基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS的芪龍壯兒口服液指紋圖譜研究*

崔小敏，董明芝，陳志永，魯文靜，胡 靜，李 寧，曲 彤，任 慧

（1.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710061；2.西安正大制藥有限公司，陜西 西安 710043）

芪龍壯兒口服液是由著名中醫(yī)兒科專家午雪嶠主任醫(yī)師根據(jù)中醫(yī)理論，針對(duì)小兒脾腎兩虛所致疳積、五遲五軟、血虛之證擬定的中成藥。芪龍壯兒口服液為OTC甲類中成藥，以黃芪、黨參為君藥，熟地黃、當(dāng)歸、阿膠、鹿角膠、龜甲膠為臣藥，龍骨、牡蠣、白術(shù)、山藥、雞內(nèi)金、山楂和麥芽為佐使之藥。全方健脾補(bǔ)腎，益氣養(yǎng)血，填精充髓，消食和胃，臨床主要用于治療小兒佝僂病。

目前芪龍壯兒口服液的質(zhì)量控制方法是采用薄層掃描法測(cè)定其中黃芪甲苷的含量[1]，難以全面反映和控制芪龍壯兒口服液的制劑質(zhì)量。中藥及復(fù)方制劑化學(xué)成分復(fù)雜，質(zhì)量控制是其研究的難點(diǎn)，檢測(cè)其中一種成分并不能代表整體質(zhì)量。中藥指紋圖譜具有整體性和模糊性的顯著特點(diǎn)，能全面、定量反映中藥所包含的化學(xué)信息，為中藥質(zhì)量控制最常見的有效手段[2]。課題組前期嘗試采用HPLC-UV法建立芪龍壯兒口服液指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)HPLC-UV色譜圖化學(xué)信息量很少。UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技術(shù)將超高效液相色譜對(duì)復(fù)雜樣品的高分離能力與質(zhì)譜的高分辨率、高靈敏度及能提供化合物的元素組成及離子碎片信息等特點(diǎn)結(jié)合起來，可用于化合物的快速鑒定。該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于中藥化學(xué)成分鑒定和指紋圖譜研究[3-4]。本研究利用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS可以同時(shí)檢測(cè)正、負(fù)離子化合物的優(yōu)勢(shì)，建立了芪龍壯兒口服液正、負(fù)兩種離子模式下的指紋圖譜，同時(shí)對(duì)10批樣品進(jìn)行了相似度評(píng)價(jià)，對(duì)其中的共有峰進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定，從正、負(fù)兩個(gè)維度較為全面地表征了該制劑的化學(xué)成分指紋特征，旨在為芪龍壯兒口服液的綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)和藥效物質(zhì)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UltiMate 3000系列高效液相色譜儀（美國戴安公司）；Thermo Fisher Q Exactive Focus型質(zhì)譜儀，配有可加熱電噴霧離子源（HESI）及Xcalibur4.0數(shù)據(jù)處理軟件；KQ-400DE型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；BT25S型十萬分之一電子分析天平、BS210S型萬分之一電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 藥物與試劑 10批芪龍壯兒口服液[規(guī)格：10 mL/支；批號(hào)：211135（S1），211136（S2），211237（S3），211238（S4），211239（S5），211240（S6），211241（S7），2111242（S8），211243（S9），211244（S10）]由西安正大制藥有限公司提供。腺苷（批號(hào)：MUST-21070613）、鳥苷（批號(hào)：MUST-22021408）、異毛蕊花糖苷（批號(hào)：MUST-22030810）均購自成都曼思特生物科技有限公司；L-色氨酸（批號(hào)：wkq22011707）、毛蕊異黃酮苷（批號(hào)：wkq20010904）、黨參炔苷（批號(hào)：wkq17110203）、芒柄花苷（批號(hào)：wkq20060507）、毛蕊異黃酮（批號(hào)：wkq20010906）、芒柄花素（批號(hào)：wkq20062208）均購自四川省維克奇生物科技有限公司；3-羥基-9,10-二甲氧基紫檀烷（批號(hào)：HR2182W1）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（批號(hào)：HS20913B1）、焦谷氨酸（批號(hào)：HR22271W2）、尿苷（批號(hào)：HS2175B1）均購自寶雞辰光生物科技有限公司；咖啡酸（批號(hào)：17122804）購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司。以上對(duì)照品純度均≥98%。甲醇和甲酸為色譜純，均購自美國Fisher試劑公司，水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Thermo Accucore aQ RP18（2.1 mm×150 mm，2.6 μm）；流動(dòng)相為甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B）梯度洗脫（0~5 min，0%A；5~45 min，0%A~58%A；45~60 min，58%A~65%A）；柱溫為25 ℃，流速為0.3 mL/min，進(jìn)樣量為2 μL。

2.2 質(zhì)譜條件 Thermo UHPLC-Q-Exactive Focus型液質(zhì)聯(lián)用儀，采用加熱電噴霧離子源（HESI），正、負(fù)離子同時(shí)檢測(cè)模式，負(fù)離子模式下的噴霧電壓設(shè)定為2 800 V，正離子模式下的噴霧電壓設(shè)定為3 500 V；碰撞電壓為階梯能量20、40、60 eV；掃描方式為一級(jí)全掃描/數(shù)據(jù)依賴型二級(jí)質(zhì)譜掃描（full MS/dd-MS2），F(xiàn)ull MS分辨率為70 000，dd-MS2分辨率為17 500，掃描范圍（m/z）為80~1 200，離子傳輸毛細(xì)管溫度為320 ℃，透鏡電壓為55 kPa，霧化室溫度為350 ℃，鞘氣和輔助氣流速分別為40、10 arb。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 分正、負(fù)兩種檢測(cè)模式制成兩組混合對(duì)照品溶液。分別取各對(duì)照品適量，加甲醇制備成含腺苷、鳥苷、L-色氨酸、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、3-羥基-9,10-二甲氧基紫檀烷、芒柄花素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ質(zhì)量濃度分別為86、37、15、144、46、55、18、25、19 μg/mL的混合對(duì)照品溶液Ⅰ（正離子模式）和含焦谷氨酸、尿苷、咖啡酸、毛蕊異黃酮苷、異毛蕊花糖苷、黨參炔苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素質(zhì)量濃度分別為65、70、20、144、45、24、46、55、25 μg/mL的混合對(duì)照品溶液Ⅱ（負(fù)離子模式）。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密量取芪龍壯兒口服液2 mL，置于15 mL離心管中，加入8 mL乙腈，于渦旋振蕩器中振蕩混勻5 min，于4 ℃靜置0.5 h后，2 500 r/min條件下離心20 min，取上清液1 mL，吹干溶劑，殘?jiān)?0%甲醇-水溶解并定容至1 mL，振搖，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3.3 各單味藥樣品制備 根據(jù)各單味藥在處方中對(duì)應(yīng)的處方量和配比取樣，制備單味藥材樣品溶液。

2.4 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液（批號(hào)：211135）連續(xù)進(jìn)樣6次，正離子模式以18號(hào)共有峰毛蕊異黃酮為參照峰，負(fù)離子模式以9號(hào)共有峰毛蕊異黃酮苷為參照峰，分別計(jì)算正離子模式下的24個(gè)共有峰和負(fù)離子模式下的17個(gè)共有峰與所選定參照峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD。結(jié)果RSD值分別小于0.62%和2.84%，表明該方法精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取芪龍壯兒口服液2 mL（批號(hào)：211135），按照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在室溫放置0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析。分別計(jì)算正離子模式下的24個(gè)共有峰和負(fù)離子模式下的17個(gè)共有峰與所選定參照峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD。結(jié)果RSD值均分別小于0.89%和3.16%，表明樣品制備成供試品溶液后在室溫放置24 h穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取芪龍壯兒口服液2 mL（批號(hào)：211135），按照“2.3.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液并進(jìn)樣分析。分別計(jì)算正離子模式下的24個(gè)共有峰和負(fù)離子模式下的17個(gè)共有峰與所選定參照峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD。結(jié)果RSD值分別小于0.55%和2.97%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜的建立和相似度評(píng)價(jià)

2.5.1 10批樣品指紋圖譜建立和相似度分析 取10批芪龍壯兒口服液（S1～S10），按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”和“2.2”項(xiàng)下色譜條件和質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析。使用Xcalibar 4.0軟件將數(shù)據(jù)文件導(dǎo)出為“ txt”格式，采用2012版中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件進(jìn)行全譜峰匹配，采用多點(diǎn)校正模式，平均數(shù)法（時(shí)間窗0.1 min）生成指紋圖譜。正離子模式指紋圖譜見圖1，確定共有峰24個(gè)；負(fù)離子模式指紋圖譜見圖2，確定共有峰17個(gè)。正離子模式下，S1～S10與對(duì)照指紋圖譜的相似度分別為0.995、0.995、0.995、0.993、0.997、0.986、0.989、0.993、0.994、0.986。負(fù)離子模式下，S1～S10與對(duì)照指紋圖譜的相似度分別為0.997、0.991、0.997、0.997、0.997、0.994、0.968、0.973、0.988、0.993。結(jié)果表明正、負(fù)離子兩種檢測(cè)模式下的10批樣品相似度均大于0.960，表明不同批次的芪龍壯兒口服液之間具有良好的一致性，其投料藥材質(zhì)量及生產(chǎn)工藝比較穩(wěn)定。

圖1 10 批芪龍壯兒口服液正離子模式下的指紋圖譜

圖2 10 批芪龍壯兒口服液負(fù)離子模式下的指紋圖譜

2.5.2 指紋圖譜中共有峰的歸屬 取供試品溶液、單味藥材、空白溶劑，按照“2.1”和“2.2”項(xiàng)下色譜條件和質(zhì)譜條件進(jìn)樣，記錄質(zhì)譜總離子流基峰圖，比對(duì)色譜圖中各峰，將主要色譜峰進(jìn)行藥材的歸屬。結(jié)果見表1~2。

表1 芪龍壯兒口服液在UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 正離子模式下指紋圖譜共有峰鑒定

表2 芪龍壯兒口服液在UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 負(fù)離子模式下指紋圖譜共有峰鑒定

2.5.3 指紋圖譜中共有峰的鑒定 根據(jù)高分辨質(zhì)譜一級(jí)、二級(jí)數(shù)據(jù)和參考文獻(xiàn)，共鑒定了正離子模式下15個(gè)共有峰和負(fù)離子模式下的12個(gè)共有峰，結(jié)果見表1~2。其中正離子模式下有9個(gè)化合物采用對(duì)照品比對(duì)鑒定分別為腺苷（4號(hào)共有指紋峰）、鳥苷（5號(hào)共有指紋峰）、L-色氨酸（7號(hào)共有指紋峰）、毛蕊異黃酮苷（12號(hào)共有指紋峰）、芒柄花苷（17號(hào)共有指紋峰）、毛蕊異黃酮（18號(hào)共有指紋峰）、3-羥基-9,10-二甲氧基紫檀烷（21號(hào)共有指紋峰）、芒柄花素（23號(hào)共有指紋峰）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（24號(hào)共有指紋峰）；負(fù)離子模式下有9個(gè)化合物采用對(duì)照品比對(duì)鑒定分別為焦谷氨酸（1號(hào)共有指紋峰）、尿苷（2號(hào)共有指紋峰）、咖啡酸（7號(hào)共有指紋峰）、毛蕊異黃酮苷（9號(hào)共有指紋峰）、異毛蕊花糖苷（10號(hào)共有指紋峰）、黨參炔苷（11號(hào)共有指紋峰）、芒柄花苷（12號(hào)共有指紋峰）、毛蕊異黃酮（14號(hào)共有指紋峰）、芒柄花素（16號(hào)共有指紋峰）。（見圖3）共有峰的質(zhì)譜鑒定過程以異毛蕊花糖苷為例進(jìn)行說明。異毛蕊花糖苷在負(fù)離子模式下的準(zhǔn)離子峰為（m/z）623.198 1[M-H]-，經(jīng)Xcalibar 4.0軟件擬合其分子式為C29H36O15，二級(jí)碎片離子有（m/z）461.167 1[M-H-C9H6O3]-和（m/z）161.024 4[M-H-C20H30O12]-，為咖啡酰鍵斷裂產(chǎn)生，（m/z）461.167 1[M-H-C9H6O3]-進(jìn)一步失去一分子鼠李糖產(chǎn)生碎片（m/z）315.107 9[M-H-C9H6O3-Rha]-，（m/z）161.024 4[M-H-C20H30O12]-失去一分子CO產(chǎn)生碎片離子（m/z）133.029 5[M-H-C20H30O12-CO]-。根據(jù)以上裂解途徑，參考相關(guān)文獻(xiàn)[5]并通過對(duì)照品比對(duì)確定負(fù)離子模式下的化合物10為異毛蕊花糖苷，其可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖4。

圖3 混合對(duì)照品和芪龍壯兒口服液對(duì)照指紋圖譜的總離子流基峰圖

圖4 異毛蕊花糖苷的質(zhì)譜裂解途徑

3 討論

本試驗(yàn)分別考察了不同色譜柱[Thermo Accucore aQ RP18（2.1 mm×150 mm，2.6 μm）和Agilent Poroshell 120 ECC18（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）]、不同流動(dòng)相組合（甲醇、乙腈和水）及添加不同濃度的甲酸（0.1%和0.2%）對(duì)結(jié)果的影響。結(jié)果表明采用Thermo Accucore aQ RP18（2.1 mm×150 mm，2.6μm）色譜柱，以甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，質(zhì)譜響應(yīng)值較高，色譜峰分離效果最佳、峰形最好。

正、負(fù)離子指紋圖譜中均有數(shù)個(gè)峰未進(jìn)行鑒定，如正離子指紋圖譜中50 min以后的色譜峰和負(fù)離子指紋圖譜中50 min前后的色譜峰。經(jīng)比對(duì)這些色譜峰為輔料甜菊苷或者空白溶劑本來就有的峰，因此未納入指紋圖譜共有峰當(dāng)中。

芪龍壯兒口服液含有阿膠、鹿角膠、龜甲膠等富含氨基酸的膠類藥材。氨基酸類化合物在常規(guī)的HPLC-UV條件下直接檢測(cè)不到色譜峰[17-19]，且紫外檢測(cè)器只能檢測(cè)到含有紫外發(fā)光基團(tuán)的化合物，具有一定局限性。質(zhì)譜檢測(cè)器屬于通用型檢測(cè)器，對(duì)氨基酸類等無紫外吸收的化合物均有較好的響應(yīng)信號(hào)[20]，因此本研究采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技術(shù)建立了芪龍壯兒口服液正、負(fù)離子檢測(cè)模式下的兩種指紋圖譜，信息量豐富、分離效果好，從正、負(fù)兩個(gè)不同的維度較全面地反映了芪龍壯兒口服液的成分信息，且高分辨質(zhì)譜可以直接利用其采集到的數(shù)據(jù)信息對(duì)化合物進(jìn)行鑒定，對(duì)于建立科學(xué)、合理的芪龍壯兒口服液質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，提高其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)具有一定的參考意義。