染色體微陣列分析技術對16p11.2綜合征的診斷及遺傳學分析

韓春曉,張玉鑫,劉穎文,李海波

(寧波市婦女兒童醫(yī)院出生缺陷綜合防治中心,浙江 寧波 315012)

16號染色體的微缺失和微重復與精神發(fā)育障礙中的認知、言語延遲和行為異常有關。16p11.2近端區(qū)域由斷點4和5定義,包含26個已知基因,其中4個是在線人類孟德爾遺傳(online mendelian inheritance in man,OMIM)致病基因,大部分基因在大腦的不同區(qū)域表達。這個區(qū)域內約600kb的周期性間質缺失,是最常見的拷貝數變異區(qū)域[1]。16p11.2(TBX6)近端缺失綜合征臨床特征包括發(fā)育遲緩、認知障礙、語言延遲與障礙、自閉癥譜系障礙、面部畸形、癲癇或腦電圖異常、肥胖、精神疾病、心臟畸形等,并觀察到不完全外顯率和異質性[2-3]。目前研究證實16p11.2重復攜帶者的發(fā)育與精神運動遲緩、智力障礙、自閉癥譜系、強迫與重復行為和精神分裂癥的風險增加。本研究通過對16p11.2綜合征患者臨床癥狀、妊娠結局和隨訪信息的收集分析,旨在探討其表型和遺傳學相關性,豐富16p11.2綜合征表型譜,為產前診斷和遺傳咨詢提供有價值的臨床依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

于2019年1月至2022年8月寧波市婦女兒童醫(yī)院就診并接受染色體微陣列技術(chromosomal microarray analysis,CMA)檢測的9 744例患者,受檢者樣本包括8 999例產前羊水樣本,468例外周血樣本和277例流產物樣本,將檢出16p11.2微缺失/微重復綜合征22例患者(20例胎兒、2例患兒)納入描述性分析。所有孕婦及患兒監(jiān)護人在CMA檢測前進行詳盡的知情告知并簽署知情同意書,本研究已通過醫(yī)院倫理委員會審查批準[EC(2020-048)]。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床指征

①產前診斷指征:孕婦外周血胎兒游離DNA產前篩查異常、血清學篩查高風險、胎兒超聲結構畸形、超聲軟指標異常、胎兒生長受限、高齡妊娠、異常妊娠史等;②患兒受檢指征:非已知綜合征型神經發(fā)育障礙、發(fā)育遲緩、智力低下、自閉癥、面部體征多發(fā)畸形、臟器畸形等。

1.2.2 樣本采集

①羊水樣本采集:在超聲引導下對孕19～24+6周孕婦進行羊膜腔穿刺手術,抽取3個15mL羊水置于無菌管中,其中2管用于細胞培養(yǎng)染色體核型分析,1管用于全基因組DNA提取(親本驗證時抽取父母外周血5mL);②外周血采集:采集患兒及父母外周血5mL。

1.2.3 CMA檢測

單核苷酸多態(tài)性微陣列分析采用全基因組CytoScantm 750k芯片(美國Affymetrix公司),提取的全基因組DNA進行消化、連接、擴增、純化、片段化、標記、探針雜交、洗滌和掃描。使用配套ChAS4.0(Chromosome Anaylasis Suite 4.0,Affymetrix)軟件對掃描圖像結果進行計算分析,參考國際公共數據庫包括DGV、ClinGen、ClinVar、DECIPHER、ISCA、OMIM、UCSC等,并結合本實驗室內部數據及PubMed文獻庫,依據美國醫(yī)學遺傳學會對CMA拷貝數變異結果解讀指南,評判拷貝數變異的臨床意義。

1.2.4 資料收集及統(tǒng)計分析

收集孕婦妊娠期情況及患兒生后情況,包括產前超聲、血清學檢查、遺傳學檢查、妊娠結局及患兒發(fā)育情況等。胎兒出生后進行定期電話召回與健康隨訪,收集患兒相關資料,包括病史和家族史。對所得結果數據進行描述性統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 產前診斷指征與患兒表型

頸后透明帶掃描(nuchal translucency,NT)及其他超聲軟指標異常5例,血清學篩查高風險和高齡妊娠各4例,無創(chuàng)產前基因檢測(non-invasive prenatal testing,NIPT)異常3例,超聲結構異常3例(2例脊柱發(fā)育異常,1例泌尿系統(tǒng)異常)。另外,2例因癲癇而就診患兒,其中1例伴有生長發(fā)育遲緩,另外1例有驚厥癲癇家族史,其余未見異常,見表1。

表1 16p11.2綜合征患者的特征統(tǒng)計Table 1 Characteristics of patients with 16p11.2 syndrome

2.2 遺傳學特征

9 744 例樣本中,22例患者(20例產前胎兒、2例患兒)攜帶16p11.2核心區(qū)域拷貝數變異,檢出率為0.226%(22/9 744)。在22例拷貝數變異中,21例變異位于近端核心易感區(qū)堿基對(base pair,BP)4-BP5,1例變異位于遠端核心易感區(qū)BP2-BP3。根據變異類型,22例變異中包含15個微缺失變異,占比68.18%(15/22),7個微重復變異,占比31.82%(7/22)。變異片段大小為324～4 101kb。

2.3 變異類型及致病性分級

22例中10例樣本進行了親本驗證,7例變異為新發(fā)突變,2例變異遺傳自母親,1例變異遺傳自父親。16例胎兒樣本進行了染色體核型分析,其中1例樣本表現出細胞核型異常,經驗證該變異遺傳自母親。根據ACMG致病性評級,22例變異均為致病性變異。

2.4 隨訪結果

45%(9/20) 孕婦選擇繼續(xù)妊娠。對這9例嬰兒進行隨訪,隨訪年齡為1.5(0.5～3.5)歲。發(fā)現1例缺失攜帶者嬰兒表現異常,出生時診斷為房缺,室缺,卵圓孔未閉,2歲時表現出單純語言發(fā)育落后,經驗證發(fā)現該變異為新發(fā)突變。其余活產嬰兒未見明顯異常,見表1。

注:A為病例8第一胎,腰骶部椎體排列欠規(guī)則,提示半錐體;B為病例13,脊柱排列異常;C為病例19,巨膀胱。圖1 胎兒NT超聲影像Fig.1 Ultrasonic images of NT of three fetuses

3 討論

3.1 16p11.2綜合征與語言障礙

16p11.2 拷貝數變異最常見的臨床癥狀為語言障礙,占比高達80%～90%。據報道,重復攜帶者語言延遲與智力障礙相關,而語言障礙在缺失攜帶者中更普遍[4-5],并未有證據指出語言發(fā)育障礙與自閉癥譜系有必然聯系[6]。文獻報道的語言功能障礙多在學齡前(3～7周歲)或學齡期(7～15周歲)確診[7]。病例1胎兒攜帶16p11.2近端缺失585kb片段,2歲時被診斷為單純性語言發(fā)育遲緩。其余隨訪病例尚未發(fā)現明顯的語言發(fā)育落后和自閉癥譜系相關癥狀。這與文獻報道的臨床占比80%～90%有一定差異,這可能與病例數較少及隨訪時間較短,患兒表型尚未顯現有關,這也是本研究的不足之處。

3.2 16p11.2綜合征與心血管系統(tǒng)異常

據統(tǒng)計,0.3%的16p11.2微缺失攜帶者患有主動脈狹窄、房間隔缺損、卵圓孔未閉等心血管系統(tǒng)異常[8]。Zufferey等在233名16p11.2缺失個體中發(fā)現有6%的人患有先天性心臟病[8]。William報道了16p11.2缺失攜帶者,臨床表現為主動脈瓣發(fā)育異常、手部畸形、小頭畸形等[9]。M Marwan等歸納了16p11.2缺失相關的并發(fā)癥,包括大頭畸形、癲癇、和先天性心臟病[10]。Ghe等報道了攜帶16p11.2微缺失的同卵雙胞胎,分別在11.5歲和13歲時癲癇發(fā)病,并出現智力發(fā)育遲緩和主動脈瓣發(fā)育異常[11]。病例1是本研究中唯一一個心臟畸形的病例,出生時診斷為先天性心臟病,具體表現為房間隔缺損、室間隔缺損、卵圓孔未閉。該缺失攜帶者片段中包含HIRIP3基因,16p11.2缺失引起HIRIP3基因單倍劑量不足,從而導致主動脈瓣畸形發(fā)生,該基因產物與HIRA結合形成的復合物在染色質和蛋白質代謝中發(fā)揮著重要作用,表明該基因突變可能為病例1致病因素[11]。

3.3 16p11.2綜合征與癲癇

癲癇是16p11.2綜合征中高度外顯表型[3]。Ben等整理了16p11.2綜合征中癲癇發(fā)病率,缺失攜帶者約21.8%～26.8%,重復攜帶者約19.4%～29%[12]?；騊RRT2相關疾病在16p11.2缺失的個體中已有報道,基因PRRT2與三種常染色體顯性疾病相關[12-14]。Natália等認為16p11.2拷貝數變異相關的癲癇復發(fā)風險增加,但不具有特異性[1]。本研究報道的病例14,15均因全面性強直性陣攣發(fā)作就診,CMA結果發(fā)現兩個患者在16p11.2區(qū)域分別攜帶542kb和727kb左右缺失片段,兩個片段中均包含致病基因PRRT2,表明該片段缺失可能是癲癇的發(fā)病原因。這提示在癲癇患者的遺傳學評估時,注意16p11.2微缺失篩查。隨訪信息中,尚未發(fā)現癲癇患者,表明癲癇在該綜合征中存在不完全外顯率。

3.4 16p11.2綜合征與脊柱發(fā)育異常

脊柱發(fā)育異常是16p11.2復發(fā)性綜合征產前診斷中最常見的臨床表型,占比約21%,具體表現為脊柱側彎[8]?；騒II和TBX6與常染色體顯性和隱性脊髓型肋骨生長障礙5(OMIM 122600)相關,由Chapman等人最早發(fā)現TBX6基因在小鼠的前體細胞中參與近軸中胚層的發(fā)育[15]。Takemoto等證明了TBX6依賴的SOX2調控軸向干細胞進而影響神經發(fā)育[16]。FEI等發(fā)現,中國漢族人群中TBX6基因上的2個單核苷酸多態(tài)性位點rs2289292和rs3809624在先天性脊柱側彎的發(fā)病中起重要作用[17]。本研究報道了2例胎兒脊柱發(fā)育不良,病例8有半錐體發(fā)育異常不良孕產史,但未做基因檢測,其胎兒攜帶585kb缺失片段,尚未發(fā)現此胎兒脊柱發(fā)育異常,未進行親本來源鑒定,但根據不良孕產史及本次胎兒CMA結果,推測第一胎為16p11.2缺失攜帶者且變異可能遺傳自父(母)親。病例13超聲提示胎兒由胸椎至尾椎排列不規(guī)則,CMA提示胎兒攜帶542kb缺失片段,父母未驗證?；诖?并非基因TBX6缺失都出現脊柱發(fā)育不良,單純TBX6基因缺失可能不會發(fā)生脊柱發(fā)育不良,具體致病機制仍需要進一步的研究探索。

3.5 16p11.2綜合征與泌尿系統(tǒng)異常

病例19是16p11.2重復綜合征中唯一的結構異常,在頸部透明層(NT)超聲檢查中提示胎兒為巨膀胱,CMA提示胎兒攜帶586kb重復片段。在以往報道中16p11.2重復綜合征的未發(fā)現早期巨膀胱,但J Neurodev等報告了45個16p11.2微缺失和32個微重復,其中3例缺失綜合征表現為泌尿系統(tǒng)發(fā)育不良,具體表現為腎盂積水、多囊腎病,4例重復綜合征表現為腎回流、馬蹄型腎[18]。由于病例19終止妊娠,無后續(xù)監(jiān)測,產前標本量不足以進一步檢測,未進行單基因變異的遺傳學檢測,我們推測胎兒在妊娠中后期可能會出現泌尿系統(tǒng)結構或功能異常。泌尿系統(tǒng)異?？赡芘c多種拷貝數變異和單基因突變相關,早期泌尿系統(tǒng)異?？勺鳛槲⒅貜途C合征的診斷指征仍需更多臨床數據支持。另外,病例10孕婦本人左腎缺如,且有腎臟發(fā)育不良孕產史,此次胎兒CMA結果提示攜帶約599kb缺失片段,由于孕婦本人拒絕父母驗證,且第一胎未做基因檢測,因此無法確定此次胎兒的缺失片段與孕婦腎臟異常及不良孕產史的關系。Li L等報告了一對雙胎16p11.2上含有200～240kb缺失區(qū)域,雙胞胎之一表現為左腎積水[19]。Masuno等報道了一個4月齡女嬰,核型為47,XX,+del(16)(p11.2),臨床表現為輕微面部異常,肢體異常和泌尿生殖系統(tǒng)異常[20]。Su J等通過CMA分析評估877例腎臟超聲異常的胎兒,4例16p11.2缺失攜帶者中,1例腎臟發(fā)育不良,3例單側腎臟發(fā)育不良[21]。

3.6 16p11.2綜合征與NT增厚及其他表型

頸部透明層增厚與染色體非整倍體、遺傳病和畸形等相關,是行羊水穿刺的產前診斷指征之一?，F有研究數據指出NT增厚的異常檢出率高達2.5%～10%,單純與合并其他畸形的NT增厚的致病性拷貝數變異(copy number variants,CNVs)檢出率分別為4%和7%[22-23]。本研究中我們共發(fā)現3例NT增厚,其中2例(病例2和病例9)遺傳自表型正常的母親,病例9隨訪時僅為6月齡,尚未見明顯異常。因此,NT增厚與16p11.2綜合征的相關性還需更多研究數據支持。高齡和血清學篩查高風險并不具有明顯的特異性。另外,病例5和病例11超聲提示腸道回聲增強,相似癥狀在以往報道文獻中已有提及[19,24]。

3.7 小結

本研究不足為樣本以羊水居多,超聲表型有限,且隨訪時間較短,病例數較少,未能提供表型外顯率以及基因與表型相關性統(tǒng)計學數據。另外,12例變異未明確來源,家系16p11.2復發(fā)性拷貝數變異再發(fā)風險高于一般人群頻率(<1%),再生育前建議對夫妻雙方進行CNVs檢測及遺傳咨詢,孕早期需進行有創(chuàng)產前診斷與密切隨訪。對父母為16p11.2變異攜帶者家系,應進行遺傳咨詢告知再生育攜帶者風險為50%,16p11.2區(qū)域缺失和重復外顯率分別為46.8%,27.2%[25],建議再次孕育時應行早期的產前診斷或胚胎植入前遺傳學診斷以減少出生缺陷患兒發(fā)生。

綜上所述,16p11.2綜合征患者多系統(tǒng)發(fā)育表現異常且臨床表型多變,異質性強。當臨床出現相關表型時,需結合家族史及臨床情況并盡早明確遺傳學病因。