在明串珠菌構(gòu)建高產(chǎn)甘露醇的細(xì)胞工廠

劉成川,金紅星

(河北工業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院,天津,300401)

甘露醇是具有多種功效的一種六糖醇,被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工和電子等行業(yè)[1-2]。目前主要有4種方法生產(chǎn)甘露醇:海藻提取法產(chǎn)生大量廢水、能耗高、污染嚴(yán)重;催化加氫法需在高溫高壓、貴金屬催化和通氫氣條件下進(jìn)行且產(chǎn)物分離困難[3];酶轉(zhuǎn)化法需要昂貴的輔酶,天津工業(yè)生物技術(shù)研究所構(gòu)建了一鍋化學(xué)計量合成法,但甘露醇產(chǎn)量只有9.6 g/L[4];微生物發(fā)酵法產(chǎn)甘露醇具有綠色清潔的特點(diǎn),滿足了產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級的迫切需要。產(chǎn)甘露醇的細(xì)菌、酵母和霉菌中,進(jìn)行異型乳酸發(fā)酵的細(xì)菌效果較好[5],其中明串珠菌、酒球菌和乳桿菌等[6]可將果糖底物轉(zhuǎn)化為甘露醇。近幾年本課題組[7-12]也嘗試了基因敲除、基因過表達(dá)等手段改造菌株,轉(zhuǎn)化率雖然較高,但甘露醇產(chǎn)量還未達(dá)到合成生物學(xué)“定量”投資邏輯學(xué)[13]和大宗化學(xué)品的高轉(zhuǎn)化率、高產(chǎn)物濃度[14]的標(biāo)準(zhǔn)。另外,江南大學(xué)篩選獲得了較優(yōu)性能的甘露醇脫氫酶LpMDH編碼基因和葡萄糖脫氫酶BaGDH編碼基因并在大腸桿菌中共表達(dá),以D-果糖為底物發(fā)酵24 h獲得D-甘露醇的最高產(chǎn)量為81.9 g/L[15];HANKO等[16]利用鉤蟲貪銅菌經(jīng)還原型戊糖磷酸循環(huán)途徑自養(yǎng)生產(chǎn)了甘露醇,但產(chǎn)量只有3.9 g/L。

本研究提出了將底盤細(xì)胞轉(zhuǎn)化為高產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物菌株的理論:細(xì)胞工廠的“源-庫”學(xué)說,以便指導(dǎo)細(xì)胞工廠的遺傳育種工作。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)CCTCC M2018815[Δdts1ΔldhΔpat::mdhΔstpk::mdhΔfk::mdhΔaldh::(mtld-mlp)]、CGMCC1.10327、CCTCC M2020762[CCTCC M2018815 0385/0386::ldhA-eeΔadh::mepΔldh(0503)::mepΔldh(0373)::mep]、大腸桿菌(E.coli)DH5α、質(zhì)粒pUC19均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

高保真的DNA聚合酶、T4DNA連接酶,謙泰生物技術(shù)有限公司;PCR純化試劑盒,Axygen公司;限制性內(nèi)切酶、氨芐青霉素,大連寶生物工程有限公司;引物、FDH基因編碼序列,金唯智生物科技有限公司(表1)。

表1 本研究中使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.1.3 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

E.coli用LB培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)溫度37 ℃;L.mesenteroides用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)溫度30 ℃。

1.1.4 儀器

Eppendorf Mastercycler?nexus PCR儀,Eppendorf;Bio-Rad Gene Pluser XcellTM電轉(zhuǎn)化儀,Bio-Rad;Agilent LC-20AD CTO-20A高效液相色譜儀,Agilent。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因表達(dá)盒的構(gòu)建

(1)FDH基因表達(dá)盒:根據(jù)GenBank中登錄號為AJ011046的博伊丁假絲酵母(Candidaboidinii)的fdh(NAD+依賴型甲酸脫氫酶即EC 1.2.1.2)編碼序列,按照明串珠菌染色體的密碼子偏好性優(yōu)化了核苷酸序列,并委托公司人工合成DNA序列。以L.mesenteroidesCGMCC1.10327染色體DNA為模板,利用一對引物ldhA1/ldhA2 PCR擴(kuò)增D-ldhA基因的表達(dá)元件;利用一對引物FDH1/FDH2 PCR擴(kuò)增FDH編碼序列;通過重疊延伸PCR將D-ldhA基因表達(dá)元件和FDH編碼序列連接成為FDH基因表達(dá)盒。

(2)0386基因表達(dá)盒:以L.mesenteroidesCGMCC1.10327染色體DNA為模板,利用2對引物ldhA-ee1/ldhA-ee2、0386-1/0386-2,通過重疊延伸PCR將表達(dá)元件序列和0386編碼序列連接成為0386基因(部分序列)的表達(dá)盒。

1.2.2 同源重組載體的構(gòu)建

(1)用于打斷0385-0386操縱子和重疊基因模式的同源重組載體:利用2對引物0385-0386-l1/0385-0386-l2、0385-0386-r1/0385-0386-r2,通過重疊延伸PCR獲得的產(chǎn)物后將其插入到pUC19的EcoRI和XbaI位點(diǎn)上,成為中間帶有KpnI識別序列的0385-0386基因的同源重組載體。以L.mesenteroidesCGMCC1.10327染色體DNA為模板,利用2對引物0385-1/0385-2、ldhA-ee-0386-1/ldhA-ee-0386-2,進(jìn)行重疊延伸PCR,其產(chǎn)物為0385(以終止密碼子結(jié)束的終止密碼子一側(cè)的部分序列)-ldhA-ee-A-0386(以起始密碼子開始的起始密碼子一側(cè)部分序列)序列,即中間帶有表達(dá)元件序列(ldhA-ee)-A的0385-0386基因同源重組載體。

(2)用于在染色體上定點(diǎn)插入mep序列(甘露醇外排泵蛋白)的同源重組載體:分別利用2對引物(0373-l1/0373-l2、0373-r/0373-r2)(0503-l1/0503-l2、0503-r1/0503-r2)(adhl1/adhl2、adhr1/adhr2),通過重疊延伸PCR后將其獲得的產(chǎn)物插入到pUC19的EcoRI和XbaI(乙醇脫氫酶基因同源重組載體為SalI)位點(diǎn)上,分別成為中間帶有KpnI識別序列的0373(乳酸脫氫酶)、0503(乳酸脫氫酶)和乙醇脫氫酶基因的同源重組載體。

(3)用于NADH再生的同源重組載體:利用2對引物2043-l1/2043-l2、2043-r1/2043-r2,通過重疊延伸PCR后將其獲得的產(chǎn)物插入到pUC19的EcoRI和HindIII位點(diǎn)上,成為中間帶有XbaI識別序列的2043(乳酸脫氫酶)基因的同源重組載體。

以pCW7[17]為模板,利用一對引物amy1/amy2(amy01/amy02)通過PCR獲得的產(chǎn)物后將其插入到同源重組載體KpnI(XbaI)位點(diǎn)上,成為中間帶有α-淀粉酶基因標(biāo)記的同源重組載體。分別以mep序列和FDH表達(dá)盒序列為模板,分別利用一對引物mep1/mep2(FDH01/FDH02)通過PCR獲得的產(chǎn)物后將其插入到同源重組載體的KpnI(XbaI)位點(diǎn)上,分別成為中間帶有mep序列和FDH表達(dá)盒的同源重組載體。

1.2.3 突變菌株的構(gòu)建和驗(yàn)證

參照文獻(xiàn)[18]的方法進(jìn)行明串珠菌的電擊轉(zhuǎn)化。通過2次同源重組獲得相關(guān)序列定點(diǎn)插入到染色體的突變菌株。第一次同源重組:用中間帶有α-淀粉酶基因標(biāo)記的同源重組載體轉(zhuǎn)化初始菌株,在平板上獲得藍(lán)色的目的菌株,即靶基因失活、帶有標(biāo)記基因的菌株。第二次同源重組:用中間帶有表達(dá)元件序列-A的0385-0386基因同源重組載體或中間帶有mep序列或FDH表達(dá)盒的同源重組載體轉(zhuǎn)化第一次同源重組獲得的目的菌株,在平板上獲得白色的目的菌株,即靶基因失活、定點(diǎn)插入相關(guān)序列的菌株。

以染色體DNA為模板,利用一對引物進(jìn)行PCR,經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳條帶的大小來驗(yàn)證定點(diǎn)插入位點(diǎn)失活、插入位點(diǎn)帶有標(biāo)記基因和插入位點(diǎn)帶有相關(guān)序列的菌株。

1.2.4 熒光定量PCR驗(yàn)證

以原始菌株與突變菌株RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板,以Test-F/R為引物,進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證。以16S rRNA為管家基因,用相對定量2-ΔΔCT法計算0386基因(或FDH基因)在突變菌株與原始菌株之間的相對表達(dá)水平,重復(fù)3次。

1.2.5 發(fā)酵產(chǎn)甘露醇和液相檢測

野生型菌株和突變菌株用發(fā)酵培養(yǎng)基[18]進(jìn)行搖瓶發(fā)酵20 h,用HPLC測定甘露醇含量,參照文獻(xiàn)[9]。敲入FDH表達(dá)盒菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基中,添加15 g/L的甲酸鈉。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因表達(dá)盒的構(gòu)建

第1輪PCR擴(kuò)增得到了預(yù)期長度為1 111 bp的FDH編碼序列(圖1-a)和193 bp的D-ldh基因表達(dá)元件(圖1-b)。第2輪PCR通過2個第1輪PCR產(chǎn)物末端的反向互補(bǔ)序列相互退火結(jié)合,構(gòu)建成D-ldh基因表達(dá)元件和FDH編碼序列連接在一起的DNA融合體。但是此時該融合體的量比較少,經(jīng)過第3輪PCR特異性地擴(kuò)增,成功得到了預(yù)期為1 296 bp的FDH基因表達(dá)盒(圖1-c)。

a-FDH編碼序列;b-D-ldh基因表達(dá)元件;c-FDH基因表達(dá)盒;d-D-ldh基因表達(dá)元件和0386部分編碼序列;e-0386基因表達(dá)盒+起始密碼子一側(cè)的部分編碼序列圖1 合成基因表達(dá)盒的重疊延伸PCRFig.1 Overlapping extension PCR for the synthesis of gene expression cassette注:1-MarkerII;2-FDH編碼序列;3-MarkerII;4-D-ldh基因表達(dá)元件;5-2K plus Marker;6-FDH表達(dá)盒;7-D-ldh基因表達(dá)元件;8-Marker;9-0386基因編碼序列(起始密碼子一側(cè)的部分);10-0386基因(部分序列)表達(dá)盒;11-Marker。

第1輪PCR擴(kuò)增得到了預(yù)期長度為180 bp的D-ldh基因表達(dá)元件和810 bp的0386部分編碼序列(圖1-d)。第2輪PCR利用2個第1輪PCR產(chǎn)物末端的反向互補(bǔ)序列相互退火結(jié)合,并通過8輪循環(huán)使2個DNA片段重疊延伸,經(jīng)過第3輪PCR特異性地擴(kuò)增,成功得到了預(yù)期為970 bp的0386基因表達(dá)盒+起始密碼子一側(cè)的部分編碼序列(圖1-e)。

2.2 同源重組載體的構(gòu)建

構(gòu)建好的同源重組載體經(jīng)酶切驗(yàn)證,其瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2～圖6,可知定點(diǎn)插入位點(diǎn)序列的同源重組載體、攜帶α-淀粉酶基因標(biāo)記的同源重組載體和攜帶欲敲入序列的同源重組載體都準(zhǔn)確無誤。

a-攜帶左右同源臂的同源重組載體;b-攜帶α-淀粉酶基因標(biāo)記的同源重組載體;c-攜帶欲敲入序列的同源重組載體圖2 用于打破0385-0386操縱子和重疊基因的同源重組載體Fig.2 Vector of homologous recombination for breaking 0385-0386 operon and overlapping gene注:2、3、6-Marker;1-同源重組載體經(jīng)EcoRI和XbaI酶切產(chǎn)生的載體和左右同源臂連接體;4-攜帶α-淀粉酶基因標(biāo)記的同源重組載體經(jīng)KpnI酶切產(chǎn)生的載體+左右同源臂連接體和α-淀粉酶基因表達(dá)盒;5-攜帶欲敲入序列的同源重組載體經(jīng)EcoRI和XbaI酶切產(chǎn) 生的載體和左右同源臂+表達(dá)元件序列-A連接體條帶。

2.3 敲入基因表達(dá)盒的驗(yàn)證

設(shè)定原始菌株的表達(dá)量為1,由RT-定量PCR結(jié)果可知,在突變菌株中,0386的相對表達(dá)量在打斷操縱子和重疊基因模式的菌株為1.081,敲入1個拷貝mep的菌株為1.450,敲入2個拷貝mep的菌株為2.972,敲入3個拷貝mep的菌株為5.882,證明了兩點(diǎn),一是打斷操縱子和重疊基因模式也提升基因表達(dá)量,二是mep基因表達(dá)量隨著0386拷貝數(shù)的增加而增加。

RT-定量PCR結(jié)果顯示,在突變菌株中FDH的相對表達(dá)量0.506,說明原始菌株染色體中沒有的FDH基因在突變菌株中異源表達(dá)成功。

2.4 基因的操縱子和重疊基因模式對產(chǎn)甘露醇的影響

在原核生物染色體中的很多基因以操縱子和/或重疊基因模式排列的,操縱子的相鄰結(jié)構(gòu)基因之間或重疊基因插入表達(dá)元件(啟動子和RBS)和相關(guān)核苷酸序列,可以改善基因表達(dá)效率。

具有兩個核苷酸結(jié)合域和兩個跨膜結(jié)構(gòu)域的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分為內(nèi)向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和外向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2種,其中大多數(shù)原核生物的ABC型外向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與胞內(nèi)“有毒物質(zhì)”的輸出相關(guān)。腸膜明串珠菌L.mesenteroidessubsp.mesenteroidesATCC8293的基因組中,注釋為ABC型多藥轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的LEUM_0385和LEUM_0386,經(jīng)生物信息學(xué)分析表明,構(gòu)成異源二聚體而發(fā)揮外排泵的作用。0385和0386以操縱子和重疊基因的方式存在于原始菌株的染色體中,即0385和0386共用同一個表達(dá)元件并依次排列著,而且0385和0386的編碼框共用同一個核苷酸(A),見圖7。乳糖操縱子中l(wèi)acY和lacA表達(dá)效率的遠(yuǎn)低于lacZ[19],以α-淀粉酶基因?yàn)楹Y選標(biāo)記、通過2次同源重組打破了基因的操縱子和重疊基因模式,即染色體0385和0386的核苷酸序列(0385的終止密碼子TAA和0386的起始序列tg aca)之間敲入了D-ldh基因的EE(表達(dá)元件Expression Element)-A(核苷酸),從而提高0386的表達(dá)量,進(jìn)而增加了甘露醇的產(chǎn)量(見圖8)。本研究將打破操縱子和重疊基因模式的0385-EE-A-0386稱為mep(甘露醇外排泵)。

圖7 0385-0386基因序列在明串珠菌染色體中的排列Fig.7 The arrangement of 0385-0386 gene sequence in Leuconostoc chromosome

圖8 明串珠菌發(fā)酵產(chǎn)甘露醇的產(chǎn)量Fig.8 Yield of mannitol produced by Leuconostoc fermentation1-原始野生菌株、底物-蔗糖為90 g/L;2～3-原始菌打破操縱子和重疊基因模式的菌株(2-蔗糖為90 g/L;3-蔗糖為110 g/L);4-CCTCC M2018815、蔗糖為90 g/L;5-CCTCC M2018815打破操縱子和重疊基因模式的菌株、蔗糖為90 g/L;6～7-原始菌adh位點(diǎn)敲入一個拷貝mep序列的菌株(6-蔗糖為90 g/L;7-蔗糖為110 g/L);8～9-原始菌aldh位點(diǎn)敲入一個拷貝AcrB序列的菌株(8-蔗糖為90 g/L;9-蔗糖為110 g/L);10-原始菌打破操縱子和重疊基因模式并乳酸脫氫酶0373位點(diǎn)敲入一個拷貝mep序列的菌株、蔗糖為110 g/L;11-原始菌aldh和dts(葡聚糖蔗糖酶)2個位點(diǎn)各敲入1個拷貝AcrB序列的菌株、蔗糖為110 g/L;12～13-原始菌打破操縱子和重疊基因模式并乳酸脫氫酶0373位點(diǎn)敲入一個拷貝mep序列的菌株(12-蔗糖為90 g/L;13-110 g/L);14～17-原始菌打破操縱子和重疊基因模式并乳酸脫氫酶0373和0503 2個位點(diǎn)各敲入一個拷貝mep序列的菌株(14-蔗糖為90 g/L;15-蔗糖為110 g/L;16-蔗糖為120 g/L;17-蔗糖為130 g/L);18～20-原始菌打破操縱子和重疊基因模式并乳酸脫氫酶0373、0503和adh 3個位點(diǎn)各敲入一個拷貝mep序列的菌株(18-蔗糖為120 g/L;19-蔗糖為130 g/L;20-蔗糖為135 g/L);21～22-CCTCC M2018815打破操縱子和重疊基因模式的菌株并乳酸脫氫酶0373位點(diǎn)敲入一個拷貝mep序列的(21-蔗糖為90 g/L;22-蔗糖為110 g/L);23～26-CCTCC M2018815打破操縱子和重疊基因模式并乳酸脫氫酶0373和0503兩個位點(diǎn)各敲入一個拷貝mep序列的菌株(23-蔗糖為90 g/L;24-蔗糖為110 g/L;25-蔗糖為120 g/L;26-蔗糖為130 g/L);27～29-CCTCC M2018815打破操縱子和重疊基因模式并乳酸脫氫酶0373、0503和adh 3個位點(diǎn)各敲入一個拷貝mep序列的菌株(27-蔗糖為120 g/L;28-蔗糖為130 g/L;29-蔗糖為135 g/L);30～35-CCTCC M2018815為出發(fā)菌(30-蔗糖為120 g/L;31-蔗糖為125 g/L;32-蔗糖為130 g/L;33-蔗糖為135 g/L;34-蔗糖為140 g/L;35-蔗糖為145 g/L);36～41-CCTCC M2020762為出發(fā)菌(36-蔗糖為120 g/L;37-蔗糖為125 g/L;38-蔗糖為130 g/L;39- 蔗糖為135 g/L;40-蔗糖為140 g/L;41-蔗糖為145 g/L)

2.5 甘露醇外排泵對產(chǎn)甘露醇的影響

由圖8可知,E.coli的AcrB敲入染色體中[20],在明串珠菌中異源表達(dá)時促進(jìn)甘露醇的外排而提高甘露醇產(chǎn)量的作用,不如明串珠菌本身的mep,故本研究利用mep克服了培養(yǎng)基中添加底物的限制,即沒有AcrB的異源表達(dá)或沒有mep的超表達(dá)時,培養(yǎng)基中至多加入90 g/L底物-蔗糖。

由圖8可知,以原始菌或?yàn)镃CTCC M2018815出發(fā)菌,在染色體上敲入mep序列,都大幅度地提高了菌株的甘露醇產(chǎn)量,構(gòu)建的較高產(chǎn)甘露醇的菌株-CCTCC M2020762,以120 g/L蔗糖為底物,達(dá)到甘露醇產(chǎn)量為71.58 g/L、轉(zhuǎn)化率為59.65%。因克服了培養(yǎng)基中添加底物的限制,底物-蔗糖推動著葡萄糖到甘露醇的轉(zhuǎn)化,從而使CCTCC M2020762比CCTCC M2018815不僅提高了甘露醇產(chǎn)量,還提升了轉(zhuǎn)化率(CCTCC M2018815為52.51%[9])。

2.6 NADH再生對產(chǎn)甘露醇的影響

用于NADH再生的酶編碼基因有甲酸脫氫酶[21-22]、亞磷酸脫氫酶[22-23]和葡萄糖脫氫酶[24],其中亞磷酸鹽價錢較昂貴而不適合應(yīng)用于甘露醇的發(fā)酵生產(chǎn)中,再生NADH時C6的葡萄糖用量為C1的甲酸6倍之多,故本研究采用甲酸脫氫酶基因。

由圖8可知,不管是以CCTCC M2018815為出發(fā)菌,還是以CCTCC M2020762為出發(fā)菌,NADH的再生使明串珠菌提高了甘露醇產(chǎn)量,最終構(gòu)建的高產(chǎn)菌株,底物-蔗糖為145 g/L、甘露醇產(chǎn)量為101.60 g/L、轉(zhuǎn)化率為70.0%。NADH不僅推動蔗糖中果糖部分轉(zhuǎn)化為甘露醇,還推動葡萄糖→葡萄糖-6-磷酸→果糖-6-磷酸→甘露醇-1-磷酸→甘露醇途徑的轉(zhuǎn)化,進(jìn)而提高轉(zhuǎn)化率。

2.7 甘露醇外排泵和還原力的協(xié)同

以CCTCC M2018815為出發(fā)菌,敲入mep序列而構(gòu)建的菌株轉(zhuǎn)化率為59.65%,敲入FDH表達(dá)盒的菌株最高的轉(zhuǎn)化率為57.0%,只有同時敲入mep序列和FDH表達(dá)盒的菌株轉(zhuǎn)化率最高提升到70.0%。在胞內(nèi)底物轉(zhuǎn)化為甘露醇的過程中蔗糖和NADH都缺一不可,且甘露醇的產(chǎn)量形成過程中甘露醇外排泵蛋白的作用也是非常重要的。

3 討論

3.1 細(xì)胞工廠的“源-庫”

“源-庫”學(xué)說,是指源和庫在控制綠色植物同化物運(yùn)輸和分配方面的理論;源是指生產(chǎn)同化物及向其他器官提供營養(yǎng)的器官,而庫是指消耗或積累同化物的接納器官。庫對源有反饋?zhàn)饔?能調(diào)動源內(nèi)有機(jī)物向其轉(zhuǎn)移;源庫之間運(yùn)輸流暢是指源端物質(zhì)的不斷輸出和庫端的及時利用與儲備;如果庫端不能充分容納與利用源端的同化物,則同化物不能及時從通道上部輸出,源端同化物的供應(yīng)及繼續(xù)合成過程就會減弱,引起反饋抑制。借鑒植物生理學(xué)中的“源-庫”學(xué)說,細(xì)胞工程中建立細(xì)胞工廠的“源-庫”學(xué)說,來指導(dǎo)構(gòu)建高產(chǎn)目標(biāo)代謝物的細(xì)胞菌株。

通過甘露醇脫氫酶的催化將果糖轉(zhuǎn)化為甘露醇過程中,可以把果糖和NADH當(dāng)作底物。敲除乙醇脫氫酶基因、乙醛脫氫酶基因[7]、乳酸脫氫酶基因[7]、乙酰磷酸轉(zhuǎn)移酶基因[7]都能節(jié)約NADH而提高果糖的轉(zhuǎn)化率,敲除葡聚糖蔗糖酶基因[18]、敲除絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因[7]能節(jié)約蔗糖而提高果糖的轉(zhuǎn)化率,敲除果糖激酶基因能節(jié)約果糖而提高果糖的轉(zhuǎn)化率,屬于節(jié)流手段;敲入甘露醇脫氫酶基因[7]、利用菊粉產(chǎn)甘露醇[10]、開辟葡萄糖→葡萄糖-6-磷酸→果糖-6-磷酸→甘露醇-1-磷酸→甘露醇的途徑[9]、增強(qiáng)產(chǎn)NADH的能力而提高甘露醇產(chǎn)量等手段都屬于開源;通過開源節(jié)流而增強(qiáng)“源”能,最終達(dá)到甘露醇高產(chǎn)的目的。

在明串珠菌染色體中定點(diǎn)插入甘露醇外排泵蛋白編碼基因表達(dá)盒,將更多的產(chǎn)物排出到胞外,若產(chǎn)物為抗生素,進(jìn)行自我解毒(將抗生素進(jìn)行化學(xué)修飾、或?qū)⒖股匾詿o/低活性前體形式儲存在體內(nèi)、或?qū)⒖股卦隗w內(nèi)區(qū)域化隔離、或產(chǎn)生抗生素的抗性蛋白)[25]。在大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)構(gòu)建超分子支架系統(tǒng),增加乙醇的產(chǎn)生[26];在酵母菌中通過區(qū)室化代謝途徑將代謝途徑分隔在特定的亞細(xì)胞區(qū)域(過氧化物酶體或線粒體或液泡),可以隔離含毒性化合物,將酶催化反應(yīng)導(dǎo)向特定底物以及建立不同的化學(xué)反應(yīng)[27];在鹽單胞菌構(gòu)建PHB生物合成體系時,過表達(dá)細(xì)胞分裂抑制劑MinCD而使細(xì)胞拉長[28]、改變細(xì)胞形狀(從桿狀變?yōu)槔w維狀或者小球體變成大球體)[29]、失活細(xì)胞骨架蛋白編碼基因mreB和細(xì)胞分裂蛋白編碼基因ftsZ而增加細(xì)胞大小和長度并增大細(xì)胞容積[30]。細(xì)胞工廠生產(chǎn)的化合物溶解性差或毒性高時,通過硫酸化將目的化合物轉(zhuǎn)化為硫酸鹽結(jié)合物[31]或包裹在細(xì)菌微室中[32];通過糖基化修飾將柚皮素轉(zhuǎn)化為柚皮素-7-O-葡萄糖苷,從而降低酵母細(xì)胞的毒性并促進(jìn)胞外分泌和增加水溶性[33]。酵母發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素時,脂滴成為蝦青素的庫[34],這些都屬于增大“庫”容的手段。

3.2 FDH和mep的作用機(jī)理

FDH促進(jìn)產(chǎn)甘露醇,在明串珠菌細(xì)胞中甘露醇脫氫酶以蔗糖中的果糖部分為底物產(chǎn)生甘露醇,這一過程中產(chǎn)生一分子甘露醇就消耗一分子NADH。FDH以甲酸為底物,產(chǎn)生還原型輔酶NADH。本研究中底物甲酸鈉為15 g/L,從而至多產(chǎn)生0.220 5 mol的NADH。FDH提供NADH而直接推動果糖→甘露醇的轉(zhuǎn)化;CCTCC M2018815(構(gòu)建有葡萄糖→葡萄糖-6-磷酸→果糖-6-磷酸→甘露醇-1-磷酸→甘露醇的途徑)的果糖-6-磷酸→甘露醇-1-磷酸的轉(zhuǎn)化過程也消耗NADH,就是說,NADH還推動果糖-6-磷酸→甘露醇-1-磷酸的轉(zhuǎn)化,最終效果是提高甘露醇產(chǎn)量。簡而言之,NADH是促進(jìn)底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的直接“源能”,在發(fā)酵過程中表現(xiàn)為打破添加底物的限制。

mep促進(jìn)產(chǎn)甘露醇,將胞內(nèi)的甘露醇轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外,從而提高甘露醇產(chǎn)量;從化學(xué)平衡角度講,不斷地將胞內(nèi)目的代謝物泵到胞外,騰出胞內(nèi)的代謝物“庫容”,進(jìn)而促進(jìn)反應(yīng)物不斷地向產(chǎn)物方向轉(zhuǎn)化,在發(fā)酵過程中表現(xiàn)為打破添加底物的限制。

4 結(jié)論

(1)改變原核生物染色體中的操縱子和重疊基因排列模式,可以改善基因表達(dá)效率;(2)使細(xì)胞工廠具備更強(qiáng)的“源”能和更大的“庫”容,從而達(dá)到目標(biāo)產(chǎn)物超高產(chǎn)的目的。不管“源”能還是“庫”容,最終都?xì)w結(jié)到底物轉(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物的化學(xué)平衡。