心腦欣片HPLC指紋圖譜建立及7種成分測(cè)定*

崔 兵，高 凡，田佳業(yè)，秦飄然，丁 哲，沈浩然，黨靜靜，劉興超,3,4

（1.景忠山國(guó)藥（唐山）有限公司，河北 唐山 063000；2.河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050200；3.河北省高校中藥開(kāi)發(fā)與產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，河北 石家莊 050200；4.河北省中藥組方制劑技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050200）

心腦欣片由景忠山國(guó)藥（唐山）有限公司研發(fā)，用于治療氣陰不足，瘀血阻滯所引起的頭暈、頭痛、心悸、氣喘、乏力及缺氧引起的紅細(xì)胞增多癥[1]。心腦欣片由紅景天、枸杞子和沙棘組成。傳統(tǒng)藏藥紅景天為君藥，具有益氣活血、通脈平喘之功[2]，主要包括紅景天苷、酪醇、沒(méi)食子酸等化學(xué)成分[2]；枸杞子有滋肝補(bǔ)腎、益精明目之功效[3]。相關(guān)研究表明，枸杞子中咖啡酸、對(duì)香豆酸等有機(jī)酸類成分與其功效密切相關(guān)[4]。沙棘有健脾消食、止咳祛痰、活血化瘀之功效[3]。相關(guān)研究[5]表明，沒(méi)食子酸、槲皮素等可作為沙棘功效相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)志物。但現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文獻(xiàn)中僅檢測(cè)了紅景天苷和甜菜堿的含量，難以作為整體質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[6-7]。因此，應(yīng)選擇多種與功效相關(guān)的有效成分或主要成分作為檢測(cè)指標(biāo)來(lái)對(duì)心腦欣片進(jìn)行全面質(zhì)量控制。

鑒于中藥復(fù)方具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，通過(guò)高效液相色譜（HPLC）法建立中藥指紋圖譜可以更加全面地反映藥材的整體化學(xué)成分類型[8-10]，而且結(jié)合化學(xué)識(shí)別模式和一測(cè)多評(píng)法可以更客觀地反映中藥的質(zhì)量信息，達(dá)到綜合評(píng)價(jià)中藥整體質(zhì)量的目的[11-12]。因此，本研究建立了心腦欣片HPLC指紋圖譜，并采用一測(cè)多評(píng)法測(cè)定紅景天苷、酪醇、沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸乙酯、對(duì)香豆酸、咖啡酸和綠原酸的含量，旨在為心腦欣片的質(zhì)量控制和臨床用藥提供參考，也為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制的探索提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；WondaSil C18-WR色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ME204E102型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）。

1.2 試劑與藥物 紅景天苷對(duì)照品（批號(hào)：AF21060954，純度：98%）、酪醇對(duì)照品（批號(hào)：AF21051753，純度：98%）、沒(méi)食子酸對(duì)照品（批號(hào)：AF20050701，純度：98%）、沒(méi)食子酸乙酯對(duì)照品（批號(hào)：AF21022852，純度：98%）、綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：AF9082001，純度：98%）、咖啡酸對(duì)照品（批號(hào)：AF21020856，純度：98%）、對(duì)香豆酸對(duì)照品（批號(hào)：AF20041951，純度：98%）均購(gòu)自成都埃法生物科技有限公司；甲醇、磷酸為色譜純；乙醇為分析純；水為超純水。心腦欣片共11批（編號(hào)：S1~S11，批號(hào)分別為201201、201202、201203、210101、210102，210103、211203、211204、211205、211206、211207）由景忠山國(guó)藥（唐山）有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 WondaSil C18-WR色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0~20 min，95%B~80%B；20~70 min，80%B~40%B）；流速為1.0 mL/min；柱溫為35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm；進(jìn)樣量為20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精準(zhǔn)稱取各對(duì)照品5 mg，分別加適量甲醇制備成紅景天苷、酪醇、沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸乙酯、對(duì)香豆酸、咖啡酸、綠原酸質(zhì)量濃度分別為4.500、1.025、1.425、0.085、0.115、0.090、0.100 mg/mL的對(duì)照品溶液。分別取上述7種對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加入10 mL容量瓶中，50%甲醇定容至刻度，制得紅景天苷、酪醇、沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸乙酯、對(duì)香豆酸、咖啡酸、綠原酸質(zhì)量濃度分別為0.450 0、0.102 5、0.142 5、0.008 5、0.011 5、0.009 0、0.010 0 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取心腦欣片適量，研細(xì)，精確稱取1 g，置于錐形瓶中，加入75%甲醇20 mL，超聲處理30 min，放冷，75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照品溶液的制備 按處方比例制備缺紅景天、缺枸杞子、缺沙棘的陰性對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品制備方法制備，即得。

2.3 HPLC指紋圖譜建立

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取心腦欣片供試品溶液（批號(hào)：211203）適量，按“2.1”色譜條件進(jìn)樣6次，以紅景天苷為參照，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD值分別小于0.35%、0.67%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取心腦欣片供試品溶液（批號(hào)：211203）適量，于0、4、8、12、16、24 h按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以紅景天苷為參照，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD值分別小于0.46%、1.74%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批心腦欣片（批號(hào)：211203）6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣測(cè)定，以紅景天苷為參照，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD值分別小于0.41%、1.89%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 圖譜生成及相似度評(píng)價(jià) 取11批心腦欣片樣品S1~S11溶液，依次進(jìn)樣測(cè)定，將所得色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.130723版本）》，設(shè)定樣品S1為參照，時(shí)間窗寬度0.1 min，采用多點(diǎn)校正全譜峰匹配，共確定24個(gè)共有峰，平均值法生成指紋圖譜共有模式（R）。（見(jiàn)圖1）各批樣品圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度分別為0.967、0.992、0.987、0.990、0.992、0.990、0.988、0.974、0.973、0.991、0.980、1.000，均大于0.960，以5號(hào)峰（紅景天苷）為參照，測(cè)得共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的RSD值分別為0.03%~0.25%、1.92%~16.07%，表明不同批次樣品所含成分差別不大，但各成分含量有一定差異。

圖1 11 批樣品HPLC 指紋圖譜（A）及混合對(duì)照品HPLC 色譜圖（B）

2.3.5 聚類分析 采用SPSS 26.0軟件，以共有峰相對(duì)峰面積為變量，組間連接和平歐式距離法繪圖。結(jié)果顯示，11批樣品聚為3類，第1類為S1，第2類為S2、S3、S4、S5、S6，第3類為S7、S8、S9、S10、S11。（見(jiàn)圖2）表明不同批次間心腦欣片存在差異，但差異并不明顯。

圖2 11 批樣品樹(shù)狀圖

2.3.6 主成分分析 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行主成分分析，提取得到特征值大于1的4個(gè)主成分，其累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)95.045%，說(shuō)明所提取成分可以代表11批樣品HPLC指紋圖譜中各成分的大部分信息。（見(jiàn)表1）載荷矩陣可直觀反映各個(gè)變量對(duì)主成分的綜合貢獻(xiàn)[13]，結(jié)合表1特征值和方差貢獻(xiàn)率、因子載荷矩陣進(jìn)行考察，可知色譜峰16（對(duì)香豆酸）、18、20、21、22、23號(hào)對(duì)主成分1貢獻(xiàn)率較大，色譜峰3（沒(méi)食子酸）、8（酪醇）、9號(hào)對(duì)主成分2貢獻(xiàn)率較大，色譜峰5、6、13（沒(méi)食子酸乙酯）號(hào)對(duì)主成分3貢獻(xiàn)率較大，色譜峰7（紅景天苷）、11（咖啡酸）號(hào)對(duì)主成分4貢獻(xiàn)率較大。（見(jiàn)表2）再采用SIMCA 14.1軟件繪制得到主成分分析得分圖，可知11批樣品主要分成3類，與聚類分析結(jié)果一致。（見(jiàn)圖3）

表1 主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率

表2 主成分因子載荷矩陣

圖3 主成分分析得分圖

2.4 一測(cè)多評(píng)法測(cè)定各成分含量

2.4.1 系統(tǒng)適應(yīng)性考察 精密吸取混合對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，各成分色譜峰分離度均符合要求，理論塔板數(shù)均大于5 000，陰性樣品無(wú)干擾。（見(jiàn)圖4）

圖4 各成分HPLC 色譜圖

2.4.2 線性關(guān)系考察 將“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液分別用50%甲醇稀釋0、2、4、8、16、32、64倍，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各成分線性關(guān)系

2.4.3 精密度試驗(yàn) 精確吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6次，結(jié)果沒(méi)食子酸、紅景天苷、酪醇、綠原酸、咖啡酸、沒(méi)食子酸乙酯、對(duì)香豆酸峰面積RSD值分別為0.23%、0.21%、0.34%、0.54%、0.67%、0.25%、0.28%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取心腦欣片供試品溶液（批號(hào)：211203）適量，于0、4、8、12、16、24 h依次進(jìn)樣，結(jié)果沒(méi)食子酸、紅景天苷、酪醇、綠原酸、咖啡酸、沒(méi)食子酸乙酯、對(duì)香豆酸峰面積RSD值分別為1.69%、0.91%、1.37%、1.58%、1.68%、1.41%、0.84%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次心腦欣片（批號(hào)：211203）6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得沒(méi)食子酸、紅景天苷、酪醇、綠原酸、咖啡酸、沒(méi)食子酸乙酯、對(duì)香豆酸峰面積RSD值分別為1.89%、0.13%、0.28%、1.06%、1.83%、0.21%、0.20%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 精確稱取同一批心腦欣片樣品0.5 g，共7份，置于10 mL容量瓶中，精密加入“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液（含紅景天苷0.450 0 mg/mL、酪醇0.102 5 mg/mL、沒(méi)食子酸0.142 5 mg/mL、沒(méi)食子酸乙酯0.008 5 mg/mL、對(duì)香豆酸0.0115 mg/mL、咖啡酸0.009 0 mg/mL、綠原酸0.010 0 mg/mL）5 mL，甲醇定容進(jìn)樣，計(jì)算回收率。結(jié)果測(cè)得沒(méi)食子酸、紅景天苷、酪醇、綠原酸、咖啡酸、沒(méi)食子酸乙酯、對(duì)香豆酸平均加樣回收率分別為104.02%、97.09%、96.76%、100.08%、97.12%、102.98%、98.82%，RSD值分別為0.06%、0.35%、0.89%、0.06%、0.05%、1.48%、1.26%。

2.4.7 相對(duì)校正因子（fk/s）計(jì)算 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，用甲醇依次進(jìn)行等倍比稀釋，共7個(gè)濃度點(diǎn)，依次在“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以沒(méi)食子酸為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算其他6種成分fk/s，公式為fk/s=fk/fs=（CkAs）/（CsAk）。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 各成分相對(duì)校正因子

2.4.8 耐用性試驗(yàn) 通過(guò)考察Thermo Acclaim 120、Agilent Eclipse Plus C、WondaSil CWR3個(gè)色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）及Waters e2695、Agilent 1260、Shimadzu LC-20A 3種色譜儀對(duì)各成分fk/s的影響。結(jié)果顯示對(duì)檢測(cè)結(jié)果均無(wú)明顯影響（RSD值＜5%）。（見(jiàn)表5）

2.4.9 樣品含量測(cè)定 取11批樣品，分別采用外標(biāo)法、一測(cè)多評(píng)法計(jì)算含量。結(jié)果顯示2種方法所得結(jié)果無(wú)明顯差異，表明一測(cè)多評(píng)法合理可行。（見(jiàn)表6）

表6 各成分含量測(cè)定結(jié)果 （mg/g）

3 討論

3.1 指標(biāo)成分、內(nèi)標(biāo)選擇 多成分的綜合測(cè)定成為中藥質(zhì)量控制研究的重點(diǎn)。建立質(zhì)量標(biāo)志物群的“一測(cè)多評(píng)法”方法，成為解決指標(biāo)成分單一問(wèn)題的關(guān)鍵[18]。本研究根據(jù)心腦欣片3味組方藥材的主要成分及其藥理作用，結(jié)合一測(cè)多評(píng)指標(biāo)選擇原則和中藥質(zhì)量標(biāo)志物確認(rèn)原則[14]以及分析2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》心腦欣膠囊中指標(biāo)性成分，檢測(cè)了紅景天的紅景天苷和枸杞中的甜菜堿。甜菜堿的檢測(cè)方法為薄層色譜法，但本研究采用的是高效液相色譜法，且甜菜堿化學(xué)結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖5）與氨基酸類似，紫外吸收很弱。因此本研究選擇組方中紅景天苷、酪醇、沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸乙酯、對(duì)香豆酸、咖啡酸和綠原酸作為指標(biāo)成分[3-5]，并選定峰面積最大、峰型較好的沒(méi)食子酸作為內(nèi)標(biāo)。

圖5 甜菜堿的結(jié)構(gòu)式

3.2 提取條件選擇 本研究考察了供試品溶液的提取方式（回流、超聲）、提取溶劑（25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇）、提取時(shí)間（20、30、40min）和提取料液比（0.5g：20 mL、1 g：20 mL、2 g：20 mL）對(duì)各成分提取效率的影響。綜合考慮效益成本及單位質(zhì)量各色譜峰峰面積，本研究最終確定供試品溶液制備方法為以75%甲醇按料液比1 g：20 mL超聲提取30 min。

3.3 波長(zhǎng)的選擇 紅景天苷、酪醇、沒(méi)食子酸等在275 nm處有最大吸收[15-16]，而綠原酸在324 nm處有最大吸收[17]。在心腦欣片的指紋圖譜研究中，通過(guò)與混合對(duì)照品的保留時(shí)間及紫外吸收波長(zhǎng)比對(duì)，比較不同波長(zhǎng)條件下各峰的響應(yīng)值、分離度、對(duì)稱性及拖尾因子等參數(shù)，本研究最終選擇275 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。在該波長(zhǎng)下，各峰分離度、峰形對(duì)稱性良好。

綜上所述，心腦欣片HPLC指紋圖譜中有24個(gè)共有峰，相似度均在0.960以上，表明該制劑生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，各組分之間差異不大，但不同批次樣品中各成分含量有一定差異。聚類分析結(jié)果顯示，心腦欣片分為3類，且主成分分析提取到的4個(gè)主成分能代表95.045%的共有峰信息，表明不同批次產(chǎn)品存在一定的差異性。外標(biāo)法、一測(cè)多評(píng)法所得結(jié)果基本一致，表明該試驗(yàn)建立的一測(cè)多評(píng)法可用于心腦欣片中各成分含量測(cè)定，為全面評(píng)價(jià)心腦欣片質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)，同時(shí)有利于藥品生產(chǎn)企業(yè)和監(jiān)管部門提升心腦欣片的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，確保臨床用藥療效的一致性。