葉下珠飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)化研究*

黎 旭，包 敏，胡冠宇，吳 茜，謝嘉馳，郭宇鴿

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2.株洲市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 株洲 412000；3.湘潭市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 湘潭 411100）

葉下珠為大戟科葉下珠屬植物葉下珠（Phyllanthus urinariaL.）的干燥全草，具有清熱利濕、解毒消腫的功效，常用于痢疾、腹瀉及傳染性肝炎等疾病的治療[1]。葉下珠含有木脂素[2]、香豆素[3]、萜類[4-5]、黃酮[6]、酚酸[7]、有機(jī)酸[8]及生物堿[9]等成分，具有抗病毒[10]、抗腫瘤[11]、抗菌[12]及保肝[13]等藥理作用。

據(jù)本草考證[14]，葉下珠作為藥材最早收錄于《生草藥性備要》，有數(shù)百年藥用史，但最早被收錄的官方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為1976年版《湖南省中藥飲片炮制規(guī)范》[15]。目前，與其質(zhì)量研究相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道有含量測(cè)定[16]、指紋圖譜[17]、灰分、水分、醇溶性浸出物的測(cè)定[18-19]及生藥鑒定[20]等。相比之下，2010年版《湖南省中藥飲片炮制規(guī)范》存在標(biāo)準(zhǔn)缺項(xiàng)、質(zhì)量控制方法單一等問題，不足以很好地控制湖南省市場(chǎng)上葉下珠飲片的質(zhì)量。同時(shí)，為完善葉下珠飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，湖南省市場(chǎng)監(jiān)督管理局也啟動(dòng)了關(guān)于2010年版《湖南省中藥飲片炮制規(guī)范》中葉下珠飲片標(biāo)準(zhǔn)修訂的項(xiàng)目?；诖?，本課題組開展了葉下珠質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，旨在為更好地監(jiān)測(cè)湖南省市場(chǎng)葉下珠飲片的質(zhì)量提供技術(shù)支撐。

1 材料

1.1 儀器 XSE 205 DV型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；2695高效液相色譜儀（沃特世科技有限公司）；BX-61型電子顯微鏡（奧林巴斯有限公司）；DHG-9147A型電熱恒溫干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；SX-4-10型馬弗爐（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）。

1.2 藥物與試劑 沒食子酸（批號(hào)：110831-201906，純度：91.5%）、柯里拉京（批號(hào)：111623-200301，純度：100%）、葉下珠對(duì)照藥材（批號(hào)：121374-201802）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；色譜純乙腈、甲醇、二氯甲烷、三氯甲烷和正己烷，均購(gòu)于霍尼韋爾有限公司。

從不同生產(chǎn)企業(yè)收集葉下珠飲片共計(jì)11批，樣品信息見表1。所有批次藥材經(jīng)株洲市食品藥品檢驗(yàn)所胡冠宇主管藥師鑒定為大戟科葉下珠屬植物葉下珠（Phyllanthus urinariaL.）的干燥全草。樣本存放于株洲市食品藥品檢驗(yàn)所。

表1 葉下珠飲片信息

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別 取本品粉末2 g，加乙醇20 mL，振搖2 h，濾過，濾液濃縮至2 mL，加硅膠（100~200目）2 g，拌勻，揮干溶劑，裝入色譜柱中，以8 mL乙醚洗除雜質(zhì)，棄去；加乙醇8 mL洗脫，收集乙醇洗脫液，蒸干；殘?jiān)蛹状? mL使溶解，制成供試品溶液；另取葉下珠對(duì)照藥材2 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。按照2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則0502薄層色譜法，吸取上述兩種溶液各10 μL，分別點(diǎn)樣于同一硅膠G薄層板上，點(diǎn)樣方式為手動(dòng)點(diǎn)樣，以三氯甲烷-甲醇（7.5：1）作為展開劑，上行展開；展開前，預(yù)飽和時(shí)間為30 min，環(huán)境溫度為25.6 ℃，環(huán)境濕度為63%，展距約為10 cm；展開后，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。于日光下視檢。結(jié)果顯示，在TLC色譜圖中，供試品與葉下珠對(duì)照藥材在相同位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。（見圖1）

圖1 TLC 圖

2.2 粉末鑒別 取細(xì)粉（過5號(hào)篩）少許，置于載玻片，加1~2滴水合氯醛，置于酒精燈上透化至近無色，取下；加1滴甘油后裝片，用吸水紙吸去多余甘油，置于顯微鏡下觀察并拍照。通過對(duì)收集到的11批葉下珠飲片進(jìn)行粉末顯微鑒別，結(jié)果顯示11批樣品均能觀察到葉表皮細(xì)胞、氣孔、木栓細(xì)胞、韌皮纖維、木纖維、導(dǎo)管、非腺毛、草酸鈣簇晶及果表皮細(xì)胞。具體顯微鑒別特征為“本品粉末黃綠色。葉表皮細(xì)胞垂周壁波狀彎曲，氣孔多為平軸式，少數(shù)為不等式。木栓細(xì)胞呈類多角形或類方形，黃棕色，壁稍增厚，微彎曲。韌皮纖維成束或散在，長(zhǎng)梭形，兩端漸尖長(zhǎng)。木纖維多成束，壁稍厚，木化，具單斜紋孔或短縫狀紋孔。導(dǎo)管為螺紋、網(wǎng)紋，直徑25~60 μm。非腺毛1~5個(gè)細(xì)胞，長(zhǎng)40~210 μm，直徑約30 μm，壁具角質(zhì)紋理或壁疣。果皮表面細(xì)胞類圓形或多角形，有的角隅處增厚。草酸鈣簇晶眾多，直徑10~20 μm，棱角較鈍”。（見圖2）

圖2 粉末顯微圖

2.3 橫切面鑒別 取葉下珠飲片，選擇大小適中的莖數(shù)根、葉數(shù)片，置于裝有水的培養(yǎng)皿中，浸泡2 h，軟化，取莖或葉，用泡沫夾住，刀片進(jìn)行切削，毛筆蘸取粘在刀片上的莖或葉橫切薄片，置于水中伸展，然后用毛筆蘸取厚度合適的薄切片置于載玻片上，加清水1~2滴，蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去多余清水，置于顯微鏡下觀察。

（1）莖橫切面鑒別：表皮細(xì)胞1列，細(xì)胞小，呈切向延長(zhǎng)的長(zhǎng)方形或長(zhǎng)多角形，排列緊密，外被角質(zhì)層。皮層由5~6層細(xì)胞組成；靠近表皮的1~2層細(xì)胞較小，切向延長(zhǎng)，部分角隅處增厚形成厚角組織；其下1~2層細(xì)胞較大，排列不規(guī)則；靠近韌皮部的1~2層細(xì)胞呈類圓形或多角形。韌皮部較薄，由1~3層細(xì)胞組成；其外側(cè)有中柱鞘纖維，成束，斷續(xù)排列成環(huán)，壁較厚，層紋明顯。形成層成環(huán)，不甚明顯。木質(zhì)部成環(huán)位于韌皮部?jī)?nèi)方；導(dǎo)管直徑25~45 μm，呈類方形、近圓形或類多角形，徑向單列或散在；木纖維排列緊密，成束或徑向排列，壁較厚；射線由1~3列細(xì)胞組成。髓較大，約占整個(gè)斷面的1/2，細(xì)胞較大，排列疏松，或部分中空。（見圖3）

圖3 莖和葉的橫切面顯微圖

（2）葉橫切面鑒別：上、下表皮均為1列細(xì)胞，且上、下表皮細(xì)胞常向外突起，外被角質(zhì)層；細(xì)胞呈方形或類方形，排列緊密，垂周壁略彎曲，可見氣孔。柵欄組織1列細(xì)胞，通過主脈；柵欄細(xì)胞呈長(zhǎng)圓柱形，排列緊密，長(zhǎng)45~70 μm，其中散有草酸鈣簇晶。海綿組織由2~3列排列疏松的不規(guī)則的薄壁細(xì)胞組成，有少數(shù)小草酸鈣簇晶散在。主脈在葉背面顯著突起，外韌型；木質(zhì)部導(dǎo)管4~5列徑向排列，每列1~5個(gè)；韌皮部外側(cè)有纖維散在，纖維壁厚，層紋明顯；下表皮內(nèi)的主脈維管束處有厚角組織，厚角細(xì)胞1~2列，細(xì)胞形狀不規(guī)則，較大。（見圖3）

2.4 含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 采用Shimadzu VP-SOD C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），以0.1%乙酸（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相，洗脫程序?yàn)?~7 min，5%B→10%B；7~30 min，10%B→15%B；30~34 min，15%B→17%B；34~36 min，17%B→80%B；36~37 min，80%B→5%B，36~37 min，5%B，流速為0.8 mL/min，采集時(shí)間為38 min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，紫外檢測(cè)器，最佳吸收波長(zhǎng)為280 nm。

2.4.2 溶液的制備

2.4.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取不同質(zhì)量的沒食子酸和柯里拉京對(duì)照品，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得。經(jīng)含量折算后，上述各對(duì)照品的質(zhì)量濃度分別為996.0、1980 μg/mL。

2.4.2.2 供試品溶液的制備 取葉下珠飲片粉末（過3號(hào)篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇溶液40 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率：100 W，頻率：35 kHz）提取30 min，靜置至室溫，再稱定質(zhì)量，用75%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4.3 專屬性試驗(yàn) 按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣10 μL空白、混合對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)行專屬性分析。結(jié)果表明供試品溶液在2種對(duì)照品保留時(shí)間（±0.5%）處都有特征峰，且分離度、拖尾因子及理論塔板數(shù)均滿足定量分析要求，其他成分峰對(duì)待測(cè)成分無干擾。（見圖4）

圖4 HPLC 圖

2.4.4 線性關(guān)系考察 精密量取混合對(duì)照品溶液適量，用75%甲醇稀釋得系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液（沒食子酸質(zhì)量濃度分別為12.45、24.90、49.80、124.50、249.00、498.00 μg/mL；柯里拉京質(zhì)量濃度分別為24.75、49.50、99.00、198.00、495.00、990.00 μg/mL），按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，計(jì)算2個(gè)成分的線性回歸方程。結(jié)果得沒食子酸線性方程為Y=15 068X-14 509（r=0.999 8）、柯里拉京線性方程為Y=38 265X-7 032（r=0.999 9），表明沒食子酸、柯里拉京分別在12.45~498.00、24.75~990.00μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.5 精密度試驗(yàn) 取同一批樣品（批號(hào)：190902），按照“2.4.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各成分峰面積并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果沒食子酸、柯里拉京峰面積RSD值分別為0.62%、0.59%，表明儀器精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批樣品（批號(hào)：190902），按照“2.4.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12 h按照“2.4.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄各成分峰面積。結(jié)果沒食子酸、柯里拉京峰面積RSD值分別為1.68%、1.75%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（批號(hào)：190902），稱取6份，按照“2.4.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄各成分峰面積。結(jié)果沒食子酸、柯里拉京峰面積RSD值分別為1.04%、0.99%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品（批號(hào)：190902）9份，每份約0.5 g，精密稱定，分別加入絕對(duì)含量接近樣品50%、100%、150%量的混合對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度3份，按“2.4.2.2”項(xiàng)下方法分別制備供試溶液，按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果沒食子酸、柯里拉京的平均加樣回收率分別為100.14%、99.71%，RSD值分別為2.00%、2.02%，表明本方法準(zhǔn)確度良好。（見表2）

表2 葉下珠飲片中沒食子酸、柯里拉京加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 （n=9）

2.4.9 樣品含量測(cè)定 精密稱取11批葉下珠飲片粉末各2份，分別按照“2.4.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，根據(jù)線性回歸方程，計(jì)算沒食子酸、柯里拉京的含量。（見表3）

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果 （n=2）

2.5 水分、總灰分、酸不溶灰分、醇溶性浸出物測(cè)定 按照2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則0832第二法測(cè)定11批葉下珠飲片的水分；按照2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則2302測(cè)定11批葉下珠飲片的總灰分；按照2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則2302測(cè)定11批葉下珠飲片的酸不溶灰分。按照2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則2201測(cè)定11批葉下珠飲片的醇溶性浸出物。（見表4）

表4 葉下珠飲片中水分、總灰分、酸不溶灰分及醇溶性浸出物的含量 （n=3）

3 討論

3.1 薄層色譜凈化溶劑的選擇 本研究比較了3種凈化溶劑，含二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚。結(jié)果二氯甲烷雜質(zhì)去除能力弱，背景顯色深，目標(biāo)點(diǎn)不清晰；乙酸乙酯可去除Rf值為0.6的目標(biāo)點(diǎn)，影響鑒別結(jié)果；乙醚可選擇性保留目標(biāo)點(diǎn)，為最佳凈化溶劑。（見圖5）

圖5 不同凈化溶劑薄層色譜圖

3.2 薄層色譜展開劑的選擇 本研究比較了三氯甲烷-甲醇（7.5：1.0）、二氯甲烷-甲醇（6：1）和正己烷-乙酸乙酯-甲醇（6：2：1）3種展開劑。結(jié)果顯示，與其他兩種比較，三氯甲烷-甲醇（7.5：1.0）對(duì)Rf=0.4和Rf=0.7兩紫紅色斑點(diǎn)，展開效果均好，斑點(diǎn)清晰，為最佳展開劑。（見圖6）

圖6 不同展開劑薄層色譜圖

3.3 顯微鑒別 目前多個(gè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)記載了葉下珠橫切面和粉末顯微特征，與本研究大多相似或相同，但仍存在一定差異。如柵欄細(xì)胞長(zhǎng)度，本研究為“45~70 μm”，湖北省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[21]為“13~17 μm”，孫佳石等[22]為“12~18 μm”。導(dǎo)管類型。本研究中導(dǎo)管為“螺紋、網(wǎng)紋”，張秀橋等[20]和湖北省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[21]為“多為螺紋、網(wǎng)紋、孔紋、少數(shù)環(huán)紋”，孫佳石等[22]為“多為螺紋、孔紋，少數(shù)環(huán)紋”，彭菲[23]等為“多為螺紋、孔紋，少數(shù)網(wǎng)紋導(dǎo)管”，干國(guó)平等[24]為“主為螺紋、網(wǎng)紋及孔紋，少數(shù)環(huán)紋”。氣孔類型，本研究為“多為平軸式，少數(shù)為不等式”，彭菲等[23]、牛曉峰等[25]為“平軸式”，江西省中藥飲片炮制規(guī)范[26]為“直軸式”。另有，《江西省中藥飲片炮制規(guī)范》[26]中有觀察到石細(xì)胞等組織，本研究均未發(fā)現(xiàn)。

3.4 含量測(cè)定

3.4.1 供試品溶液制備條件考察 本研究基于供試品溶液中沒食子酸和柯里拉京峰面積最大或不再增加，比較了不同提取溶劑、提取時(shí)間及提取體積。結(jié)果顯示，相對(duì)于50%甲醇和90%甲醇，75%甲醇所提取供試品溶液中沒食子酸和柯里拉京峰面積最大；當(dāng)提取時(shí)間為30 min，兩種成分峰面積不再增加；當(dāng)提取體積為40 mL時(shí)，峰面積亦不再增加。綜上，選定40 mL 75%甲醇提取30 min為最佳提取條件。（見表5）

表5 不同考察條件下樣品峰面積

3.4.2 色譜條件考察 本研究比較了不同流速（含0.8、1.0mL/min；不同流動(dòng)相組成（乙腈-0.1%乙酸、乙腈-水）對(duì)分離效果的影響。結(jié)果當(dāng)流速為1.0 mL/min時(shí)，柯里拉京和雜峰無法達(dá)到基線完全分離（見圖7a）；當(dāng)流速為0.8 mL/min時(shí)，分離得到改善，但是峰出現(xiàn)明顯前延和拖尾（見圖7b）；在流動(dòng)相系統(tǒng)水相中加入0.1%乙酸后情況得到明顯改善（見圖7c）。

圖7 不同流動(dòng)相組成、流速色譜圖

3.4.3 指標(biāo)成分含量分析及限量值擬定 根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，本研究11批樣品沒食子酸含量為0.011 0%~0.258 2%，柯里拉京含量為0.1267%~0.3291%；已有文獻(xiàn)報(bào)道，沒食子酸為0.0391%~2.300 0%[27-28]，柯里拉京為0.0341%~2.2140%[29-30]；且韓越等[18]擬定“柯里拉京不得低于0.3%”，陜西省中藥材標(biāo)準(zhǔn)[31]規(guī)定“柯里拉京含量不得低于0.1%”，同時(shí)尚未發(fā)現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)將沒食子酸納入葉下珠含量指標(biāo)成分。本研究綜合研判，擬定“柯里拉京含量不得低于0.1%”，并新增沒食子酸為含量指標(biāo)成分，且擬定“沒食子酸含量不得低于0.01%”。

3.5 水分、總灰分、酸不溶灰分、醇溶性浸出物含量分析和限量值擬定 根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，本研究11批樣品水分含量為9.49%~11.29%，韓越等[18]為9.71%~10.75%，已發(fā)布標(biāo)準(zhǔn)[1,26,32]限量值分別為10%、12%、13%?？偦曳譃?.02%~9.92%，韓越等[18]為9.56%~14.44%，莫我躍等[19]為5.69%~8.02%，已發(fā)布標(biāo)準(zhǔn)[26，32]限量值分別為10%、15%。酸不溶灰分含量為0.64%~1.67%，莫我躍等[19]為0.74%~1.64%，已發(fā)布標(biāo)準(zhǔn)[26,32]限量值分別為3%、8%。醇溶性浸出物含量為15.73%~30.25%，韓越等[18]為16.16%~27.43%，莫我躍等[19]為16.35%~28.82%，已發(fā)布標(biāo)準(zhǔn)[32]限量值為10%。本研究綜合研判，水分限度擬定為“不得過13.0%”，總灰分限度擬定為“不得過12.0%”，酸不溶灰分限度擬定為“不得過3.0%”，醇溶性浸出物限度擬定為“不得少于15.0%”。

綜上所述，本研究在2010年版《湖南省中藥飲片炮制規(guī)范》基礎(chǔ)上，增加了粉末鑒別、莖橫切面鑒別、葉橫切面鑒別、水分、總灰分、酸不溶灰分、醇溶性浸出物及含量測(cè)定等，并優(yōu)化了各項(xiàng)參數(shù)，且研究成果已經(jīng)被2021年版《湖南省中藥飲片炮制規(guī)范》收錄，能夠更為準(zhǔn)確、全面地控制葉下珠飲片的質(zhì)量。