基于文獻(xiàn)計(jì)量分析益生菌微膠囊化研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢

黃鎮(zhèn)宇,徐磊,孫培龍,楊開,蔡銘,王艦

(浙江工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,浙江 杭州, 310014)

益生菌泛指可在宿主腸道內(nèi)定殖并改善微生態(tài)平衡、有益機(jī)體健康的一類微生物。近年來,腸道菌群對于人體健康的關(guān)鍵作用不斷得到揭示,高效益生菌遞送系統(tǒng)的開發(fā)成為研究熱點(diǎn)[1-2]。益生菌產(chǎn)品的生產(chǎn)、儲存與運(yùn)輸都會(huì)造成活力損失,而在益生菌被攝入之后,仍然需要面對食物組分互作、強(qiáng)酸性pH環(huán)境以及各類消化酶的挑戰(zhàn)[3]。為了在到達(dá)腸道前為益生菌提供必要的保護(hù),微膠囊化是當(dāng)下的最優(yōu)解,常見的途徑包括擠壓、乳化、凝聚、凍干和噴霧干燥[4-5]。除了增加穩(wěn)定性與細(xì)胞活力外,微膠囊化后的益生菌往往還具備控制釋放與腸道黏附作用。如今,益生菌微膠囊已經(jīng)逐漸應(yīng)用于乳制品、巧克力甚至谷物食品中,但是這項(xiàng)技術(shù)的工業(yè)規(guī)模應(yīng)用仍存在許多問題亟待解決[1]。菌種與壁材之間的生物相容性及不同微膠囊制備技術(shù)需要驗(yàn)證,還要考慮多種環(huán)境脅迫因素對產(chǎn)品穩(wěn)定性的影響。同時(shí),為確保益生菌微膠囊的健康益處,要進(jìn)一步解析對體內(nèi)消化脅迫的抵抗力,調(diào)控益生菌膠囊在消化道中的控制釋放。有關(guān)研究仍在不斷涌現(xiàn),由于益生菌菌種、壁材以及封裝策略的種類繁多,一般的系統(tǒng)性綜述難以具體量化它們的演變趨勢,需要借助文獻(xiàn)計(jì)量工具對科學(xué)文獻(xiàn)進(jìn)行大規(guī)模統(tǒng)計(jì)分析,深入探索以推進(jìn)其產(chǎn)業(yè)化。

文獻(xiàn)計(jì)量分析可以系統(tǒng)梳理國內(nèi)外相關(guān)研究的熱點(diǎn)遷移、發(fā)展脈絡(luò)與前沿方向,展示國家與機(jī)構(gòu)間合作關(guān)系,聚焦關(guān)鍵論文,此類研究方式已經(jīng)在食品領(lǐng)域得到大量應(yīng)用[6-7]。主流的文獻(xiàn)計(jì)量軟件包括CiteSpace、Vosviewer、Gephi、Histcite等,其中CiteSpace是一個(gè)動(dòng)態(tài)的引文可視化平臺,由于功能豐富常被作為研究者的首選[6]。此外,基于R語言的bibliometrix軟件包也可以實(shí)現(xiàn)類似的功能[8]。文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)應(yīng)用了數(shù)學(xué)與統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,對已發(fā)表文獻(xiàn)進(jìn)行定量分析與描述,科學(xué)高效地探索、分析、聚類特定領(lǐng)域的知識?？蒲姓撐氖腔A(chǔ)科研成果的主要轉(zhuǎn)化形式,借助文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)繪制科學(xué)知識圖譜,本研究直觀展現(xiàn)了益生菌微膠囊化領(lǐng)域內(nèi)的信息全景,預(yù)測了未來發(fā)展趨勢,有助于指導(dǎo)開辟新的研究方向。

1 文獻(xiàn)計(jì)量分析策略

1.1 文獻(xiàn)來源

中英文文獻(xiàn)分別采集于China national knowledge infrastructure(CNKI)數(shù)據(jù)庫與Web of Science(WOS)數(shù)據(jù)庫,檢索策略如表1。納入文獻(xiàn)池的文獻(xiàn)均發(fā)表于學(xué)術(shù)期刊,排除會(huì)議論文、碩博士論文以及科普論文等,剔除重復(fù)發(fā)表文獻(xiàn)。文獻(xiàn)的發(fā)表時(shí)間為2004年1月至2023年3月。

表1 文獻(xiàn)檢索策略Table 1 Search strategies for literature

1.2 研究方法及數(shù)據(jù)處理

檢索收集得到的中英文文獻(xiàn)以完整記錄的方式分別導(dǎo)出為Refworks格式與純文本(plain text file)。CiteSpace6.1.R6 (64-bit) Advanced主要用于實(shí)現(xiàn)關(guān)鍵詞、機(jī)構(gòu)等信息的聚類或共現(xiàn),進(jìn)行數(shù)據(jù)處理時(shí),時(shí)間切片設(shè)置為1年,閾值(Top N)設(shè)置為50。Vosviewer1.6.19、Gephi0.10.0與Microsoft Charticulator用于繪制國家合作網(wǎng)絡(luò)圖。Bibliometrix平臺和ggplot2軟件包用于分析關(guān)鍵詞頻次與繪制分布熱力圖。在科學(xué)知識圖譜中,節(jié)點(diǎn)的大小代表了權(quán)重或出現(xiàn)頻率,網(wǎng)絡(luò)密度從宏觀上表示不同節(jié)點(diǎn)聯(lián)系的強(qiáng)弱,2個(gè)節(jié)點(diǎn)間的連線表示兩者同時(shí)出現(xiàn)的概率,連線越粗概率越大。

2 結(jié)果與分析

2.1 年度發(fā)文數(shù)量

年度發(fā)文量是體現(xiàn)特定研究領(lǐng)域發(fā)展速度的重要指標(biāo)之一[9]。如圖1-a所示,益生菌微膠囊化研究領(lǐng)域在2004年1月至2023年3月共發(fā)表文獻(xiàn)1 438篇,其中中文202篇,英文1 236篇。從發(fā)表趨勢來看,2009年前國內(nèi)外發(fā)文量普遍偏低;2010—2013年期間英文文獻(xiàn)發(fā)表速度顯著增長,說明相關(guān)研究正處于起步階段;2017—2022年期間,中英文文獻(xiàn)年度增長速度均提升較快,處于快速發(fā)展階段(2023年的文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)僅截止3月底)。英文文獻(xiàn)無論是整體發(fā)文量還是增長速率都要遠(yuǎn)高于中文文獻(xiàn),表明有關(guān)研究趨向國際化發(fā)展。

a-年度發(fā)文量統(tǒng)計(jì);b-國內(nèi)主要發(fā)文機(jī)構(gòu);c-國外主要發(fā)文機(jī)構(gòu);d-國際合作網(wǎng)絡(luò)圖1 年度發(fā)文量統(tǒng)計(jì)與國內(nèi)外主要發(fā)文機(jī)構(gòu)以及國際合作網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Annual publication statistics, domestic and foreign major publishing institutions and international cooperation network

2.2 主要發(fā)文機(jī)構(gòu)與國家合作網(wǎng)絡(luò)

通過分析發(fā)文機(jī)構(gòu)與國際合作網(wǎng)絡(luò),可以對益生菌微膠囊化研究領(lǐng)域內(nèi)科研資源的分布與儲備進(jìn)行討論,國內(nèi)外機(jī)構(gòu)合作網(wǎng)絡(luò)如圖1-b和圖1-c所示。主要發(fā)文機(jī)構(gòu)基本為高等院校,機(jī)構(gòu)間合作通常展現(xiàn)很強(qiáng)的內(nèi)聚性與地域性[10]。中文文獻(xiàn)中的合作往往只在較少的幾個(gè)機(jī)構(gòu)之間進(jìn)行,大多數(shù)科研成果僅涉及2～4個(gè)機(jī)構(gòu)。國際機(jī)構(gòu)間的合作更加密切,最大中介中心度是江南大學(xué)的0.05,體現(xiàn)了中國機(jī)構(gòu)在該領(lǐng)域國際合作中的主導(dǎo)地位。江南大學(xué)在國內(nèi)的合作網(wǎng)絡(luò)也最為龐大,科研實(shí)力雄厚。一般來說,機(jī)構(gòu)的中心度高于單一作者但是低于某個(gè)國家,這個(gè)中心度水平上較難形成清晰的差異網(wǎng)絡(luò)[9,11]。伊斯蘭阿扎德大學(xué)(Islamic Azad University)的發(fā)文量在所有機(jī)構(gòu)中位居第一,為27篇。其次是加拿大農(nóng)業(yè)食品協(xié)會(huì)(Agriculture and Agri-Food Canada)與圣保羅大學(xué)(University of Sao Paulo)并列第二,均為21篇。4個(gè)中國機(jī)構(gòu)的發(fā)文量入圍全球前20,分別為江南大學(xué)(12篇)、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)(10篇)、南昌大學(xué)(10篇)與中國科學(xué)院(9篇)。發(fā)文量前3的國家依次是中國(184篇)、巴西(124篇)與伊朗(118篇),其余前10的國家為美國、印度、澳大利亞、加拿大、西班牙、法國和英國。中國、美國、印度等國家的國際合作伙伴較為豐富,而巴基斯塔、韓國等國家在這方面有所欠缺(圖1-d)。我國雖然發(fā)文量位居榜首,但起步時(shí)間較晚,中心度僅為0.15,遠(yuǎn)低于英國的0.36與美國的0.29。這說明我國仍然處于國際合作網(wǎng)絡(luò)的外圍,核心競爭力有待進(jìn)一步提升[9]。

2.3 高被引文獻(xiàn)

文章被引次數(shù)受到領(lǐng)域熱度、作者數(shù)量等因素的影響,是文章價(jià)值的直觀反映[8]。表2顯示了益生菌微膠囊化相關(guān)的前10篇高被引文獻(xiàn)。“Recent advances in microencapsulation of probiotics for industrial applications and targeted delivery”被引用1 255次,是引用量最高的文章,重點(diǎn)綜述了多糖相關(guān)的聚合物封裝系統(tǒng),如淀粉、殼聚糖、醋酸鄰苯二甲酸纖維素、藻酸鹽以及蛋白-多糖混合物[12]。而“Progress in microencapsulation of probiotics:A review”僅發(fā)行2年,就獲得了175次引用。該研究重點(diǎn)討論益生菌在儲存和腸胃道系統(tǒng)中面臨的挑戰(zhàn),同時(shí)提出多種遞送系統(tǒng)效率評估的新興手段,包括體內(nèi)成像系統(tǒng)(invivoimaging system,IVIS)、計(jì)算機(jī)輔助體外消化模型(dynamic gastrointestinal simulator,SIMGI)等[13]。引用量最高的研究論文“Microencapsulation of a probiotic and prebiotic in alginate-chitosan capsules improves survival in simulated gastro-intestinal conditions”開發(fā)了一種海藻酸鹽-殼聚糖膠囊,顯著提高了益生菌在體外消化模型中的存活率,同時(shí)發(fā)現(xiàn)槲皮素等益生元會(huì)威脅益生菌的生理活動(dòng),應(yīng)當(dāng)單獨(dú)膠囊化[14]。

表2 益生菌微膠囊化前10篇高被引文章Table 2 Top 10 high-cited article in field of probiotic microencapsulation research

2.4 關(guān)鍵詞聚類分析

關(guān)鍵詞聚類分析旨在揭示本領(lǐng)域內(nèi)研究人員主要探討的焦點(diǎn)問題[6,11]。CiteSpace聚類分析結(jié)果顯示,中文文獻(xiàn)的模塊化數(shù)據(jù)Q=0.564 3>0.3,S=0.859 7>0.5,網(wǎng)絡(luò)密度為0.019 1;英文文獻(xiàn)的Q=0.308 8>0.3,S=0.678 2>0.5,網(wǎng)絡(luò)密度為0.025 2,表明關(guān)鍵詞間聯(lián)系緊密,聚類效果良好[15]。英文文獻(xiàn)由于數(shù)量豐富,主題更加多元化,因此Q值、S值與單個(gè)關(guān)鍵詞中心度都會(huì)有所下降[11]。如圖2與表3所示,“乳酸菌(lactic acid bacteria)”“存活率(survival)”“海藻酸鹽(alginate)”等關(guān)鍵詞在中英文文獻(xiàn)中出現(xiàn)頻次都很高,占據(jù)主導(dǎo)地位,體現(xiàn)了益生菌微膠囊化研究中常用的菌種、壁材以及評估手段。英文文獻(xiàn)中中心度最高的關(guān)鍵詞為“嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)”,其次是“乳酸菌(lactic acid bacteria)”,這表明乳酸菌是研究中最常使用的一類益生菌。“噴霧干燥(spray drying)”說明噴霧干燥在過去20年中是研究最廣泛的微膠囊化手段,而“模擬胃腸狀況(simulated gastrointestinal condition)”是益生菌封裝效果評價(jià)的必要步驟。英文文獻(xiàn)的簇呈現(xiàn)更強(qiáng)的內(nèi)聚性,說明相關(guān)研究可能更加全面,涉及更多表征技術(shù)與評價(jià)指標(biāo)。

a-中文文獻(xiàn)關(guān)鍵詞;b-英文文獻(xiàn)關(guān)鍵詞圖2 益生菌微膠囊化中文及英文文獻(xiàn)關(guān)鍵詞聚類分析Fig.2 Keyword cluster analysis of probiotic microencapsulation research in Chinese and English literature

表3 益生菌微膠囊化中英文文獻(xiàn)10個(gè)主要關(guān)鍵詞Table 3 Top 10 main keywords of probiotic microencapsulation in Chinese and English literature

2.4.1 菌種

益生菌以乳酸菌為主,包括雙歧桿菌、腸球菌、鏈球菌等。此外,芽孢桿菌與酵母菌也屬于益生菌的范疇[16]。它們的益生機(jī)制是競爭性排斥各類病原體,形成更健康的腸道環(huán)境,產(chǎn)生短鏈脂肪酸和細(xì)菌素等活性物質(zhì)。不同益生菌菌種的益生功效各不相同,主要取決于自身的生理活性與代謝產(chǎn)物的屬性。乳酸菌在相關(guān)研究中占據(jù)主導(dǎo)地位,在中文關(guān)鍵詞聚類結(jié)果中排名第四(#A3乳酸菌),英文排名第二(#B1 乳酸菌lactic acid bacteria)?！笆人崛闂U菌(lactobacillusacidophilus)”的頻次達(dá)到154次,是最常使用的微膠囊化對象之一,其他如干酪乳桿菌和格氏乳桿菌等都是典型的乳酸菌,這是因?yàn)槿橹破?牛奶、奶酪等)往往是最受消費(fèi)者歡迎的益生菌產(chǎn)品形式[17]。乳酸菌還作為功能發(fā)酵劑賦予傳統(tǒng)食品營養(yǎng)與藥理價(jià)值,如韓國的泡菜、愛爾蘭的切達(dá)干酪、泰式辣醬等。與傳統(tǒng)發(fā)酵相比,微膠囊乳酸菌的發(fā)酵速度更快、細(xì)胞密度更高、使用周期長,還可以去除有毒的疏水物質(zhì)[18]。除乳酸菌外,酵母菌等其他益生菌的封裝策略亦有報(bào)道[2,19]。

2.4.2 壁材

壁材是影響益生菌微膠囊加工、儲存與消化穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。中文文獻(xiàn)中以殼聚糖(#A6 殼聚糖)為代表的多糖在過去20年中是研究關(guān)注最多的壁材。殼聚糖是一種線性多糖,通過來源豐富的幾丁質(zhì)脫乙酰化制得,與纖維素和幾丁質(zhì)具有類似的化學(xué)結(jié)構(gòu),但作為包埋材料,一般不單獨(dú)使用。例如,KIM等[20]研究了殼聚糖-植酸、殼聚糖-植酸-淀粉以及殼聚糖-植酸-CaCO33種壁材對嗜酸乳桿菌的保護(hù)作用,殼聚糖-植酸-CaCO3膠囊的負(fù)載容量最小但是抗酸能力最強(qiáng),掃描電鏡顯示其微觀結(jié)構(gòu)最為致密。而殼聚糖-植酸-淀粉膠囊的外層起皺,呈現(xiàn)半透明狀,儲存穩(wěn)定性較好。此外,殼聚糖還能夠與羧甲基魔芋葡甘露聚糖作為羅伊氏乳桿菌保護(hù)劑,并形成穩(wěn)定的W/O/W雙乳液[21]。雙乳化益生菌的活性一定程度提高,但在腸胃道中不太穩(wěn)定,可能導(dǎo)致突然釋放,控釋效果較差。同時(shí),海藻酸鹽的濃度可以通過調(diào)節(jié)其與羧甲基魔芋葡甘露聚糖-殼聚糖之間的氫鍵影響水凝膠的溶脹行為,對釋放調(diào)節(jié)起到一定效果。

藻酸鹽也屬于傳統(tǒng)包埋材料,海藻酸鈉在中文文獻(xiàn)的主要關(guān)鍵詞頻次排名第4,“藻酸鹽(alginate)”在英文文獻(xiàn)中排名第8。藻酸鹽也常與其他材料復(fù)合使用,純藻酸鹽甚至可能對益生菌產(chǎn)生負(fù)面影響,且?guī)缀鯖]有任何抗氧化活性。例如,在添加了一種果膠后,干酪乳桿菌對氧化損傷的抗性增強(qiáng),膠囊表面的裂隙減少,持水能力增強(qiáng),鈣離子誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞活力損失減少[22]。董陽等[23]評估了內(nèi)源乳化法封裝乳酸菌的效果,發(fā)現(xiàn)當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%,CaCO3和海藻酸鈉質(zhì)量比為1.5∶9,水油質(zhì)量比為30∶120時(shí),包埋率最高可達(dá)86.3%。該研究進(jìn)一步比較了只使用海藻酸鈉與海藻酸鈉-殼聚糖聯(lián)用時(shí)的益生菌穩(wěn)定性,復(fù)合膠囊的耐胃腸液的效果更好,但是釋放速度較慢。此外,海藻酸鈉對乳桿菌生產(chǎn)的乙醛脫氫酶同樣具有突出保護(hù)效果,未經(jīng)包埋的2種菌體中的乙醛脫氫酶在體外消化進(jìn)行到30 min時(shí)就已完全失活,經(jīng)過脫脂乳和海藻酸鈉包埋后,消化180 min后酶活力保持率高達(dá)73.4%[24]。

其他多糖如果膠、麥芽糖糊精、黃原膠、明膠、k-角叉菜膠等均具備形成三維網(wǎng)絡(luò)的能力[25]。明膠、黃原膠、卡拉膠等已經(jīng)是成熟的工業(yè)原料,獲取途徑豐富,成本低廉?？剐缘矸鄣目姑附庑再|(zhì)優(yōu)越,其本身含有多羥基基團(tuán),適合構(gòu)建涂層材料。但抗性淀粉也會(huì)在一定程度上阻礙益生菌在腸道的釋放與定殖,主要用于設(shè)計(jì)緩釋體系[26-27]?？剐院司哂蟹庋b能力,其本身就是一種益生元,有助于誘導(dǎo)形成對人體健康有利的腸道微生物群落[28]。研究報(bào)道,糊精通過抑制幾種糞便酶(如β-葡萄糖醛酸酶和α-葡萄糖苷酶)活性,可有效降低結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)[26]。隨著機(jī)械強(qiáng)度的提高,模擬胃液的擴(kuò)散受到限制,益生菌細(xì)胞膜完整性提高。但是膽汁鹽的擴(kuò)散程度很難被這種結(jié)構(gòu)較簡單的微膠囊抑制,無論封裝與否,處理過后的益生菌細(xì)胞膜完整性均在4%以下。這說明膽汁鹽造成的細(xì)胞損傷往往比酸脅迫更嚴(yán)重,需要尋找并發(fā)展新的壁材。

2.4.3 微膠囊技術(shù)

微膠囊技術(shù)借助具有一定生物相容性的材料,通過構(gòu)造物理屏障顯著提升益生菌對環(huán)境脅迫的抵抗能力。中文文獻(xiàn)中的相關(guān)關(guān)鍵詞是固定化 (#A4 固定化)與工藝優(yōu)化(#A7工藝優(yōu)化),說明微膠囊技術(shù)是重要的研究內(nèi)容,但這兩個(gè)簇標(biāo)簽沒有提供更多的信息。由圖3-b中聚類結(jié)果可知,噴霧干燥(#B3 噴霧干燥)的影響力很強(qiáng),它與凝聚技術(shù)的成本是最低廉的。噴霧干燥技術(shù)首先霧化物料,然后通過短時(shí)間脫水達(dá)到干燥的目的。噴霧干燥得到的微膠囊粒度很小,質(zhì)地相對均勻,但是高溫氣流會(huì)造成益生菌活力損失,對壁材的要求比較嚴(yán)苛[17]。冷凍干燥的封裝效率和細(xì)胞存活率通常高于噴霧干燥,但是生產(chǎn)效率較低且成本昂貴[29]。值得一提的是,新開發(fā)的噴霧冷凍干燥技術(shù)是將霧滴與-70 ℃的逆流氣體瞬間接觸,能最大程度保留益生菌活性。無論是與傳統(tǒng)的噴霧干燥還是冷凍干燥相比,噴霧冷凍干燥后益生菌活力都要更高[30-31]。但是,在噴霧干燥時(shí),有機(jī)酸會(huì)增強(qiáng)粉末的黏性從而降低干燥效率,需要盡可能去除[32]。果汁中的酚酸和內(nèi)酯也會(huì)造成益生菌活力喪失,蔓越莓汁對乳桿菌和雙歧桿菌的傷害要大于橙汁與菠蘿汁[33]。

a-CNKI數(shù)據(jù)庫關(guān)鍵詞時(shí)間線圖;b-WOS數(shù)據(jù)庫關(guān)鍵詞熱力圖圖3 CNKI數(shù)據(jù)庫關(guān)鍵詞時(shí)間線圖與WOS數(shù)據(jù)庫關(guān)鍵詞熱力圖Fig.3 Keyword timeline diagram of CNKI database and keyword heat map of WOS database

其他微膠囊化技術(shù)包括離心擠壓、靜電紡絲/電噴霧、沖擊氣溶膠、流化床包衣等,早期較多配合保護(hù)劑使用冷凍干燥技術(shù)[16]。冷凍干燥利用了升華,分為冷凍、初級干燥和二級干燥3個(gè)階段,但是自由水可能會(huì)形成損害細(xì)胞的冰晶[34]。靜電紡絲與電噴霧主要區(qū)別是溶液黏度,靜電紡絲的聚合物溶液黏度較高,在封裝藥物和各類營養(yǎng)活性物質(zhì)上已有進(jìn)展。MA等[35]利用靜電紡絲技術(shù)將4種乳桿菌包裹在阿拉伯樹膠-支鏈淀粉形成的納米纖維中,并借助普魯蘭多糖提供可紡性,益生菌存活率顯著高于冷凍干燥。借助掃描電子顯微鏡分析,發(fā)現(xiàn)隨著阿拉伯樹膠比例的提高,納米纖維的直徑不斷減小,但是超過60%后可能出現(xiàn)紡錘狀的缺陷。噴霧氣溶膠技術(shù)的優(yōu)勢在于生產(chǎn)的膠囊直徑較小,平均尺寸為30～50 μm[36]。

2.4.4 存活率與理化性質(zhì)

存活率(#A5存活率)的評估貫穿整個(gè)生產(chǎn)-加工-消費(fèi)過程,是膠囊化效果最重要的指標(biāo)之一。簡單的微膠囊益生菌活性評估只需將膠囊分散在蛋白胨溶液中,均質(zhì)化后進(jìn)行平板涂布,培養(yǎng)一段時(shí)間進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)[37]。這種評價(jià)方式簡單快速,可以作為商業(yè)化用途,但是準(zhǔn)確性有待商榷。根據(jù)SUN等[38]的研究,使用聚多巴胺封裝的細(xì)菌生長曲線表現(xiàn)出滯后性,這可能導(dǎo)致計(jì)算得到的活菌濃度較實(shí)際值偏低。用高速離心機(jī)破碎膠囊壁后涂布則可能導(dǎo)致部分益生菌受到機(jī)械破壞而失去活性,同樣可能導(dǎo)致測定結(jié)果偏低。因此,存活率的評估方式應(yīng)當(dāng)是效率、成本以及應(yīng)用場景等因素的折衷。其他理化性質(zhì)的測定可以指導(dǎo)益生菌微膠囊產(chǎn)品的生產(chǎn)過程。環(huán)境抗性用抗熱性、抗酸性以及抗機(jī)械剪切等參數(shù)體現(xiàn),包封的完整程度可以使用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)或激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope,CLSM)表征,靜態(tài)光散射分析和粒度分析用來測定顆粒大小。對于添加在乳制品中的益生菌微膠囊,乳化行為與微觀流變學(xué)測試也是必要的,可能還需要額外的巴氏消毒穩(wěn)定性與絮凝聚結(jié)度評估[39]。

2.4.5 模擬消化

益生菌的脆弱性大大降低了它們在胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的活性。英文文獻(xiàn)的關(guān)鍵簇#B4 模擬胃腸狀況(simulated gastrointestinal condition)和#B7健康狀態(tài)(health status)都說明了需要體外或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對控釋能力與益生效果進(jìn)行檢驗(yàn),但是在中文文獻(xiàn)中相關(guān)研究較少,未能出現(xiàn)相關(guān)簇。封裝完成的微膠囊,針對性構(gòu)建人體腸胃道(gastrointestinal tract,GIT)模型探究保護(hù)效果與釋放速率,對于不必要的消化液可以適當(dāng)簡化。除了體外腸胃消化外,還可以使用志愿者的糞便補(bǔ)充結(jié)腸發(fā)酵實(shí)驗(yàn),體外發(fā)酵用于確定包封的益生菌是否更易形成優(yōu)勢種[40]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)多采用小鼠作為模型,相較體外實(shí)驗(yàn)更具說服力。如果該材料對小鼠健康有害,可能出現(xiàn)體重減輕、疾病活動(dòng)指數(shù)增加、結(jié)腸長度縮短與糞便異常。益生菌在腸道中的靶向作用與駐留能力比較能借助光聲成像實(shí)現(xiàn),腸道組織切片或腸道外翻實(shí)驗(yàn)分析黏膜、絨毛完整性以及是否出現(xiàn)病變[41]。最后,依據(jù)生化和血液學(xué)進(jìn)行系統(tǒng)的毒理學(xué)評價(jià)是特定材料-菌種應(yīng)用到食品生產(chǎn)中的必需環(huán)節(jié)。

2.5 關(guān)鍵詞演化

圖3-a顯示,多孔淀粉、變性淀粉與乳清蛋白等材料在2010年左右開始應(yīng)用,而豌豆蛋白、大豆蛋白、海洋寡糖和丁香精油等出現(xiàn)較晚?！叭斯の敢骸?、“模擬胃液”、“膽汁酸鹽”等消化模擬材料幾乎貫穿了整個(gè)時(shí)間軸,突出體外消化實(shí)驗(yàn)的重要性。“斷奶仔豬”首次出現(xiàn)在2009年左右,說明益生菌微膠囊有助于改善動(dòng)物飼料品質(zhì)[42]。微膠囊化益生菌在“凝膠糖果”、“爆爆珠”、“高鹽干酪”等食品中的添加集中在2015年之后,“合生元”首次出現(xiàn)在2023年,符合國際研究趨勢[43]。圖3-b為WOS數(shù)據(jù)庫中的學(xué)術(shù)產(chǎn)出增長情況,可以看出“雙歧桿菌(bifidobacteria)”和“存活率(survival)”在過去20年內(nèi)一直是相關(guān)研究的重要內(nèi)容?！霸逅猁}(alginate)”近2年熱度開始消退,“果膠(pectin)”“菊粉(inulin)”和“殼聚糖(chitosan)”在2016～2017年得到的關(guān)注度最高,說明研究者在持續(xù)探索新型材料與組合。“儲存(storage)”的研究逐年遞增,或?qū)⒊蔀槲磥硌芯繜狳c(diǎn)?！皣婌F干燥(spray drying)”的熱度在2020—2021年完成了對“冷凍干燥(freeze-drying)”的超越,并持續(xù)增長。2023年的數(shù)據(jù)不完整,因此不具備參考意義。

3 展望與熱點(diǎn)預(yù)測

本研究全面分析了益生菌微膠囊化領(lǐng)域內(nèi)的研究現(xiàn)狀、研究方向與熱點(diǎn),同時(shí)也應(yīng)當(dāng)說明一些局限性,因?yàn)镃iteSpace、VOSviewer、bibliometrix等軟件只能進(jìn)行單語言分析,本文只建立了中英文文獻(xiàn)池,沒有收錄其他語言撰寫的高質(zhì)量論文,可能導(dǎo)致研究結(jié)論存在輕微的偏差。為了更清晰地展示最新突現(xiàn)的研究內(nèi)容、緊抓研究熱點(diǎn),本文整理了代表益生菌微膠囊化研究領(lǐng)域新興趨勢的15個(gè)關(guān)鍵詞(表4),結(jié)合上文的可視化分析,提出對益生菌微膠囊化未來研究的建議與展望。

表4 代表益生菌微膠囊化研究領(lǐng)域新興趨勢的15個(gè)關(guān)鍵詞Table 4 Top 15 keywords representing emerging trends in probiotic microencapsulation research

眾多研究證明了益生菌對人體健康的益處,包括調(diào)節(jié)腸道菌群組成、修復(fù)上皮組織、增強(qiáng)免疫力、治療炎癥性腸病、降低膽固醇和血脂,甚至抑制腫瘤和癌癥[45]。如何選擇合理的益生菌-壁材組合一直是益生菌微膠囊化領(lǐng)域的重要議題,根據(jù)圖3-b,植物乳桿菌、嗜酸乳酸桿菌、鼠李糖乳桿菌等是過去使用最多的菌種。而嗜黏蛋白阿克曼氏菌(A.muciniphila, 強(qiáng)度3.05)、大腸桿菌(E.coli, 強(qiáng)度1.99)和枯草芽孢桿菌(B.subtili, 強(qiáng)度2.12)在2020—2021年間獲得大量關(guān)注并持續(xù)至今(表4)。盡管大部分大腸桿菌都是有害菌,但其中的大腸桿菌Nissle1917(EcN)是熱度最高的益生菌之一,在臨床上治療炎癥性胃腸功能障礙,同時(shí)具有腫瘤靶向作用[46]。將枯草芽孢桿菌和乳酸菌共培養(yǎng)或者封裝,枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的過氧化氫酶、枯草桿菌蛋白酶和ε-聚谷氨酸可以促進(jìn)乳酸菌的生長活力,提高冷凍干燥過程中的存活率[47]。

我國法規(guī)規(guī)定不提倡以液態(tài)形式生產(chǎn)益生菌類保健食品活菌產(chǎn)品。因此,益生菌的微膠囊制備是益生菌加工產(chǎn)業(yè)的核心,而壁材的更新有助于更高效的產(chǎn)品生產(chǎn)與儲存、更優(yōu)越的消化穩(wěn)定性質(zhì)以及更強(qiáng)的腸道定殖能力。早期的封裝材料多為藻酸鹽、殼聚糖、淀粉、蛋白質(zhì)等,以乳清蛋白、大豆分離蛋白為代表的蛋白質(zhì)常用于與多糖形成多尺度復(fù)合物(圖4)。隨著新材料的開發(fā),菊粉(inulin, 強(qiáng)度3.49)的參與度提高。關(guān)鍵詞中近年出現(xiàn)的酚類化合物(phenolic compound, 強(qiáng)度5.44)和多酚(polyphenol, 強(qiáng)度2.05)強(qiáng)度最高,是實(shí)現(xiàn)納米封裝的優(yōu)越材料,可以為細(xì)胞提供前所未有的特性,抵抗高溫與紫外線的傷害,生物相容性比殼聚糖更好[19,48]。利用這項(xiàng)技術(shù)制作的人工孢子能有效延長益生菌儲存壽命,在生產(chǎn)加工與運(yùn)輸時(shí),誘導(dǎo)產(chǎn)生的生物防御機(jī)制使其在壓力環(huán)境中處于休眠狀態(tài)。而當(dāng)環(huán)境變得溫和之后,細(xì)胞活力又會(huì)重新恢復(fù)。多酚材料的生物相容性好,可以直接與細(xì)胞接觸,通常有2種形成機(jī)制(圖4,改編自文獻(xiàn)[49])。一種是鄰苯二酚在氫鍵、疏水作用力等的作用下自發(fā)聚合形成薄膜,另一種則需要鄰苯三酚通過三價(jià)金屬離子配位聚合。多酚封裝的菌體往往更加穩(wěn)定,如茶多酚涂層會(huì)使天然酵母在指數(shù)增長之前表現(xiàn)約4 h的延滯期[19]。鑒于生物聚合物網(wǎng)絡(luò)的孔徑一般較大,氫離子與少部分消化酶仍能通過自由擴(kuò)散通過壁材。采用逐層策略(layer-by-layer, LbL)包封的益生菌抵抗酸性環(huán)境與膽汁鹽的能力更強(qiáng),通過口服強(qiáng)飼法和生物發(fā)光實(shí)驗(yàn)可以定位腸道內(nèi)的益生菌,進(jìn)一步調(diào)整壁材組成與結(jié)構(gòu)還可實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)釋放[2]。此外,酶作為一種具有高度催化效能的生物大分子,參與制備的微膠囊更具可設(shè)計(jì)性。人工酶武裝的雙歧桿菌能夠緩解腸道炎癥,保護(hù)結(jié)腸上皮細(xì)胞免受病理損傷并降低促炎因子與活性氧水平。在腸炎小鼠體內(nèi),香農(nóng)熵減少,表明生物多樣性減少。厚壁菌門的相對豐度增加,它們與炎癥狀態(tài)呈負(fù)相關(guān),說明微生物群失調(diào)得到改善[41]。

圖4 兩種不同的多酚網(wǎng)絡(luò)形成機(jī)制[49]Fig.4 Two different mechanisms of polyphenol network formation

除壁材外,微膠囊造粒的微觀尺度也是重要的考量因素,盡可能實(shí)現(xiàn)納米級封裝或單細(xì)胞封裝會(huì)顯著提升微膠囊的功能性質(zhì)。早期凝膠珠的粒度在微米級或者毫米級,通過二價(jià)陽離子溶液在水凝膠中的簡單注射制備得到。而益生菌的直徑一般為0.5～5 μm,每個(gè)單元內(nèi)包含大量益生菌,效果不佳。現(xiàn)多采用的納米膠囊化手段又可以分為納米纖維、納米顆粒(nanoparticle, 強(qiáng)度3.64)與納米乳液,前者固定化效果較好,適應(yīng)電流體動(dòng)力學(xué)加工技術(shù)[50]。蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的另一個(gè)重要特性就是可以發(fā)生乳化,與其他材料復(fù)配后可以采用微流控乳化技術(shù),包封率高,膠囊尺寸更小,脂質(zhì)還具有阻斷H+的潛力[51-52]。SILVA等[53]將植物脂肪作為壁材,在9%的NaCl溶液或25%(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))的蔗糖溶液中有效地保護(hù)益生菌,擴(kuò)展在糖基食品和高鹽食品中的應(yīng)用場景。將益生菌與茶蛋白-黃原膠皮克林乳液混合之后再進(jìn)行3D打印,打印前后細(xì)胞活力幾乎不受影響,為益生菌產(chǎn)品的生產(chǎn)提供了新思路[54]。在封裝策略上,溫度(temperature, 強(qiáng)度2.27)逐漸成為重要的考量因素。此外,還要盡可能形成單包封結(jié)構(gòu),通過增加表面積/面積比提高生物利用度和腸道黏附能力[5]。

傳統(tǒng)的微膠囊化技術(shù)通常不會(huì)形成多層結(jié)構(gòu),無法應(yīng)對消化道復(fù)雜的物理化學(xué)環(huán)境或提供良好的腸道黏附能力,終產(chǎn)品可能在同類產(chǎn)品中競爭力不強(qiáng)。逐層組裝技術(shù)可設(shè)計(jì)的空間大,厚度可以控制在納米級,需要保留材料上的表面電荷,在反復(fù)交替沉積帶有相反電荷的聚電解質(zhì)形成功能薄膜,可以實(shí)現(xiàn)控制釋放(controlled release, 強(qiáng)度2.61)和定點(diǎn)遞送(targeted delivery, 強(qiáng)度2.82)[55]。將殼聚糖作為陽離子聚合物與不同分子質(zhì)量的普朗尼克(聚丙二醇與環(huán)氧乙烷的加聚物)合成聚電解質(zhì)逐層包裝德氏乳桿菌,膠囊足以保護(hù)益生菌免受腸道疾病的影響,噬菌體、細(xì)菌素或潛在的有害酶被阻斷,但單糖、雙糖、氨基酸與小分子肽滲透性良好,表明包被益生菌在釋放之前的正常生理活動(dòng)仍能維持[3]。MOKHTARI等[56]同樣采用逐層封裝策略,在兩層藻酸鹽層中夾入一層釀酒酵母細(xì)胞壁,彌補(bǔ)了藻酸鹽抗酸差的缺點(diǎn)。盡管這種封裝方式對嗜酸乳桿菌是高效的,但由于雙歧桿菌對低pH環(huán)境抵抗力很差,無論是藻酸鹽層還是酵母細(xì)胞壁都沒有展現(xiàn)明顯的保護(hù)作用?？赡苄枰l(fā)展具有生物活性的膠囊,抑制H+的自由擴(kuò)散。

4 結(jié)論

腸道菌群的重要性被持續(xù)揭示,如何保護(hù)益生菌到達(dá)腸道并順利定殖引發(fā)廣泛關(guān)注。本文利用多款文獻(xiàn)計(jì)量軟件繪制了過去20年內(nèi)益生菌微膠囊化領(lǐng)域內(nèi)的科學(xué)知識圖譜,為把控?zé)狳c(diǎn)研究趨勢提供重要參考。從關(guān)鍵詞的分析結(jié)果看,微膠囊壁材正在逐步從藻酸鹽、殼多糖等向其他材料轉(zhuǎn)移,噴霧干燥技術(shù)也得到更多關(guān)注。本文還重點(diǎn)綜述了最受關(guān)注的菌種、封裝材料與技術(shù)以及封裝效果的評價(jià)方式,并提出新的見解與研究展望。隨著研究不斷深入,益生菌微膠囊化技術(shù)還將與新興技術(shù)結(jié)合,如CRISPR/Cas9等基因編輯技術(shù)用來控制益生菌細(xì)胞膜的特異性表達(dá),與3D打印技術(shù)的聯(lián)合要求微膠囊混入水凝膠后具有良好的流變學(xué)表現(xiàn)。綜上所述,預(yù)測未來研究會(huì)主要集中在兩個(gè)大類:一是新型微膠囊壁材的開發(fā)與理化性質(zhì)分析;二是創(chuàng)新微膠囊化技術(shù)與體內(nèi)體外評價(jià)體系。益生菌微膠囊化技術(shù)已儼然成為益生菌研究的一大熱點(diǎn),將持續(xù)助力大健康產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展。

體系最上層為細(xì)胞生長所必須的DMEM 培養(yǎng)基,而后是附著有細(xì)胞的蓋玻片,最下層為含有乳桿菌的MRS 瓊脂培養(yǎng)基,粘液層位于MRS 培養(yǎng)基與蓋玻片中間。

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

(A)、混菌添加量(B)、食鹽添加量(C)、發(fā)酵時(shí)間(D)的較優(yōu)水平,以模糊綜合感官評分為響應(yīng)值進(jìn)行Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果如附表1所示。

利用軟件Design-Expert8.0.6 得到二次多項(xiàng)回歸方程為:

Y=8.31+0.22A+0.56B+0.098C-2×10-3D-0.22AB+0.058AC+0.051AD-0.21BC-0.032BD -0.058CD-0.35A2-0.52B2-0.37C2-0.32D2

如附表2所示,回歸模型效果顯著(P<0.01),失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05),并且該模型能解釋96.7%(R2=0.9670)響應(yīng)值的變化。該模型校正系數(shù)(RAdj2=0.9341)接近于1,線性相關(guān)程度密切。這些參數(shù)表明此回歸模型效果較好。從附表2還可知XZ3與Y50的添加比例(A)、混菌添加量(B)、AB、A2、B2、C2、D2對模糊綜合感官評分影響極顯著(P<0.01),且各因素對鲊?yán)苯犯泄僭u分影響作用的大小順序?yàn)榛炀砑恿?B)>XZ3∶Y50(A)>食鹽添加量(C)>發(fā)酵時(shí)間(D),說明混菌添加量和XZ3與Y50的比例對鲊?yán)苯钒l(fā)酵品質(zhì)影響較大。

各因素交互項(xiàng)的響應(yīng)面及等高線,如附圖1 所示。曲面圖越陡表示交互作用越強(qiáng),反之,則交互作用越弱?？梢奨Z3 與Y50 的比例(A)和混菌添加量(B)之間的交互作用強(qiáng)于其他因素的交互作用。