高效液相色譜法測定糕點和果汁中納他霉素的方法學驗證

摘 要：為了驗證寶雞市食品藥品檢驗檢測中心是否有能力開展納他霉素新方法《食品安全國家標準 食品中納他霉素的測定》（GB 5009.286—2022）的檢測項目。本文使用高效液相色譜儀，對糕點和果汁中納他霉素進行分析，外標法定量，驗證了本方法的線性關(guān)系、方法檢出限、精密度和回收率。結(jié)果表明，納他霉素在0.5～10.0 μg·mL-1呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，方法檢出限、精密度和回收率均能達到標準方法要求。因此，本實驗室具備檢測納他霉素的能力。

關(guān)鍵詞：納他霉素；外標法；高效液相色譜儀；方法學驗證

Methodological Validation of High Performance Liquid Chromatography for the Determination of Natamycin in Pastries and Fruit Juice

LU Wei， ZHOU Meili

（Baoji Food and Drug Inspection and Testing Center， Baoji 721000， China）

Abstract： In order to verify whether the Baoji Food and Drug Inspection and Testing Center has the ability to carry out the testing project of the new method GB 5009.286—2022 for natamycin. This article uses a high-performance liquid chromatography to analyze natamycin in pastries and fruit juice. The external standard method is used for quantification to verify the linear relationship， detection limit， precision， and recovery rate of this method. The results showed that natamycin exhibited a good linear relationship within the range from 0.5 μg·mL-1 to"10 μg·mL-1， and the detection limit， precision， and recovery rate of the method can meet the requirements of the standard method. Therefore， our laboratory has the ability to detect natamycin.

Keywords： natamycin; external standard method; high-performance liquid chromatography; methodology validation

納他霉素，又名匹馬霉素，是一種外觀呈近白色或奶油黃色，無臭無味的結(jié)晶粉末，它是天然的多烯大環(huán)內(nèi)酯類物質(zhì)，對大部分的霉菌和酵母菌都具有極強的抑制作用[1]。研究表明，納他霉素在水和油脂中的溶解度極低，人體攝入少量不會造成有害影響[2]。近些年通常將其應用于食品保鮮領(lǐng)域，作為防腐劑在焙烤食品和水果表面使用，延長其保質(zhì)期，或者與山梨酸鉀進行復配使用，既可以節(jié)約成本，又效果顯著[3-4]。在《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）中規(guī)定其殘留量應小于10 mg·kg-1。但不良商家為降低成本，延長貨期而違規(guī)使用，因此加強對納他霉素的監(jiān)管十分必要。

目前在食品檢測國家標準中，以高效液相色譜法為主要檢測手段。新方法《食品安全國家標準 食品中納他霉素的測定》（GB 5009.286—2022）于2022年12月30日實施，此方法中規(guī)定了食品中納他霉素的處理方法。本文在此基礎(chǔ)上對糕點和果汁類方法的線性范圍、基質(zhì)效應、方法檢出限、精密度和回收率進行驗證，并對其在本實驗室的有效性進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（色譜純），DIKMA；冰乙酸，成都市科龍化工試劑廠；實驗用一級水；納他霉素有證標準物質(zhì)（C33H47NO13，CAS號：7681-93-8），純度≥98%，TM Standard。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultimate3000高效液相色譜儀（配紫外檢測器），Thermo Fisher Scientific；SQP Practum224-1CN電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；KQ-500DE超聲波提取器，昆山市超聲儀器有限公司；TG16-WS離心機，湖南滬康離心機有限公司；VG3渦旋混勻器，IKA。

1.3 色譜條件

色譜柱：InertSustain C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；檢測波長：305 nm；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：10 μL；流動相A：甲醇；流動相B：乙酸+水=5+95（體積比）。梯度洗脫程序見表1。

1.4 實驗方法

1.4.1 糕點類處理方法

稱取混勻的樣品約5.0 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入15.0 mL甲醇超聲提取20 min，加入5.0 mL水混勻，以4 000 r·min-1離心10 min，上清液經(jīng)有機濾膜過濾待用。

1.4.2 果汁類處理方法

稱取混勻的樣品約5.0 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入15.0 mL甲醇超聲提取20 min，以4 000 r·min-1離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶，用水定容至刻度混勻，經(jīng)有機濾膜過濾待用。

1.4.3 標準曲線的繪制

準確稱量25 mg（精確至0.1 mg）納他霉素標準物質(zhì)，加入1 mL冰乙酸及適量甲醇超聲溶解，用甲醇定容至100 mL。準確吸取10.0 mL上述溶液于50 mL容量瓶中，用初始流動相定容至刻度混勻配制成標準中間液。再分別吸取0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL標準中間液于5個10 mL容量瓶中，用初始流動相定容，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

本實驗中，納他霉素在冰乙酸存在的酸性條件下，在甲醇中溶解度較高。因此選擇初始流動相作為定容試劑，得到的納他霉素的峰型較好。選用甲醇：（乙酸+水=5+95）=55∶45的流動相比例，使納他霉素的出峰時間保持在10 min左右，可以避免雜質(zhì)峰干擾。

2.2 線性關(guān)系考察

按上述色譜條件，以標準系列工作液中納他霉素的濃度為橫坐標，得到的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，納他霉素在0.5～10.0 μg·mL-1呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=0.887 8x+0.000 05，相關(guān)系數(shù)r為0.999 8。

2.3 方法檢出限考察

稱取11份陰性樣品，按照標準規(guī)定的方法檢出限濃度，加入陰性樣品中，按1.4的方法處理，進樣測試。根據(jù)《化學分析方法驗證確認和內(nèi)部質(zhì)量控制要求》（GB/T 32465—2015）[5]中7.5.4的要求，11次重復性測試的偏差均在方法檢出限（±20%）范圍內(nèi)，認為實驗方法檢出限滿足相關(guān)要求，詳見表2、表3。

2.4 精密度考察

稱取陰性樣品21份，分為3組，分別加入不同濃度的標準溶液，制成高中低3種濃度的樣品，按上述條件進行測定，每個水平重復檢測7次，計算其RSD值及實驗室內(nèi)變異系數(shù)CV，以反映測定結(jié)果之間的精密度，結(jié)果見表4、表5，根據(jù)《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》（GB/T 27417—2017）中5.6.1及附錄B中的要求，精密度符合驗證要求。

2.5 加標回收考察

稱取陰性樣品9份，分成3組，分別加入檢出限、定量限、10倍檢出限 3種濃度的標準溶液，按上述色譜條件，進行測定。測出3種水平加樣回收率平均值，結(jié)果見表6、表7，根據(jù)《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》（GB/T 27417—2017）[6]中5.5.2及附錄A中的要求，回收率符合驗證要求。

2.6 實際樣品測定

為進一步驗證本方法的有效性，選取寶雞市市售的糕點和果汁進行檢測，結(jié)果均為未檢出，并且線性和回收率與本驗證結(jié)果一致，后續(xù)將繼續(xù)抽檢更多的樣品，為寶雞地區(qū)納他霉素的監(jiān)管提供有力的數(shù)據(jù)支持。

3 結(jié)論

在本實驗室現(xiàn)有的儀器設(shè)備和實驗條件下，以《食品安全國家標準 食品中納他霉素的測定》

（GB 5009.286—2022）為基礎(chǔ)，研究了糕點和果汁類納他霉素的檢測方法。經(jīng)驗證，該方法對糕點和果汁類檢測呈現(xiàn)良好的線性范圍，方法準確性和重復性好，本實驗室能力滿足新方法要求。

參考文獻

[1]陳方圓，戴久竣，徐家延，等.納他霉素抑菌機制及在食品保鮮中的應用研究進展[J].食品科技，2021，46（9）：48-49.

[2]孫成行，張福娟，王廷平.納他霉素的應用與檢測方法研究進展[J].中國食品添加劑，2017，5（3）：178-182．

[3]張祖麗，徐歡，李歆，等.納他霉素在蛋糕表面防腐保鮮中的應用研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2023，49（16）：182-187.

[4]關(guān)欣，郭迎迎，張雨桐，等.納他霉素在食品檢測中的研究新進展[J].吉林農(nóng)業(yè)，2019（21）：75.

[5]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，國家標準化管理委員會.化學分析方法驗證確認和內(nèi)部質(zhì)量控制要求：

GB/T 32465—2015[S].北京：中國標準出版社，2015.

[6]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，國家標準化管理委員會.合格評定 化學分析方法確認和驗證指南：GB/T 27417—2017[S].北京：中國標準出版社，2017.

作者簡介：盧薇（1989—），女，陜西寶雞人，碩士，助理工程師。研究方向：食品檢驗。