gentiana macrophylla）（岑文等，2015）中，HDR基因在花中表達水平顯著高于其他組織，而在根、莖、葉中表達差異不顯著；在銀杏（Ginkgo biloba）（Lu et al.， 2008）和橡膠（Hevea brasiliensis）（Sando et al.， 2008）中，HDR基因在根中表達量則顯著高于莖和葉。這說明HDR基因在不同植物中的表達模式和表達量存在較大的差異，這可能是因為在不同植物中，次生代謝所產(chǎn)生的萜類化合物類型和數(shù)量不同，進而導(dǎo)致其功能和應(yīng)用的差異，因此對于不同物種中HDR等萜類化合物生物合成上游關(guān)鍵基因的研究目的也各不相同。如對于秦艽（岑文等，2015）、艾葉（Artemisia argyi）（劉苗苗等，2017）、丹參（Salvia miltiorrhiza）（程琪慶等， 2013）等藥用植物來說，萜類及萜類衍生物是其重要的有效藥用成分；對于葡萄（Vitis vinifera）（陳天池等， 2023）來說，萜烯類物質(zhì)是葡萄香氣的主要貢獻者，香氣是衡量葡萄品質(zhì)的重要指標。

對密碼子偏好性進行分析，不僅有助于基因功能、蛋白表達的研究，亦有助于選擇合適的宿主，提高外源基因表達效率（吳憲明等，2007）。本研究對馬尾松PmHDR基因的密碼子偏好模式進行了系統(tǒng)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PmHDR基因在編碼蛋白時對CCA、AGA、GGA、ACU和CUU 5個密碼子的偏好性極強，而編碼脯氨酸的CCC、CCG和編碼Arg的CGG密碼子可能不參與PmHDR基因的翻譯過程。ENC、CAI、FOP等多個參數(shù)顯示，PmHDR基因?qū)γ艽a子的選擇偏好性弱，這可能導(dǎo)致其編碼蛋白表達水平較低。PmHDR基因中密碼子的GC和GC3s含量分別為39.92%和34.77%，說明其密碼子偏好以A/T結(jié)尾，這一結(jié)果符合馬尾松總體上偏好使用第3位為A/T堿基的密碼子的特征（朱沛煌等， 2020；鎬青青等，2022）。

由于馬尾松同源轉(zhuǎn)化平臺的搭建存在難度，至今未完成搭建，目前的功能基因分析只能暫時借助異源轉(zhuǎn)化。本研究將PmHDR基因的密碼子使用頻率分別與擬南芥、煙草、釀酒酵母和大腸桿菌等模式物種的基因組進行比較分析，發(fā)現(xiàn)相比于大腸桿菌原核表達系統(tǒng)，酵母真核表達系統(tǒng)更適合作為PmHDR基因的表達系統(tǒng)，在PmHDR遺傳轉(zhuǎn)化功能驗證中，擬南芥和煙草均可作為其遺傳轉(zhuǎn)化受體，這一結(jié)果與在PmDXR基因中的研究一致（朱靈芝等， 2021）。因此，在進行PmHDR基因功能驗證時，本研究使用了擬南芥作為其遺傳轉(zhuǎn)化受體，通過對比轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥在干旱和鹽脅迫條件下的表型差異，探究該基因的功能。

在正常生理條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥生長狀況略好于野生型擬南芥，但差異并不顯著。在干旱和鹽脅迫處理條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥生長受抑制情況顯著弱于野生型擬南芥，表現(xiàn)出更強的抗逆性，這與其上游基因PmDXS（李榮，2021）和PmDXR（朱靈芝，2021）的研究相似。前人研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在蘿芙木（Chen et al.， 2010）和鐵皮石斛（吳秋菊等，2015）中，HDR基因的表達均受ABA的調(diào)控。作為一種脅迫激素，ABA在植物抗逆過程中起著重要作用，廣泛地參與到植物抗寒、抗旱、耐鹽等多個脅迫響應(yīng)過程。ABA的生物合成主要有類萜途徑、類胡蘿卜素途徑兩條途徑，在高等植物中以類胡蘿卜素途徑為主（Yoshida et al.， 2019），而類胡蘿卜素是萜類合成MEP途徑的下游通路。因此，PmHDR基因?qū)Ω珊岛望}脅迫的響應(yīng)很可能與ABA有關(guān)且可能存在反饋調(diào)節(jié)。這一結(jié)果可以為馬尾松抗旱和抗鹽堿的分子育種提供候選基因和參考，但PmHDR基因調(diào)控干旱和鹽脅迫響應(yīng)的具體調(diào)節(jié)機制還需要進一步研究。

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（責任編輯 周翠鳴）