高效液相色譜法測(cè)定萊蕪雞腿蔥不同食用部位中維生素C含量的方法優(yōu)化

摘 要：本文采用高效液相色譜法測(cè)定萊蕪雞腿蔥蔥莖及蔥葉中的維生素C（L-抗壞血酸）含量，并進(jìn)行了方法優(yōu)化研究。樣品采用1.0%的草酸溶液作為提取液超聲提取2次，經(jīng)Kromasil C18柱分離后，用紫外檢測(cè)器在254 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，以保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。結(jié)果顯示，維生素C質(zhì)量濃度在2.0～100.0 mg·L-1時(shí)的線性關(guān)系較好（R=0.999 5），精密度試驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.33%（n=6），加標(biāo)回收率為94.9%～96.1%，方法檢出限為2.0×10-3 g·kg-1。該測(cè)試方法簡(jiǎn)便快速，能準(zhǔn)確測(cè)定萊蕪雞腿蔥蔥莖及蔥葉中維生素C含量。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；萊蕪雞腿蔥；蔥莖；蔥葉；維生素C

Optimization of High Performance Liquid Chromatography Method for Determining Vitamin C Content in Different Edible Parts of Laiwu Jitui Onion

CAO Feng1， GAO Feng1， WANG Yanhong2， GENG Dongqing1

（1. Jinan Food and Drug Inspection and Testing Center， Jinan 250102， China;

2. Laiwu District Comprehensive Inspection and Testing Center， Jinan 271100， China）

Abstract： In this paper， high performance liquid chromatography （HPLC） was used to determine the vitamin C （L-ascorbic acid） content in the onion stems and leaves of Laiwu Jitui onions， and the method was optimized. The samples were extracted twice with 1.0% oxalic acid solution as the extracting solution by ultrasonic extraction， separated on a Kromasil C18 column， and detected by an ultraviolet detector at 254 nm. The samples were qualitatively analyzed by the retention time， and quantitatively analyzed by the external standard method. The results showed that there was a good linear relationship （R=0.999 5） when the mass concentration of vitamin C was between 2.0 mg·L-1"and 100.0 mg·L-1. The relative standard deviation of the precision test was 1.33% （n=6）， the recovery rate was 94.9%～96.1%， and the detection limit of the method was 2.0×10-3 g·kg-1. This testing method is simple and fast， and can accurately determine the vitamin C content in the stems and leaves of Laiwu Jitui onion.

Keywords： high performance liquid chromatography; Laiwu Jitui onion; onion stem; onion leave; vitamin C

萊蕪雞腿蔥是著名的“萊蕪三辣”之一，已有2 000多年的栽培歷史，是品質(zhì)優(yōu)良的山東地方特色蔬菜，2013年獲得了原農(nóng)業(yè)部“農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志”原產(chǎn)地認(rèn)證。萊蕪雞腿蔥蔥白質(zhì)地細(xì)脆，辛辣味濃，適宜熟食，其營(yíng)養(yǎng)比較豐富，含有氨基酸、無(wú)機(jī)鹽、蛋白質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，富含殺菌能力極強(qiáng)的大蒜素和維生素A、維生素C等活性成分[1-2]。維生素C又叫L-抗壞血酸，是一種水溶性維生素，有較強(qiáng)的抗氧化作用，是人體維持正常代謝不可缺少的一類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有提高人體免疫力，預(yù)防動(dòng)脈硬化等功效，嚴(yán)重缺乏維生素C會(huì)引起壞血病[3-4]。

蔥葉中維生素C含量要高于蔥莖[5]，但蔥葉卻常作為廢棄物丟棄，從資源利用及環(huán)境角度來(lái)說(shuō)容易造成浪費(fèi)和污染，因此準(zhǔn)確測(cè)定蔥莖及蔥葉中的維生素C含量對(duì)于其充分利用具有重要意義。維生素C的常用檢測(cè)方法有2，6–二氯靛酚鈉鹽滴定法、高效液相色譜法、紫外分光光度法等[6-7]，其中高效液相色譜法是目前最常用的檢測(cè)方法，具有操作簡(jiǎn)單、快速靈敏、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)[8-9]。

為充分提取萊蕪雞腿蔥不同食用部位中的維生素C，并防止其在測(cè)試過(guò)程中氧化分解，本文參照相關(guān)研究[6，10-11]并加以優(yōu)化，以1.0%的草酸溶液替代國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.86—2016[12]中使用的有劇毒的偏磷酸溶液作為提取液，超聲提取兩次，以提高維生素C的提取率，在此基礎(chǔ)上對(duì)高效液相色譜儀相關(guān)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，旨在為合理利用萊蕪雞腿蔥提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

萊蕪雞腿蔥購(gòu)于濟(jì)南市萊蕪區(qū)牛泉鎮(zhèn)雞腿蔥種植專業(yè)合作社。維生素C標(biāo)準(zhǔn)品（L-抗壞血酸），默克股份兩合公司；甲醇（色譜純），天津市康科德科技有限公司；草酸（優(yōu)級(jí)純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；檢驗(yàn)用水為自制純凈水。

LC-20A高效液相色譜儀（紫外檢測(cè)器），日本島津公司；UV-8000A雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密儀器儀表有限公司；JM-38D-45超聲波清洗機(jī)，深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；2-16KL高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)SIGMA公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱（150 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%草酸溶液（5∶95，V∶V）；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL；色譜柱柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。以保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量[11]。

1.2.2 樣品處理

稱取切碎的蔥莖及蔥葉樣品各10 g（精確至0.001 g）置于研缽中，加入1.0%的草酸溶液10 mL，迅速研磨成漿，轉(zhuǎn)移至容量為50 mL的離心管中，再用少量1.0%的草酸溶液沖洗研缽2次，渦旋混勻，放入超聲波振蕩器中低溫超聲提?。üβ蕿?00 W，水溫4 ℃左右）20 min，在高速冷凍離心機(jī)中離心10 min（4 ℃，6 000 r·min-1），將全部上清液轉(zhuǎn)移到25 mL棕色容量瓶中，冰箱中冷藏。研缽中再加入10 mL 1.0%的草酸溶液，渦旋混勻后重復(fù)上述步驟，將兩次提取液合并后用1.0%的草酸溶液定容并混勻，用孔徑為0.45 μm的水相濾膜過(guò)濾后冷藏。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取維生素C標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg（精確至0.1 mg），用純水定容至10 mL，配制成1 000 mg·L-1的中間液；再用純水將標(biāo)準(zhǔn)中間液逐級(jí)稀釋成濃度為2.0 mg·L-1、20.0 mg·L-1、40.0 mg·L-1、60.0 mg·L-1、80.0 mg·L-1及100.0 mg·L-1的維生素C標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃避光保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測(cè)器波長(zhǎng)的確定

利用紫外分光光度計(jì)對(duì)濃度為40 mg·L-1的維生素C標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示維生素C在波長(zhǎng)254 nm處有最大吸收，為減少測(cè)試時(shí)雜質(zhì)干擾，提高儀器的穩(wěn)定性，測(cè)試波長(zhǎng)確定為254 nm。

2.1.2 流動(dòng)相組分的選擇

維生素C有較強(qiáng)的還原性[13]，通常條件下較容易氧化，但是在弱酸性條件下能夠保持穩(wěn)定[14]。為保證維生素C在測(cè)試過(guò)程中的穩(wěn)定性，需要選擇酸性流動(dòng)相，考慮到較強(qiáng)酸性的流動(dòng)相可能會(huì)對(duì)液相系統(tǒng)產(chǎn)生較大的腐蝕性[15]，而國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中流動(dòng)相使用的離子對(duì)試劑會(huì)對(duì)色譜柱產(chǎn)生不可逆的損害，參考相關(guān)文獻(xiàn)資料[7-9，16]，本研究選用甲醇-0.1%草酸溶液作為流動(dòng)相。

參照相關(guān)研究[8，11，13，16]，研究甲醇與0.1%草酸溶液的體積比為5∶95、10∶90及20∶80時(shí)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相的體積比為5∶95時(shí)目標(biāo)物保留時(shí)間為2 min左右，且目標(biāo)峰與干擾峰有較好的分離；當(dāng)流動(dòng)相體積比為10∶90及20∶80時(shí)，維生素C的保留時(shí)間變短，其色譜峰與干擾峰無(wú)法完全分離。考慮到定量精度，本文選擇甲醇與0.1%草酸溶液體積比為5∶95。

2.1.3 柱溫的確定

色譜柱溫度升高，柱內(nèi)壓力變小，維生素C的保留時(shí)間變短，會(huì)影響色譜柱的分離效果[16]。由于維生素C在高溫下不穩(wěn)定，本研究選擇柱溫為25 ℃。

根據(jù)上述確定的測(cè)試條件，維生素C標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的色譜圖如圖1所示，萊蕪雞腿蔥蔥莖及蔥葉色譜圖見(jiàn)圖2、圖3。

2.2 維生素C的線性和檢出限

按1.2.3項(xiàng)方法配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，以維生素C質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖4可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=49 331X+10 072，在2.0～100.0 mg·L-1維生素C濃度及峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R=0.999 5。按照3倍信噪比確定方法檢出限為2.0×10-3 g·kg-1。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取雞腿蔥蔥葉樣品按照1.2.2項(xiàng)方法處理，在1.2.1項(xiàng)色譜條件下對(duì)樣品分別測(cè)定6次，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1?？梢钥闯?，精密度實(shí)驗(yàn)的RSD為1.33%，表明該測(cè)試方法的精密度較好。

2.4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

以雞腿蔥蔥葉為實(shí)驗(yàn)樣品，在校正曲線的線性范圍內(nèi)，按照表2中的添加量進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2?？梢钥闯?，樣品加標(biāo)回收率在94.9%～96.1%，RSD為0.67%，表明測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.5 樣品測(cè)定

按本文實(shí)驗(yàn)方法對(duì)萊蕪雞腿蔥樣品的蔥莖和蔥葉進(jìn)行了檢測(cè)，蔥莖中維生素C含量為5.6 mg/100 g，蔥葉中維生素C的含量為11.1 mg/100 g（表1），蔥葉中維生素C的含量遠(yuǎn)高于蔥莖，是蔥莖含量的1.98倍。

3 結(jié)論

萊蕪雞腿蔥蔥莖、蔥葉中的維生素C采用1.0%的草酸溶液超聲提取后，以體積比為5∶95的甲醇-0.1%草酸溶液為流動(dòng)相，利用紫外檢測(cè)器在波長(zhǎng)為254 nm的條件下檢測(cè)，一次進(jìn)樣，可以在3 min內(nèi)完成對(duì)萊蕪雞腿蔥中維生素C的分析。在質(zhì)量濃度為2.0～100.0 mg·L-1時(shí)，維生素C的校準(zhǔn)曲線線性關(guān)系較好，R=0.999 5，精密度試驗(yàn)的平均RSD為1.33%（n=6），方法的加標(biāo)回收率為94.9%～96.1%，檢出限為2.0×10-3 g·kg-1。本方法分離效果好、簡(jiǎn)單高效，可用于萊蕪雞腿蔥蔥莖與蔥葉中維生素C含量的測(cè)定。

參考文獻(xiàn)

[1]呂清章.萊蕪地區(qū)雞腿蔥種植關(guān)鍵技術(shù)[J].中國(guó)果菜，2019，39（4）：67-69.

[2]李立國(guó)，史秀娟，趙濟(jì)紅，等.雞腿蔥新品種“萊蔥一號(hào)”的特征特性研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，48（3）：52-55.

[3]車長(zhǎng)遠(yuǎn).高效液相色譜快速測(cè)定蘋果醋飲料中維生素C的含量[J].中國(guó)釀造，2010（12）：157-159.

[4]姜淑，彭永芳.高效液相色譜法測(cè)定木瓜中維生素C的含量[J].昆明學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，31（6）：102-103.

[5]單成偉.大蔥高產(chǎn)高效種植及其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[J].吉林蔬菜，2013（3）：24-25.

[6]王樂(lè)樂(lè)，安華明.HPLC測(cè)定刺梨果實(shí)中維生素C含量方法的優(yōu)化[J].現(xiàn)代食品科技，2013，29（2）：397-400.

[7]陳治明，洪亮.高效液相色譜法測(cè)定牛奶中的維生素C含量[J].現(xiàn)代食品科技，2011，27（6）：707-709.

[8]劉嘉祺，孫仁國(guó).高效液相色譜法測(cè)定圣女果中維生素C的含量[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2012，18（7）：69-70.

[9]郭梅鳳，張桂蓮，蘇琨，等.高效液相色譜法測(cè)定枸杞中維生素C含量[J].包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，28（3）：30-32.

[10]蔡曉靜，潘麗麗，李慧娟，等.刺梨的炮制及其炮制品中維生素C測(cè)定法[J].貴州師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2011，29（4）：6-10.

[11]趙昕梅，遠(yuǎn)凌威，陳世鋒，等.高效液相色譜法測(cè)定果蔬中維生素C含量[J].信陽(yáng)師范學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013，26（1）：49-53.

[12]中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中抗壞血酸的測(cè)定GB 5009.86—2016[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[13]董珊，姜波，劉長(zhǎng)建，等.獼猴桃中維生素C的高效液相色譜分析[J].中央民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，19（3）：21-25.

[14]田文禮，趙亞周，方小明，等.高效液相色譜法檢測(cè)蜂花粉中總維生素C[J].北京工商大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，30（2）：35-38.

[15]李金梅，許輝，楊秋林，等.高效液相色譜法測(cè)定內(nèi)蒙古土默特旗沙棘果中維生素C含量[J].光譜實(shí)驗(yàn)室，2008（6）：1265-1268.

[16]曹峰.高效液相色譜法測(cè)定沾化冬棗中維生素C含量方法的優(yōu)化[J].齊魯工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，34（5）：37-42.

作者簡(jiǎn)介：曹峰（1978—），男，山東新泰人，碩士，正高級(jí)工程師。研究方向：食品檢驗(yàn)檢測(cè)。