牛奶中勞拉西泮的高效液相色譜分析

摘" 要：為了建立檢測牛奶中勞拉西泮的高效液相色譜分析方法，用體積分?jǐn)?shù)0.2%甲酸-乙腈溶液離心提取樣品中勞拉西泮殘留（重復(fù)3次），C18固相萃取柱凈化，洗脫液經(jīng)氮?dú)獯蹈珊笥皿w積分?jǐn)?shù)50%甲醇水溶液溶解，0.22 μm濾膜過濾，供高效液相色譜測定.采用安捷倫ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）為分析柱，V（甲醇）∶V（水）=68∶32為流動(dòng)相，紫外檢測器在230 nm波長處檢測.結(jié)果表明：勞拉西泮在40～500 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=4.047x-36.11，相關(guān)系數(shù)為0.999，檢出限為0.927 μg/mL，定量限為3.097 μg/mL，牛奶中添加質(zhì)量濃度分別為70、180、300 μg/mL，添加回收率為81.27%～97.58%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%，日內(nèi)、日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～2.6%.該方法靈敏度高，準(zhǔn)確度好，簡便，快捷，適用于牛奶中勞拉西泮的檢測分析.

關(guān)鍵詞：勞拉西泮；牛奶；高效液相色譜法；外標(biāo)法

中圖分類號(hào)：O627""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""" 文章編號(hào)：10001565（2024）05049509

DOI：10.3969/j.issn.10001565.2024.05.006

High performance liquid chromatography analysis of lorazepam in milk

ZHENG Jiayan， LI Yiqing， FENG Yao， HAN Xiaoli， WANG Tingxin， LIU Zhenghao

（College of Quality and Technical Supervision， Hebei University， Baoding 071002， China）

Abstract： In order to establish detection of lorazepam in milk， high performance liquid chromatography （HPLC） method was used， The conditims are： dissolved in 0.2% formic acid， centrifugal extraction of lorazepam residual in acetonitrile solution， repeat 3 times， C18 solid phase extraction column， eluent after nitrogen blow dry with volume fraction of 50% methanol aqueous solution dissolve， 0.22 mu m filter membrane filtration. An Agilent ZORBAX SB-C18 column （4.6 mm×150 mm，5 μm） was used as the analytical column with methanol： water （V/V）=68∶32 as the mobile phase. The detection was carried out at 230 nm with a UV detector.The results showed that： the linear range of lorazepam was 40～500 μg/mL， the regression equation was y=4.047x-36.11， the correlation coefficient was 0.999， the limit of detection was 0.927 μg/mL， the limit of quantification was 3.097 μg/mL， and the additive levels in milk were 70， 180， 300 μg/mL， respectively.The recoveries ranged from 81.27% to 97.58% with relative standard deviations （RSD） of 1.1%， intra-day and inter-day RSD of 1.2% to 2.6%. The method is sensitive， accurate， simple and quick， and suitable for the determination and analysis of lorazepam in milk.

收稿日期：20240605;修回日期：20240625

基金項(xiàng)目：

河北省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（18275502D）

第一作者：鄭佳妍（1997—），女，河北大學(xué)在讀碩士研究生，主要從事食品安全快速檢測技術(shù)研究. E-mail：574166857@qq.com

通信作者：王庭欣（1965—），女，河北大學(xué)教授，主要從事食品安全快速檢測技術(shù)研究.E-mail：tingxingwang@126.com

劉崢顥（1973—），女，河北大學(xué)副教授，主要從事食品安全及標(biāo)準(zhǔn)化研究.E-mail：sgl1997@126.com

Key words： lorazepam; milk; high performance liquid chromatography; external standard method

勞拉西泮是一種具有抗焦慮、抗癲癇、鎮(zhèn)靜、催眠作用的苯二氮卓類藥物，也被稱作軟毒品，與其他鎮(zhèn)靜藥物相比，起效迅速、作用時(shí)間長，是較為常用的鎮(zhèn)靜劑類藥物，可應(yīng)用于抑郁癥和焦慮癥的治療［1-3］.服用小劑量勞拉西泮后可能會(huì)出現(xiàn)頭暈、嗜睡、乏力等癥狀，大劑量使用該藥品可能會(huì)出現(xiàn)呼吸困難、呼吸道堵塞等問題，易成癮，危害人類健康［4-6］.該藥物常被飼料商違法添加到奶牛飼料中，使奶牛多睡少動(dòng)，減少奶牛體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，提高奶牛的產(chǎn)奶量，同時(shí)勞拉西泮也會(huì)殘留在牛奶中造成獸藥殘留問題［7］.目前對于勞拉西泮的檢測方法有高效液相色譜法［8］、氣相色譜法［9］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［10］、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［11］等，但無論是哪種方法，檢測樣品基本是人血漿或尿液［11-14］.對于食品類樣品中的勞拉西泮的檢測方法鮮見報(bào)道，因此，建立快捷、簡便、高效的檢測牛奶中勞拉西泮的方法，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值.

1" 儀器與材料

1.1" 儀器

高效液相色譜儀（1260 Infinity Ⅱ，Agilent Technologies）；冷凍離心機(jī)（FC5718R，奧豪斯儀器有限公司）；超聲清洗機(jī)（SB25-12DTD，寧波新芝生物科技公司）；氮吹儀（TTL-DC型氮吹儀，北京同泰聯(lián)科技公司）；C18固相萃取柱（江蘇杰島高新材料科技公司）.

1.2" 材料

甲醇、乙腈（色譜純，天津科密歐股份有限公司）；勞拉西泮（1.0 mg/g，湖南洞庭藥業(yè)公司）；脫脂牛奶（200 mL，廣州杰鈥公司）.

1.3" 溶液配制

1.3.1" 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

500 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取0.050 0 g勞拉西泮，甲醇溶液定容至100.0 mL，封口膜塑封置于2～8 ℃中保存.

標(biāo)準(zhǔn)工作液：體積分?jǐn)?shù)50%甲醇水溶液作為稀釋溶劑，分別得到質(zhì)量濃度為40、60、70、80、100、180、200、300、500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液.

1.3.2" 加標(biāo)試樣溶液的配制

分別配制勞拉西泮質(zhì)量濃度為70、180、300 μg/mL的牛奶樣品.

1.3.3" 其他溶液的配制

體積分?jǐn)?shù)0.2%甲酸-乙腈溶液，體積分?jǐn)?shù)20%、50%甲醇水溶液.

1.4" 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Minitab17分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理.

2" 方法

2.1" 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣器溫度：4 ℃；流動(dòng)相：V（甲醇）∶V（水）=68∶32；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20.0 μL；檢測波長：230 nm.

2.2" 流動(dòng)相選擇

流動(dòng)相A為V（體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液）∶V（體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-乙腈溶液）=1∶1，流動(dòng)相B為V（甲醇）∶V（水）=68∶32.將標(biāo)準(zhǔn)工作液分別在流動(dòng)相A、B下進(jìn)樣，對2種流動(dòng)相下的色譜圖、峰面積進(jìn)行比較，確定最優(yōu)的流動(dòng)相.

2.3" 稀釋溶劑選擇

2種稀釋溶劑，分別為體積分?jǐn)?shù)50%甲醇水溶液和純甲醇.

用稀釋溶劑將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成80、200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)樣2次，觀察比較2種稀釋溶劑的色譜圖及峰面積，確定最優(yōu)的稀釋溶劑.

2.4" 出峰時(shí)間、檢測時(shí)間的確定

將標(biāo)準(zhǔn)工作液（質(zhì)量濃度為2、40、80 μg/mL）按質(zhì)量濃度從低到高依次進(jìn)樣，觀察出峰時(shí)間及峰面積的變化，確定出峰時(shí)間及檢測時(shí)間.

2.5" 樣品前處理

2.0 mL脫脂牛奶中加入2.0 mL體積分?jǐn)?shù)0.2%甲酸-乙腈溶液，旋渦震蕩1 min，在8 000 r/min下離心5 min，取上清液，重復(fù)操作2次，合并上清液.上清液在8 000 r/min下再次離心5 min，取上清液［15］.于50 ℃水浴條件下氮?dú)獯蹈?加入1 mL體積分?jǐn)?shù)20%甲醇水溶液旋渦溶解殘留物，備用.

依次用5.0 mL水和5.0 mL甲醇活化C18固相萃取柱，取上述備用液過柱，控制流速（每3～4 s 1滴），用5.0 mL水淋洗，加壓擠干，用5.0 mL甲醇洗脫，收集洗脫液.

洗脫液于50 ℃水浴條件下氮?dú)獯蹈?，?.0 mL體積分?jǐn)?shù)50%甲醇水溶液溶解殘余物，0.22 μm濾膜過濾，供高效液相色譜測定.

2.6" 實(shí)際樣品檢測

經(jīng)過樣品前處理的脫脂牛奶在已優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)樣，做平行實(shí)驗(yàn).

2.7" 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.7.1" 線性范圍的確定

將標(biāo)準(zhǔn)工作液（2、20、40、80、100、200、300、500 μg/mL）按質(zhì)量濃度從低到高依次進(jìn)樣，觀察峰面積變化，確定標(biāo)準(zhǔn)工作液的線性范圍.

2.7.2" 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將標(biāo)準(zhǔn)工作液（40、60、80、100、200、300、500 μg/mL）在2.1色譜條件下從低到高質(zhì)量濃度進(jìn)樣檢測，記錄各質(zhì)量濃度下勞拉西泮的色譜峰面積.以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（μg/mL），標(biāo)準(zhǔn)品峰面積為縱坐標(biāo)（mAU·s），利用Minitab17分析軟件進(jìn)行計(jì)算擬合，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù).

2.8" 檢出限和定量限

當(dāng)S/N=3時(shí)，目標(biāo)物質(zhì)量濃度為勞拉西泮的最低檢出限；當(dāng)S/N=10時(shí)，目標(biāo)物質(zhì)量濃度為勞拉西泮的最低定量限［16］.

2.9" 回收率

70、180、300 μg/mL的3份加標(biāo)牛奶樣品和1份空白牛奶樣品在上述色譜條件下從低到高質(zhì)量濃度上機(jī)檢測，做平行實(shí)驗(yàn)，記錄各質(zhì)量濃度的峰面積，將峰面積代入回歸方程計(jì)算待測質(zhì)量濃度、各質(zhì)量濃度回收率以及同一質(zhì)量濃度下的平均回收率，考察實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度.

勞拉西泮的回收率=（加標(biāo)樣品的測定值-空白樣品的測定值）/加標(biāo)量×100%.

2.10" 精密度

2.10.1" 方法精密度

300 μg/mL的牛奶樣品重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄每次的峰面積以及保留時(shí)間，計(jì)算峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察方法的精密度.

2.10.2" 儀器精密度

1）日內(nèi)精密度

在上述2.1色譜條件下，100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液在同一天內(nèi)的8、10、12、14、16、18 h時(shí)分別進(jìn)樣1次，記錄峰面積及保留時(shí)間，計(jì)算實(shí)際質(zhì)量濃度及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，檢測儀器日內(nèi)精密度.

2）日間精密度

在上述2.1色譜條件下，100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液分別在周一、周三、周五的上午9點(diǎn)進(jìn)樣1次，記錄峰面積及保留時(shí)間，計(jì)算實(shí)際質(zhì)量濃度及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，檢測儀器日間精密度.

3" 結(jié)果與討論

3.1" 色譜條件的優(yōu)化

3.1.1" 流動(dòng)相的選擇

分析結(jié)果的準(zhǔn)確度與流動(dòng)相的選擇密切相關(guān).在流動(dòng)相A下，將80 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)樣分析.勞拉西泮的出峰時(shí)間在9.5～10.5 min，出峰效果良好，回歸方程為y=3.883x-41.05，其中x為標(biāo)準(zhǔn)工作液的質(zhì)量濃度（μg/mL），y為標(biāo)準(zhǔn)工作液所對應(yīng)的峰面積（mAU·s），相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.998，線性關(guān)系良好.但是溶劑峰卻雜亂無章，有明顯倒峰，且峰面積巨大，如圖2所示.

表1為流動(dòng)相A下60 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液在不同波長處的峰面積.理論上，由于230 nm是最大檢測波長，在波長為220、225 nm時(shí)，藥品峰的峰面積應(yīng)小于波長為230 nm時(shí)的峰面積，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其相悖，考慮到在此流動(dòng)相下檢測波長與峰面積的理論關(guān)系變化不明顯以及溶劑峰混亂、藥品峰不規(guī)則等原因，流動(dòng)相A視為備用選項(xiàng).

在流動(dòng)相B下，將100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)樣分析.出峰時(shí)間為10.5～11.5 min，由此可以看出改變流動(dòng)相，出峰時(shí)間會(huì)略微改變.此時(shí)出峰效果良好，基線平穩(wěn)，能明顯觀察到在230 nm處，檢測到的峰面積最大，而且當(dāng)波長增大或減小時(shí)，勞拉西泮的峰面積都適當(dāng)增大減小，如表2所示.圖3為液動(dòng)相B下的80 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液的色譜.見圖3可知，溶劑峰僅有微小倒峰及1個(gè)很小的正峰，因此選用V（甲醇）∶V（水）=68∶32為流動(dòng)相.

3.1.2" 稀釋溶劑的選擇

一般會(huì)選用流動(dòng)相做稀釋溶劑，這樣可以提高分離速度，減少稀釋溶劑對待測物的影響，使峰形尖銳、對稱，基線更加平穩(wěn)，減少溶劑峰.

用甲醇作稀釋溶劑配制80、200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)樣2次，幾次進(jìn)樣檢測的結(jié)果表明：以甲醇做稀釋溶劑時(shí)，不僅會(huì)出現(xiàn)雙肩峰，還有出峰雜亂、基線不穩(wěn)、溶劑峰以及雜質(zhì)峰過多等問題（圖4），影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果及精密度.當(dāng)以體積分?jǐn)?shù)50%甲醇水溶液做稀釋溶劑時(shí)，基線平穩(wěn)，峰形對稱，溶劑峰較少，如圖5所示.因此排除以甲醇做稀釋溶劑的方法，決定以體積分?jǐn)?shù)50%甲醇水溶液做稀釋溶劑，來配制標(biāo)準(zhǔn)工作液.

3.1.3" 出峰時(shí)間的確定

將2 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)樣，檢測時(shí)間設(shè)置為20～30 min，發(fā)現(xiàn)除溶劑峰外，幾乎沒有出峰，如圖6所示.隨后進(jìn)樣40 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，觀察到1個(gè)小峰，出峰時(shí)間為10.5～11.5 min；80 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)樣，觀察到在10.5～11.5 min內(nèi)的峰面積增大，其余峰面積幾乎不變.因此可以確定最低出峰質(zhì)量濃度在2～40 μg/mL、出峰時(shí)間為10.5～11.5 min、檢測時(shí)間設(shè)定為12 min.

3.2" 樣品前處理優(yōu)化

此方法與GB 29681—2013食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)［17］中的樣品前處理方法相比，所需設(shè)備簡單，處理過程簡便、快捷，對藥品耗費(fèi)量較少，大大縮短了樣品處理時(shí)間.牛奶中存在大量蛋白質(zhì)和脂肪，C18固相萃取柱常用于處理牛奶等類似基質(zhì)的樣品，經(jīng)處理后，鎮(zhèn)靜劑的提取率可達(dá)80%以上［18］.

3.3" 實(shí)際樣品檢測

經(jīng)檢測，脫脂牛奶中無勞拉西泮.

3.4" 標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.4.1" 線性范圍的確定

對比2、20、40、80、100、200、300、500 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液的峰面積，明顯觀察到2 μg/mL沒有出樣品峰，如圖6所示.20 μg/mL樣品峰極小，如圖7所示.在40～500 μg/mL內(nèi)勞拉西泮的出峰效果良好，500 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液色譜圖見圖8.據(jù)此配制質(zhì)量濃度為40、60、80、100、200、300、500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液.

3.4.2" 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將標(biāo)準(zhǔn)工作液按質(zhì)量濃度從低到高進(jìn)樣得到的峰面積數(shù)據(jù)如表3所示.根據(jù)質(zhì)量濃度和各質(zhì)量濃度所對應(yīng)的峰面積進(jìn)行擬合回歸，得到線性回歸方程為y=4.047x-36.11，相關(guān)系數(shù)為0.999，線性關(guān)系良好.

3.5" 檢出限和定量限

用儀器計(jì)算S/N=3時(shí)，樣品中勞拉西泮的質(zhì)量濃度為0.927 μg/mL，是最低檢出限；當(dāng)S/N=10時(shí)，勞拉西泮的質(zhì)量濃度為3.091 μg/mL，是最低定量限.

3.6" 回收率

實(shí)驗(yàn)所得具體數(shù)據(jù)如表4所示.結(jié)果表明回收率為81.27%～97.58%，該方法具有良好的準(zhǔn)確度.空白牛奶樣品以及質(zhì)量濃度為300 μg/mL加標(biāo)牛奶樣品的色譜圖分別如圖9、10所示，在本實(shí)驗(yàn)所用的脫脂牛奶中并未檢測出勞拉西泮.

3.7" 精密度

3.7.1" 方法精密度

將300 μg/mL的加標(biāo)牛奶重復(fù)進(jìn)樣得到的峰面積數(shù)據(jù)如表5所示，峰面積RSD為1.1%.此數(shù)據(jù)表明該方法的精密度良好.

3.7.2" 儀器精密度

1）日內(nèi)精密度

按2.10.2中的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并計(jì)算日內(nèi)精密度，具體數(shù)據(jù)如表6所示，結(jié)果表明100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液保留時(shí)間的RSD為1.9%，峰面積的RSD為1.2%，此數(shù)據(jù)表明標(biāo)準(zhǔn)工作液日內(nèi)較穩(wěn)定，該儀器的精密度較好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可信.

2）日間精密度

按2.10.2中的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并計(jì)算日間精密度，具體數(shù)據(jù)如表7所示，保留時(shí)間的RSD為1.2%，峰面積的RSD為2.6%，符合要求，這表明該儀器的日間精密度較好.

4" 討論

本文建立的高效液相色譜法檢測牛奶中的勞拉西泮殘留與李賢良等［7］建立的液-質(zhì)聯(lián)用方法相比，方法相對偏差低、穩(wěn)定.雖然檢出限不及液質(zhì)聯(lián)用方法，但液質(zhì)聯(lián)用方法較之純液相方法成本高昂，檢測時(shí)間長，同時(shí)對操作人員有較高的專業(yè)知識(shí)要求，不適用于基層檢測機(jī)構(gòu)使用.

本文通過對高效液相色譜的色譜條件、樣品前處理的優(yōu)化、流動(dòng)相、固相萃取柱、稀釋溶劑的選擇等進(jìn)行探討，確定了以V（甲醇）∶V（水）=68∶32為流動(dòng)相，以體積分?jǐn)?shù)50%甲醇水溶液作為稀釋溶劑來配制標(biāo)準(zhǔn)工作液，以230 nm作為檢測波長，用C18固相萃取柱來凈化牛奶樣品，以體積分?jǐn)?shù)0.2%甲酸-乙腈溶液萃取藥品，建立了牛奶中勞拉西泮的高效液相色譜檢測分析方法.結(jié)果表明，在40～500 μg/mL內(nèi)勞拉西泮具有較好的線性和相關(guān)系數(shù).在3個(gè)質(zhì)量濃度的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)中（70、180、300 μg/mL）勞拉西泮回收率為81.27%～97.58%，峰面積的RSD為1.1%；在日內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)中保留時(shí)間的RSD為1.9%，峰面積RSD為1.2%；在日間精密度實(shí)驗(yàn)中，保留時(shí)間的RSD為1.2%，峰面積的RSD為2.6%，說明本實(shí)驗(yàn)的回收率和精密度良好.該方法具有成本較低、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，具有一定的實(shí)用性，為牛奶中勞拉西泮殘留的檢測提供了技術(shù)支持.

參" 考" 文" 獻(xiàn)：

［1］" 李瑛.勞拉西泮的現(xiàn)狀及前景展望［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)刊，2000（6）：30-31.

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（責(zé)任編輯：梁俊紅）