基于NLRP3/IL-1β/TGF-β1通路探討低氧環(huán)境下紅景天苷對糖尿病腎病大鼠足細胞焦亡損傷的拮抗效應

李佳武 秦鳳 宋生琴 翟婷 辛宏云 巴應貴

基金項目：青海省科技計劃項目（2022-ZJ-763）

引用本文：李佳武，秦鳳，宋生琴，等. 基于NLRP3/IL-1β/TGF-β1通路探討低氧環(huán)境下紅景天苷對糖尿病腎病大鼠足細胞焦亡損傷的拮抗效應［J］. 中國全科醫(yī)學，2024，27（21）：2617-2622. DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0678.［www.chinagp.net］

LI J W，QIN F，SONG S Q，et al. Antagonistic effect of salidroside on podocyte pyroptosis in diabetic kidney disease rats under hypoxia based on NLRP3/IL-1β/TGF-β1 pathway［J］. Chinese General Practice，2024，27（21）：2617-2622.

? Editorial Office of Chinese General Practice. This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 license.

【摘要】 背景 紅景天苷對糖尿病腎?。―KD）大鼠具有保護作用，但在低氧環(huán)境下是否同樣起效及具體作用機制尚不明確。目的 觀察低氧環(huán)境下紅景天苷對DKD大鼠模型血生化指標、腎組織病理損傷、腎臟細胞焦亡相關蛋白表達情況，并探討其作用機制。方法 2022年3月—2023年3月40只6周齡SPF級SD雄性大鼠，隨機抽取8只作為對照組，其余大鼠造模。將24只DKD成模大鼠隨機分為模型組、紅景天苷組、紅景天苷+Nod樣受體蛋白3（NLRP3）激活劑組進行干預，每組8只。干預結束后腹主動脈取血進行生化指標檢測，蘇木素-伊紅（HE）染色及透射電鏡觀察大鼠腎臟病理改變情況，酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測大鼠血清白介素（IL）1β、IL-18水平。免疫印跡試驗（Western bloting）檢測腎組織半胱天冬酶1（Caspase-1）、消皮素D（GSDMD）、NLRP3和轉化生長因子β1（TGF-β1）蛋白表達水平。結果 造模后造模大鼠體質量低于對照大鼠，差異有統計學意義（P<0.05）。與對照組相比，模型組大鼠三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、空腹血糖（FBG）、尿微量白蛋白（UMA）、尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）水平明顯升高（P<0.05）；與模型組相比，紅景天苷組大鼠BUN、UMA、Scr水平明顯降低（P<0.05）；與紅景天苷組相比，紅景天苷+NLRP3激活劑組大鼠UMA、BUN、Scr水平明顯升高（P<0.05）。HE染色及透射電鏡結果可見紅景天苷組大鼠腎臟組織病理改變較模型組明顯減輕，紅景天苷+NLRP3激活劑組較紅景天苷組加重。與對照組相比，模型組血清IL-1β、IL-18水平明顯升高（P<0.05）；與模型組相比，紅景天苷組大鼠血清IL-1β、IL-18水平明顯降低（P<0.05）；與紅景天苷組相比，紅景天苷+NLRP3激活劑組IL-1β、IL-18水平明顯升高（P<0.05）。與對照組相對，模型組Caspase-1、GSDMD、NLRP3、TGF-β1蛋白表達明顯升高（P<0.05）；與模型組相對，紅景天苷組Caspase-1、GSDMD、NLRP3、TGF-β1蛋白表達明顯降低（P<0.05）；與紅景天苷組相對，紅景天苷+NLRP3激活劑組Caspase-1、GSDMD、NLRP3、TGF-β1蛋白表達明顯升高（P<0.05）。結論 低氧環(huán)境下，紅景天苷以不降低血糖和血脂為前提發(fā)揮了對DKD大鼠的治療作用，考慮該作用可能與抑制NLRP3從而影響NLRP3/IL-1β/TGF-β1信號通路，最終改善足細胞焦亡損傷密切相關。

【關鍵詞】 糖尿病腎病；細胞焦亡；紅景天苷；低氧；大鼠；足細胞

【中圖分類號】 R 587.24 【文獻標識碼】 A DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0678

Antagonistic Effect of Salidroside on Podocyte Pyroptosis in Diabetic Kidney Disease Rats under Hypoxia Based on NLRP3/IL-1β/TGF-β1 Pathway

LI Jiawu1，QIN Feng2，SONG Shengqin2，ZHAI Tin3，XIN Hongyun1，BA Yinggui1*

1.Department of Nephrology，Qinghai University Affiliated Hospital，Xining 810000，China

2.Department of Out-patient，Qinghai University Affiliated Hospital，Xining 810000，China

3.Department of Endocrinology，Qinghai University Affiliated Hospital，Xining 810000，China

*Corresponding author：BA Yinggui，Chief physician；E-mail：bayinggui@163.com

【Abstract】 Background Salidroside has been shown to protect diabetic kidney disease（DKD）rats，however，whether it is equally effective in a hypoxic environment and the specific mechanism of action remain unclear. Objective To observe the effects of salidroside on biochemical parameters，renal tissue pathological lesion，and the expression of cell pyroptosis-related proteins in a rat model of DKD under hypoxia，and explore its mechanisms of action. Methods From March 2022 to March 2023，forty 6-week-old SPF-grade SD male rats were used，with eight randomly selected as the control group，the remaining were modeled. Twenty-four DKD model rats were randomly divided into three groups of the model group，salidroside group，and salidroside+nod-like receptor protein 3（NLRP3）activator group for intervention，with 8 in each group. After the intervention，blood was collected from the abdominal aorta for biochemical parameter testing，hematoxylin-eosin（HE）staining，and transmission electron microscopy were used to observe renal pathological changes. Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was used to detect serum levels of interleukin（IL）1β and IL-18. Western blotting was used to measure the expression levels of Caspase-1，Gasdermin D（GSDMD），NLRP3，and transforming growth factor β1（TGF-β1）in renal tissue. Results The body weight of the rats after modeling was significantly lower than that of the control group（P<0.05）. Compared to the control group，the levels of triglyceride（TG），total cholesterol（TC），fasting blood glucose（FBG），urinary microalbumin（UMA），blood urea nitrogen（BUN），and serum creatinine（Scr）were significantly higher in the model group（P<0.05）. Compared to the model group，the BUN，UMA，and Scr levels were significantly lower in the salidroside group（P<0.05）. Compared to the salidroside group，the UMA，BUN，and Scr levels were significantly higher in the salidroside+NLRP3 activator group（P<0.05）. HE staining and transmission electron microscopy revealed that renal tissue pathological changes in the salidroside group were significantly reduced than the model group，and aggravated in the salidroside+NLRP3 activator group. Compared to the control group，serum IL-1β and IL-18 levels were significantly higher in the model group（P<0.05）；these levels were significantly lower in the salidroside group compared to the model group（P<0.05），and higher in the salidroside+NLRP3 activator group compared to the salidroside group（P<0.05）. Compared to the control group，the expression of Caspase-1，GSDMD，NLRP3，and TGF-β1 proteins was significantly higher in the model group

（P<0.05）；it was significantly lower in the salidroside group compared to the model group（P<0.05），and higher in the salidroside+NLRP3 activator group compared to the salidroside group（P<0.05）. Conclusion Salidroside exerted therapeutic effects on DKD rats in a hypoxic environment without reducing blood glucose and lipid levels，this effect may be related to the inhibition of NLRP3，affecting the NLRP3/IL-1β/TGF-β1 signaling pathway，ultimately improving podocyte pyroptosis injury.

【Key words】 Diabetic kidney disease；Pyroptosis；Salidroside；Hypoxia；Rat；Podocytes

糖尿病腎?。―KD）是糖尿病導致的代謝紊亂引起相關損傷因素累及微血管后出現的一種嚴重且常見的并發(fā)癥，研究表明2011年起DKD已發(fā)展成為我國慢性腎臟病的首要原因［1］。損傷因素作用于腎臟導致微量白蛋白尿，而蛋白尿反過來加重腎臟損害，最終發(fā)展為大量蛋白尿，乃至終末期腎病，其中足細胞受損被認為是關鍵環(huán)節(jié)［2］。炎癥反應是目前DKD發(fā)病機制的研究熱點［3］。細胞焦亡作為一種伴隨劇烈炎癥反應的細胞程序性死亡，以Nod樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體形成、半胱天冬酶1（Caspase-1）活化、消皮素D（GSDMD）暴露N端結構域、促炎因子白介素1β（IL-1β）、白介素18（IL-18）釋放為特征［4］。焦亡在DKD中起到的作用也被實驗證實，有研究表明高糖導致機體氧化應激會使NLRP3炎癥小體活化，從而引起腎臟組織細胞發(fā)生焦亡損傷并擴大炎癥反應［5］。作為擴大炎癥反應的一環(huán)，轉化生長因子β1（TGF-β1）則會受到IL-1β調節(jié)而產生，并損傷足細胞［6］。醫(yī)學上通常將海拔2 500 m以上，并可引起人體相應生物效應的地區(qū)稱為高原地區(qū)［7］，該地區(qū)DKD患者的病情通常有著更快的進展速度［8］。

紅景天苷是傳統中藥材紅景天的有效成分，其對于因缺氧而損傷的組織有著很好的保護效應，臨床實踐中已被廣泛用于治療急性高原反應以及慢性缺氧所致的疾?。?］，研究表明紅景天苷可以通過抑制NLRP3的激活、改善線粒體代謝功能等多種方式發(fā)揮對DKD的保護作用［10］。本研究通過觀察低氧環(huán)境下大鼠的生化指標、腎組織病理、足細胞損傷及NLRP3/IL-1β/TGF-β1信號通路介導的細胞焦亡相關蛋白表達情況，進一步探究低氧環(huán)境下紅景天苷對DKD大鼠的治療機制，從而為低氧環(huán)境下的DKD進展提供新的治療方案。

1 材料與方法

1.1 實驗時間

2022年3月—2023年3月。

1.2 實驗動物

40只6周齡SPF級SD雄性大鼠，平均體質量（160±10）g，購自成都達碩實驗動物科技有限公司，實驗動物許可證號：SYXK（川）2019-189。飼養(yǎng)溫度22～25 ℃，相對濕度（60±10）%，12 h/12 h明暗交替，自由攝食水，適應性飼養(yǎng)1周。本研究經青海大學附屬醫(yī)院科研倫理委員會批準（P-SL-2021163）。

1.3 主要試劑

紅景天苷（粉末，上海碧云天生物技術有限公司，貨號：SM8036）；鏈脲佐菌素（STZ）（美國sigma公司，貨號：V900890）；二乙基二硫代氨基甲酸酯（DDC）（美國sigma公司，批號：S-0319）；檸檬酸鈉無菌緩沖液（Solarbio公司，貨號：C1010）；BCA蛋白定量試劑盒（賽默飛，貨號：23225）；RIPA細胞裂解液、蛋白酶抑制劑（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：P0013C、P1005）；相關蛋白一抗、HRP-羊抗兔/小鼠二抗（賽默飛，貨號：MA5-32255、14-9832-82、PA5-119680、MA1-21595、A-21247）；IL-1β、IL-18酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（武漢伊萊瑞特有限公司，貨號：E-EL-R0012c、E-EL-R0567c）。

1.4 動物分組、造模、給藥

隨機抽取8只大鼠作為對照組，繼續(xù)予以常規(guī)飼料喂養(yǎng)，其余大鼠進行造模。造模大鼠予以高脂、高糖飼料（0.5%膽固醇、5%蛋黃粉、10%豬油、10%蔗糖）喂養(yǎng)4周后每日腹腔注射35 mg/kg STZ，連續(xù)4 d，末次注射72 h后測空腹血糖（FBG），若FBG≥16.7 mmol/L，則判定糖尿病模型造模成功，繼續(xù)予以高脂、高糖飼料喂養(yǎng)4周后，轉移至代謝籠，收集24 h尿液，24 h尿蛋白定量≥30 mg，則判定DKD大鼠造模成功。最終DKD大鼠造模成功24只。將造模成功大鼠隨機分為模型組、紅景天苷組、紅景天苷+NLRP3激活劑組，每組8只，并將包括對照組在內的4組大鼠置于低壓、低氧氧艙內（模擬海拔5 000 m，溫度20～26℃，相對濕度40％～70％），參照文獻［11］的方法，紅景天苷組予以紅景天苷80 mg/kg灌胃（以10 mg∶1 mL比例溶于0.9%氯化鈉溶液中），1次/d；紅景天苷+NLRP3激活劑組予以同等劑量紅景天苷灌胃1 h后予以DDC 300 mg/kg灌胃［12］，隔天1次；其余各組予以同等體積蒸餾水灌胃，連續(xù)飼養(yǎng)4周。

1.5 大鼠生化指標檢測

末次給藥后將大鼠代謝籠收集尿液后使用戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉，腹主動脈取血，離心后使用全自動生化分析儀測定各組大鼠總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、FBG、尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、尿微量白蛋白（UMA）水平。

1.6 蘇木素-伊紅（HE）染色及透射電鏡觀察大鼠腎臟病理改變情況

將麻醉后的大鼠解剖、分離出雙側腎臟，收集腎組織標本，各組隨機選取4例將腎組織標本置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h，脫水、石蠟包埋切片，將切片脫蠟水化，進行HE染色，置于光學顯微鏡下觀察。將各組隨機選取3例少量腎組織標本置于2.5%戊二醛中進行固定，脫水、包埋、切片及染色后在電鏡下觀察足細胞超微結構。

1.7 ELISA檢測大鼠血清IL-1β、IL-18水平

參照試劑盒操作方法檢測血清標本IL-1β、IL-18水平。

1.8 免疫印跡試驗（Western bloting）檢測腎組織Caspase-1、GSDMD、NLRP3和TGF-β1蛋白表達水平

將剪碎的腎組織置入RIPA裂解液離心后提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，行凝膠電泳分離并轉膜，使用5%脫脂奶粉于室溫中封閉2 h，加入NLRP3、Caspase-1、TGF-β1、GSDMD一抗并按比例稀釋，4 ℃孵育過夜，洗滌后加入二抗，溫室孵育2 h，增強化學發(fā)光顯色處理過后置于發(fā)光圖像分析儀上分析。

1.9 統計學方法

采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析，符合正態(tài)分布的計量資料以（x-±s）表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗，同組造模前后比較采用配對樣本t檢驗，多組間比較使用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 造模前后大鼠體質量比較

造模前對照大鼠與造模大鼠體質量比較，差異無統計學意義（P>0.05）；造模后造模大鼠體質量低于對照大鼠，差異有統計學意義（P<0.05）。組內比較結果顯示，對照大鼠和造模大鼠造模后體質量均高于造模前，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

表1 造模前后對照大鼠與造模大鼠體質量比較（x-±s，g）

Table 1 Comparison of body mass between the two groups of rats before and after modeling

組別 只數 造模前 造模后 t配對值 P值

對照大鼠 8 170.4±7.8 439.7±14.1 -53.99 <0.05

造模大鼠 24 173.0±6.6 328.7±17.7 -44.86 <0.05

t值 -0.95 16.08

P值 0.35 <0.05

2.2 各組大鼠生化指標檢測結果

各組大鼠TG、TC、FBG、UMA、BUN、Scr比較，差異均有統計學意義（P<0.05），其中與對照組相比，模型組大鼠TG、TC、FBG、UMA、BUN、Scr水平明顯升高（P<0.05）；與模型組相比，紅景天苷組大鼠BUN、UMA、Scr水平明顯降低（P<0.05）；與紅景天苷組相比，紅景天苷+NLRP3激活劑組大鼠UMA、BUN、Scr水平明顯升高（P<0.05），見表2。

2.3 各組大鼠腎組織HE染色結果

對照組可見腎小管輕微空泡變性；模型組與對照組相比大鼠腎小管上皮細胞明顯腫脹及變性壞死；紅景天苷組與模型組相比腎組織病理改變明顯減輕；紅景天苷+NLRP3激活劑組與紅景天苷組相比部分腎小管上皮細胞變性壞死加重。各組大鼠腎組織HE染色結果見圖1。

2.4 各組大鼠腎組織透射電鏡結果

對照組足細胞無明顯病理變化；模型組與對照組相比足細胞內線粒體發(fā)生嚴重腫脹，足突區(qū)域部分融合，基底膜可見彌漫性增厚；紅景天苷組與模型組相比足細胞線粒體腫脹、足突融合及基底膜增厚情況有所改善；紅景天苷+NLRP3激活劑組與紅景天苷組相比足細胞線粒體腫脹加重、足突融合增加，基底膜彌漫性增厚。各組大鼠腎組織透射電鏡結果見圖2。

2.5 各組大鼠血清IL-1β、IL-18水平

各組大鼠血清IL-1β、IL-18水平比較，差異有統計學意義（P<0.05），其中與對照組相比，模型組血清IL-1β、IL-18水平升高；與模型組相比，紅景天苷組大鼠血清IL-1β、IL-18水平降低；與紅景天苷組相比，紅景天苷+NLRP3激活劑組IL-1β、IL-18水平升高，差異均有統計學意義（P<0.05），見表3。

2.6 各組大鼠GSDMD、Caspase-1、NLRP3、TGF-β1蛋白表達結果

各組大鼠GSDMD、Caspase-1、NLRP3、TGF-β1蛋白表達水平比較，差異有統計學意義（P<0.05），其中與對照組比較，模型組Caspase-1、GSDMD、NLRP3、TGF-β1蛋白表達明顯升高；與模型組比較，紅景天苷組Caspase-1、GSDMD、NLRP3、TGF-β1蛋白表達明顯降低；與紅景天苷組比較，紅景天苷+NLRP3激活劑組Caspase-1、GSDMD、NLRP3、TGF-β1蛋白表達明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.05），見圖3、表4。

3 討論

作為糖尿病重要微血管并發(fā)癥的DKD可導致終末期腎臟病的發(fā)生，嚴重降低了患者的生活質量并給國家醫(yī)療系統造成了沉重的負擔［13］，而高原低氧的環(huán)境則可以進一步加快DKD的進展［14］。臨床工作中可以注意到許多DKD患者早期除了糖尿病相關癥狀外通常沒有明顯臨床表現，只有當肢體出現水腫或其他漿膜腔大量積液時才會察覺，此時DKD一般已經進展到了Ⅳ期甚至可以到達Ⅴ期。因此臨床上目前對DKD強調早期診斷并采取針對性的保護措施，微量白蛋白尿是早期DKD的標志，同樣也會加重腎臟的損害［15］，而作為腎臟濾過屏障中最為關鍵的足細胞被認為與微量白蛋白尿的發(fā)生密不可分［16］。DKD擁有錯綜復雜的發(fā)病機制，既往研究忽略了細胞焦亡所起到的作用，隨著越來越多的實驗展開，焦亡機制也逐漸被重視，經典通路的細胞焦亡通過炎癥小體受體NLRP3感受上游損傷信號［4］，活化的NLRP3與接頭蛋白ASC以及pro-Caspase-1共同組成炎癥小體復合物，前體形式的Caspase-1在該炎癥小體復合物的激活作用下轉變?yōu)橛谢钚缘腃aspase-1。Caspase-1一方面可以切割焦亡標志性蛋白GSDMD，另一方面可以活化促炎因子IL-1β以及IL-18［17-18］。TGF-β1具有促進細胞外基質積累的作用，并抑制這些過度積累的細胞外基質降解，從而導致組織發(fā)生病理變化，對機體造成損害［19］，在過度的細胞焦亡中隨著IL-1β被大量激活釋放，TGF-β1過度產生［20］。胡龍江等［21］研究發(fā)現糖尿病患者體內的NLRP3/IL-1β/TGF-β1信號通路相關蛋白、Caspase-1、GSDMD蛋白表達顯著增加，并認為該通路介導的細胞焦亡對糖尿病相關并發(fā)癥的發(fā)展有重要作用。本研究觀察到對照組的HE染色可見腎小管上皮細胞輕度空泡變性，考慮系低氧環(huán)境可以對腎臟造成一定損傷所致。與對照組相比，模型組大鼠生化指標均升高，腎間質及足細胞出現明顯損傷，血清IL-1β、IL-18水平升高，腎組織NLRP3、TGF-β1、Caspase-1、GSDMD蛋白表達明顯增加。因此認為低氧環(huán)境下DKD大鼠的足細胞損傷可能與NLRP3/IL-1β/TGF-β1信號軸介導的細胞焦亡密切相關。

紅景天苷在現代藥理學中被證實具有抗炎、抗缺氧等方面的功效［22］，對DKD的潛在治療價值方面也有實驗相佐證，有報道證實其可以通過抑制NLRP3的激活改善高糖刺激下大鼠腎小球系膜細胞的增殖以及細胞外基質的累積［23］。本研究可見，當應用紅景天苷干預大鼠4周后，腎小管病變減輕，腎功能指標改善、UMA減少，足細胞損傷也得到了顯著改善，血清IL-1β、IL-18及焦亡發(fā)生相關蛋白的表達均明顯降低，但血糖、血脂水平較模型組無明顯改變，與樸敏虎等［24］使用紅景天苷100 mg-1·kg-1·d-1干預DKD大鼠10周可降低血糖及血脂水平的實驗結果有所不同。一方面可能是兩項實驗使用紅景天苷干預的劑量和時間不同，另一方面不排除低氧環(huán)境可能對實驗結果產生了一定影響。本課題組發(fā)現低氧環(huán)境下紅景天苷可以早期通過抑制NLRP3/IL-1β/TGF-β1信號通路從而改善足細胞焦亡損傷進而發(fā)揮腎臟保護作用。此外本研究同時設置了紅景天苷+NLRP3激活劑組，通過將其與紅景天苷組比較，發(fā)現在應用紅景天苷的同時加用NLRP3激活劑后，電鏡下可以觀察到足細胞再次出現明顯病變，細胞焦亡相關蛋白表達水平及血清IL-1β、L-18顯著上調，同時腎功能指標出現惡化，說明NLRP3激活劑減弱了紅景天苷的效應，證實了前述的推論，并且說明該效應與紅景天苷拮抗NLRP3密切相關。

綜上所述，紅景天苷可以在低氧環(huán)境中以不降低血糖和血脂為前提，改善DKD大鼠的腎功能及焦亡導致的足細胞損傷。該效應可能是以NLRP3/IL-1β/TGF-β1信號通路為靶向產生，這在一定程度上闡明了紅景天苷在低氧環(huán)境下保護DKD的具體作用機制，證明了紅景天苷在治療DKD領域有著廣闊的應用前景。

作者貢獻：李佳武參與設計研究方案、論文撰寫與修改、后期審查；李佳武、秦鳳、宋生琴、翟婷負責動物實驗實施、樣本采集、指標化驗及檢測；辛宏云負責數據整理、數據錄入、統計分析、圖片整理；巴應貴負責研究的設計、研究質量控制、指導論文撰寫及論文內容審校。

本文無利益沖突。

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（收稿日期：2023-07-28；修回日期：2023-12-05）

（本文編輯：鄒琳）