海參多糖的提取純化、化學分析方法和生物活性研究進展

馬向前,夏蘇東*,王蘋,黃天卓,高哲穎,李茂哲

1(天津農學院 水產學院,天津市水產生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室,天津,300384)2(天津現(xiàn)代創(chuàng)新中藥科技有限公司,天津,300380)3(天津市濱海新區(qū)農業(yè)農村發(fā)展服務中心,天津,300450)

海參屬于棘皮動物門(Echinodermata)海參綱(Holothuroidea)。目前全球已發(fā)現(xiàn)1 700多種海參,分布于溫帶區(qū)和熱帶區(qū),其中種類最多,資源量最大的地區(qū)當屬印度西太平洋海域[1]。據(jù)統(tǒng)計,我國有約140種海參,其中可食用海參約20種,其中最為名貴、食用價值最高的當屬遼寧和山東的刺參[2]。海參中含有海參酸性多糖、海參皂苷、膠原蛋白、海參腦苷脂等生物活性成分,礦物質和微量元素含量也很豐富,是一種高蛋白、低脂肪、低膽固醇的健康食品。

海參多糖約占干海參總有機物的4%～10%,以往的研究通常將其分為海參糖胺聚糖(Holothurians glycosaminoglycan,HGAG)和海參巖藻聚糖硫酸酯(Hohthurians fucan,HF)2種組分,近幾年的研究發(fā)現(xiàn)海參中還存在一種特殊的不含硫酸酯基的中性聚糖。海參多糖具有免疫調節(jié)、抗腫瘤、抗凝血、抗炎、降血糖、降血脂、抗氧化等生物活性。鑒于海參多糖的多樣性和生物活性,對其制備、化學分析方法和生物活性進行綜述具有重要意義,本文總結了海參多糖的提取、分離純化,含量測定,化學成分和結構分析的方法及其生物活性,為進一步研究海參多糖提供參考。

1 海參多糖的提取方法

海參多糖是蛋白多糖的糖鏈部分,通過糖肽鍵與蛋白多糖的核心蛋白相連,并通過非共價鍵和其他蛋白質形成具有空間構象的大分子聚集體,海參多糖的提取需要在盡量不破壞其結構的前提下將其與蛋白分開。海參多糖的提取方法有化學水解法(熱水提取、稀堿提取),酶解法(單一酶解法、復合酶解法),物理輔助提取法(超聲波輔助提取法、微波輔助提取法),其中最常用的方法是酶解法、稀堿提取法。近幾年關于海參多糖不同提取方法和產率的比較見表1。

表1 海參多糖提取方法總結Table 1 Summary of extraction methods of sea cucumber polysaccharide

1.1 化學水解法

堿處理水解法主要利用堿斷裂蛋白多糖中的糖肽鍵,提取溶劑一般為稀堿和稀碳酸鉀的水溶液,其特點是操作簡單,提取效率高。但是堿處理后,多糖易發(fā)生Walden反應,或形成3,6-內醚衍生物而發(fā)生脫硫現(xiàn)象[17],造成多糖結構的改變,因此,堿解提取時,堿的濃度、溫度和時間都需要實驗優(yōu)化以得到最佳提取條件。韓秋菊等[3]采用堿法提取海參多糖,用30 g/L的KOH水溶液在60 ℃下提取4 h,料液比1∶50(g∶mL),粗多糖的提取率可達20.69%。

水提醇沉法是提取動植物多糖最常見的一種方法,但對于海參多糖的提取應用較少。由于海參多糖是通過糖肽鍵與蛋白質共價結合,單純的熱水浸提往往無法將兩者分開,提取效果較差。馮駿[4]通過熱水浸提法提取海參多糖后發(fā)現(xiàn)得率僅有0.649%。海參多糖的連接方式特殊,導致單獨使用熱水浸提無法有效的破壞共價鍵,且長時間的熱水浸提可能會造成多糖結構和化學活性的改變,影響其生物活性。

1.2 酶解法

酶解法作用條件溫和,不會改變多糖鏈的結構,但提取效率較堿提取法低,蛋白酶多選用對肽鍵斷裂作用專一性低的、廣譜的微生物酶、植物酶和動物酶,如中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶等,其中以木瓜蛋白酶應用最為廣泛[18]。根據(jù)酶解過程中添加酶的類別不同可分為單一酶解法和復合酶解法,單酶法中最常用的酶是木瓜蛋白酶,LI等[5]使用木瓜蛋白酶,從白斑海參(Holothuriapolii)、冰刺參(Holothuriatubulosa)、刺參(Stichopusjaponicus)中提取海參多糖,純化后的多糖提取率在1.83%～3.4%。為了使蛋白質水解更充分,采用兩種及以上的酶制劑增強水解效果的方法稱為復合酶解法,采用較多的搭配有胃蛋白酶和胰蛋白酶聯(lián)合使用,該方法在接近生物體溫度條件下酶解蛋白,避免了高溫對生物活性成分的破壞,適用于富含蛋白的動物類藥物的提取[19]。韓慧敏等[7]采用仿生提取法提取海參多糖,產率達到14.5%～16.1%。陳發(fā)河等[8]采用胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶3種酶依次酶解海地瓜(Acaudinamolpadioides)提取海參多糖,多糖提取率可達12.51%,多酶法較單酶法對海參多糖的提取率明顯提高。

1.3 堿處理法結合酶解法

堿處理結合酶解法即先用稀堿的水溶液水解海參,再調節(jié)至適宜的pH后加入蛋白酶酶解海參蛋白。海參經(jīng)過堿處理后其海參多糖與蛋白結合更加松散,有助于提高下一步酶解效果,既避免了長時間的堿提取對多糖結構的破壞,又提高了酶解效率。國內外學者采用堿處理結合酶法從海地瓜(Acaudinamolpadioides)[9-10]、刺參(Stichopusjaponicus)[10-11]、綠刺參(Stichopuschloronotus)[10]、花刺參(Stichopusherrmanni)[12,20]、白肛海地瓜(Acaudinaleucoprocta)[13]提取海參多糖,提取率為1.65%～7.5%。堿處理結合酶解法的處理方式綜合了2種方法的優(yōu)勢,成為提取海參多糖應用最為廣泛的方法。

1.4 物理輔助提取法

近年來超聲波提取技術逐漸應用于多糖的提取,該方法是利用超聲波增大物質分子運動頻率和速度,增加溶劑穿透力,提高被提取化學成分的溶出度,從而縮短提取時間。王遠紅等[14]采用超聲波輔助堿處理的方法提取海參多糖,得率可達20.25%。宋思媛等[21]采用超聲波輔助熱水浸提法提取海參多糖,粗多糖總糖含量可達24%。然而,一些學者認為超聲波的使用可能會破壞多糖的結構,改變其生物活性,WANG等[15]比較了超聲波輔助酶解法、酶解法和超聲波法3種方法提取海參多糖的產率、多糖結構和分子質量,發(fā)現(xiàn)超聲波輔助酶解法多糖產率顯著高于其他2種方法,但分子質量最低,說明超聲波的使用提高了多糖的產率,但可能引起海參多糖降解,導致其分子質量發(fā)生改變。

微波是頻率0.3～300 GHz的電磁波,具有穿透力強、加熱效率高、選擇性高等特點[22],但微波容易產生局部高溫導致多糖結構發(fā)生改變。王慶芬[16]采用超聲波和微波協(xié)同提取刺參多糖,產率可達12.387%。目前對微波輔助提取海參多糖的研究相對較少。

2 海參多糖的分離與純化

2.1 海參多糖的初步分離

海參經(jīng)過簡單的提取后,其水解液主要由海參多糖、蛋白、多肽和皂苷組成,因此,需通過物理和化學的方法對粗多糖進行純化,去除非多糖成分。一種思路是將多糖沉淀,常用的方法有醇沉法、季銨鹽沉淀法、乙酸鉀沉淀法。醇沉法的原理是乙醇的加入降低溶液電離常數(shù),多糖溶解度降低而沉淀分離。季銨鹽和乙酸鉀加入至一定濃度后,或達飽和狀態(tài),可使多糖在水中溶解度降低與水溶性大的雜質分離。另一種思路是將蛋白沉淀,常用的方法有Sevag法和三氯乙酸法,這2種方法的原理是使多糖不沉淀而使蛋白變性分離。Sevag法是經(jīng)典的除蛋白的方法,但其操作過程過于復雜,需要反復多次除雜,且對多糖的損失較大。三氯乙酸法反應較為劇烈,對于含呋喃糖殘基的多糖因其連接鍵不穩(wěn)而不宜使用[23]。研究發(fā)現(xiàn),單獨一種分離方法的應用往往達不到好的分離效果,目前多使用醇沉法結合季銨鹽沉淀法或乙酸鉀沉淀法、醇沉法結合Sevag法或三氯乙酸法、多次醇沉法等多種不同分離方法結合的方式分離海參多糖。王遠紅等[14]采用二次醇沉的方法分離海參多糖,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過二次醇沉后的多糖峰后無明顯的小分子峰,多糖純度較一次醇沉明顯提高。

2.2 脫色

經(jīng)初步分離后獲得的海參多糖仍為粗多糖,除多糖外還含有色素、無機鹽、皂苷、少量的蛋白和多肽等物質,需要依靠分離效果更好、選擇性更強的方法逐步將多糖與其他物質分離,以提高其純度。初步分離獲得的海參多糖首先要進行脫色處理,應用于海參多糖的脫色方法有活性碳吸附脫色、雙氧水脫色和大孔吸附樹脂脫色法。雙氧水和活性炭脫色是多糖脫色的經(jīng)典方法,也是目前海參多糖常用的脫色方法,2種方法各有優(yōu)劣。張軍瑞等[24]研究表明,2種方法都不可避免地造成多糖的損失,二者對多糖的損失率均超過25%。宿瑋等[25]研究表明,雙氧水處理并未有效去除掉色素,僅僅是將色素氧化,并未提高多糖純度。

近年來,樹脂吸附脫色法逐漸成為一種新興的脫色方法。大孔樹脂表面的多孔結構使其具有篩選性,通過分子間的氫鍵和范德華力進行吸附,根據(jù)多糖分子質量的差異和吸附力的強弱可實現(xiàn)分離、脫色的目的,具有理化性質穩(wěn)定、機械強度高、吸附容量大等優(yōu)點[26]。宿瑋等[25]比較了活性炭吸附、雙氧水脫色法及大孔樹脂脫色法對海參多糖的脫色效果,研究表明樹脂D392優(yōu)于活性炭和雙氧水,脫色率達 (84.2±0.6)%,多糖保留率為 (82.9±1.1)%。大孔樹脂作為一種新型高分子材料,在海參多糖的純化脫色方面展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢,有著廣泛的應用前景。

2.3 海參多糖的純化

純化海參多糖的常用方法有超濾法,離子交換色譜及凝膠色譜等柱層析法,離子交換柱層析搭配凝膠柱層析可以使海參多糖得到較好的分離效果。近年來,超濾法作為一種新型的膜分離技術廣泛應用于多糖分離純化。超濾膜是一種半透膜,根據(jù)被分離物質的分子質量大小和幾何形態(tài)的不同將各組分分離[27]。該方法具有實驗操作簡易、純度高、不破壞分子化學結構、耗能低等優(yōu)秀特點。朱啟源[28]采用Mw=10 000 Da的超濾膜純化了10種低食用價值海參多糖組分,海參多糖組分的得率為3.90%～11.44%。不同分子質量的多糖往往具有不同的生物活性,超濾時使用不同分子質量的超濾膜,可以截留不同分子質量的多糖,從而獲得具有不同生物活性的多糖組分。陳發(fā)河等[8]采用3種不同截留分子質量的超濾膜按照分子質量從小到大的順序對海地瓜多糖提取液進行超濾,得到4種不同分子質量多糖組分。

近年來,離子交換、凝膠過濾、親和色譜等色譜技術已成功應用于多糖的分級純化[29],其中離子交換柱層析法和凝膠滲透柱層析法是純化海參多糖常用的手段。常用于分離純化海參多糖的陰離子交換劑有DEAE-纖維素、快流速Q瓊脂糖凝膠、強離子交換樹脂等。GONG等[6]使用DE-52陰離子交換柱,以用純水洗脫得到一種海參中性多糖。LI等[12]使用FPA98通過強離子交換柱分離純化粗多糖,分別用0～1 mol/L和2 mol/L NaCl溶液洗脫得到了HF和HGAG。HE等[13]使用快流速Q瓊脂糖凝膠陰離子交換柱分離白肛海地瓜多糖,分別用蒸餾水和2 mol/L NaCl溶液洗脫得到HF和HGAG。YUAN等[20]采用負載強離子交換樹脂的強陰離子交換柱分離純化海參粗多糖,收集2.0 mol/L NaCl洗脫液,得到了純度>99.9%HF。

凝膠色譜法是指混合物隨流動相經(jīng)過凝膠時,混合物中各組分按分子質量大小不同分離的一種技術,故又稱為分子篩過濾色譜。凝膠是一種不帶電荷的具有三維空間的多孔網(wǎng)狀結構的物質,其根據(jù)分子質量大小選擇性透過小分子,排阻大分子物質,具有分子篩的性質。它的優(yōu)點是凝膠材料屬惰性載體,不帶電荷、吸附力弱、操作條件比較溫和,能保持分離出化學成分的理化性質且不需要有機試劑。常用的凝膠基質有葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠三大類[30],展層劑為各種濃度的鹽溶液和緩沖溶液。海參多糖經(jīng)陰離子交換柱純化得到數(shù)個組分,各組分再經(jīng)凝膠層析柱進一步純化后即可得到高純度海參多糖。LI等[5]采用快流速Q瓊脂糖凝膠陰離子交換柱和Sephacryl S-400 HR凝膠層析柱對海參多糖分離純化,得到一種海參巖藻聚糖,純度可達占95%以上。CHANG等[31]使用Express-Ion D陰離子交換柱和Sephacryl S-500 HR凝膠層析柱分離出了一種海參巖藻聚糖。GONG等[32]使用快流速Q瓊脂糖凝膠陰離子交換柱和Sephacryl S-300凝膠層析柱從海參粗多糖中分離純化出一種HGAG。

3 海參多糖的化學分析方法

3.1 含量測定

海參多糖含量測定的方法有比色法和色譜法。應用于海參多糖的比色法包括硫酸苯酚法、蒽酮-硫酸法、強酸咔唑比色法、次甲基藍法、天青I號染色劑法。其中最為常用的當屬硫酸苯酚法,其原理多糖被濃硫酸水解為單糖后形成糠醛衍生物,該衍生物與苯酚反應后顯色,顯色后通過紫外分光光度計測定顯色液吸光度,吸光度與多糖含量線性相關[33],該方法操作簡單、方便快捷、重復性好。比色法雖然存在選擇性不強,吸光度可能受其他物質干擾的問題,但由于其操作簡單,測定結果較為準確,仍為海參多糖含量測定最常用的方法。

色譜法相較于比色法測定更具準確性,隨著色譜技術的不斷發(fā)展,色譜法成為分離、分析多糖的主流方法[34]。常用于多糖含量測定的色譜法包括:離子色譜法和高效液相色譜法。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one,PMP)柱前衍生高效液相色譜法利用三氟乙酸將多糖降解為單糖,對降解出的單糖進行衍生化處理之后,再運用紫外檢測器測定其降解產物中巖藻糖的含量,通過換算系數(shù)得出海參多糖的總量,該方法已經(jīng)成為刺參多糖含量測定的行業(yè)標準SC/T 3049—2015《刺參及其制品中海參多糖的測定 高效液相色譜法》。焦健等[35]在上述標準的基礎上,建立了一種高效液相色譜-三重四極桿質譜聯(lián)用技術測定海參多糖含量,該方法精準度高,特異性強。

3.2 化學成分分析

多糖的化學成分分析包括分子質量和純度、單糖組成、取代基的種類等內容。海參多糖分子質量和純度測定方法是高效凝膠排阻色譜法,其原理是被分離的成分經(jīng)過凝膠分子篩的篩選后其保留時間與分子質量成線性關系,通過分子質量已知且不同分子質量大小的標準品建立標準曲線,計算未知組分分子質量。

在多糖結構的研究中,單糖組成是其重要的組成部分,也是開展多糖結構解析的基礎。目前應用于單糖分析的方法有毛細管電泳法、氣相色譜法、高效液相色譜法、氣質聯(lián)用法、液質聯(lián)用法。海參多糖的結構復雜,單糖種類繁多,高效液相色譜法因其高精準度和高靈敏度成為分析復雜單糖組成的主流方法。測定海參多糖的單糖組成常用的方法是PMP柱前衍生高效液相色譜法,首先利用三氟乙酸將多糖降解為單糖,對降解出的單糖進行衍生化處理之后再運用高效液相色譜法測定含量,該方法簡單易操作、靈敏度高、重復性好,適用于單糖的實驗室常規(guī)檢測。劉芬等[36]建立了一種高效陰離子交換-脈沖安培檢測法分析海參多糖的單糖組成并測定含量,該方法分離效果好、精密度高,且不需經(jīng)過衍生等復雜操作,大大提高了檢測速率。

海參多糖中硫酸酯基含量的測定方法有明膠-氯化鋇法和離子色譜法。明膠-氯化鋇法是多糖中酸解出的硫酸基與鋇離子反應生成硫酸鋇明膠懸濁液,通過分光光度計進行測定[29]。離子色譜法是利用離子交換樹脂對不同分離物質親和力的不同,使能夠離子化的化合物的分離,該方法檢測時間短、靈敏度高。

3.3 化學結構

多糖是一種結構復雜的生物大分子,結構表征不僅包括單糖組成、分子質量、取代基種類等一級結構,還包括糖苷鍵的類型、糖殘基的組成、連接位點和順序等,準確建立和完善海參多糖的結構分析方法體系是其應用的前提。目前應用于海參多糖結構分析的方法有甲基化分析、Smith降解、高碘酸鹽氧化、核磁共振、傅里葉變換紅外光譜、高效液相色譜法、氣相色譜-質譜法、掃描電子顯微鏡、原子力顯微鏡等方法。每種方法都能提供一些結構信息,需要合并總結多種不同分析方法獲得的結構信息,才能得出最精確的多糖結構。不同海參品種、提取方法和分離純化方法都可能會導致多糖結構的不同,表2總結了近年來各種海參多糖的化學成分和結構特征。

表2 海參多糖制備方法和化學成分特征Table 2 Preparation method and chemical composition characteristics of sea cucumber polysaccharide

近幾年研究發(fā)現(xiàn),海參多糖主要有糖胺聚糖和巖藻聚糖硫酸酯2種,還有一種不常見的中性多糖。糖胺聚糖主鏈由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺交替連接而成,其單糖主要由葡萄糖醛酸、N-乙酰半乳糖胺、巖藻糖組成,分子質量范圍在6.3～111.0 kDa,硫酸酯基含量在30%～40%。LI等[12]分離出一種在結構上高度規(guī)則的海參糖胺聚糖FG,分子質量為63.7 kDa,單糖主要由葡萄糖醛酸、N-乙酰半乳糖胺、L-巖藻糖組成,物質的量比為1∶0.96∶1.02,其主鏈序列為[→4)-D-GlcA-β(1→3)-D-GalNAc4S6S-β(1→],單糖L-巖藻糖側鏈通過α(1→3)糖苷鍵與葡萄糖醛酸相連。YUAN等[20]分離出一種海參糖胺聚糖SmFG,分子質量為76.8 kDa,單糖由N-乙酰半乳糖胺、巖藻糖、葡萄糖醛酸組成,物質的量比為1∶0.91∶1.32,由C-4和C-6位置均被硫酸化的N-乙酰半乳糖胺和各種單糖側鏈組成,其雙糖側鏈有著特殊的連接方式,通過α-1,3糖苷鍵與葡萄糖醛酸相連。LI等[5]從海參中提取并純化一種糖胺聚糖Fuchp,分子質量為(103.1±2.8) kDa,單糖由氨基葡萄糖、半乳糖胺、半乳糖、巖藻糖組成,物質的量比為1.3∶0.81∶2.18∶95.7 其主鏈由一個四糖重復單元[→3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp2(OSO3-)-1→3-α-L-Fucp2(OSO3-)-1→3-α-L-Fucp2,4(OSO3-)-1→]組成。

HF是由多個硫酸基Fuc重復單元通過α-1,3糖苷鍵或α-1,4糖苷鍵連接而成的線性多糖[37],分子質量范圍在59.3～1 567.6 kDa,硫酸酯基含量在15%～39.5%。CHANG等[31]分離出一種海參巖藻聚糖Ht-FUC,分子質量為(1 567.6±34.1) kDa,硫酸酯基含量為(31.2±1.6)%,Ht-FUC由一個四糖重復單元[→3-α-L-Fucp2(OSO3-)-1→3-α-L-Fucp2,4(OSO3-)-1→3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp2(OSO3-)-1→]組成。HE等[13]分離出一種海參巖藻聚糖AL1,分子質量為593 kDa,硫酸酯基含量為15%,AL1主鏈主要由[→3)-α-L-Fucp-(1→]組成。

目前對海參中性多糖結構的研究較少,其D-Glc殘基主要通過α-1,4糖苷鍵連接,分支由α-1,6糖苷鍵連接[37]。海參中性多糖首次發(fā)現(xiàn)于紅腹海參(Holothuriaedulis)[39],分子質量為253.3kDa,單糖組成僅有葡萄糖。ZHENG等[38]從秘魯烏參(Pattalusmollis)中分離得到2種中性多糖,分子質量分別為12.8 kDa和6.97 kDa。GONG等[6]從刺參(Stichopusjaponicus)中分離出一種海參中性聚糖,分子質量為301.75 kDa,它由一個1,4-α-D-葡萄糖主鏈和一個β-D-葡萄糖分支,每7～9個葡萄糖殘基與葡萄糖的O-6鍵相連。

4 生物活性

4.1 免疫調節(jié)

海參多糖可以顯著提高機體細胞免疫和非特異性免疫功能,其通過與免疫細胞表面的受體結合,激活不同的信號通路來調節(jié)免疫系統(tǒng),改善因化學藥物引起的動物機體免疫力低下的狀況。楊東達[40]研究表明海參多糖(SCVP-1)能夠誘導巨噬細胞產生大量的NO和細胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α),增強巨噬細胞的吞噬活性,顯著刺激相關基因(iNOS、IL-1β、IL-6和TNF-α)的表達,其作用機制與SCVP-1激活MAPKs和NF-κB信號通路,從而激活巨噬細胞有關。腹腔注射SCVP-1可以顯著提高環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠免疫臟器指數(shù),促進脾淋巴細胞的增殖率,提升小鼠的吞噬能力,有效促進小鼠溶血素抗體的生成[40]。

4.2 抗腫瘤

海參多糖對多種腫瘤的生長均有明顯的抑制作用,能通過誘導細胞自噬、細胞凋亡、調控腫瘤細胞周期以及調節(jié)免疫等多種途徑發(fā)揮抗腫瘤活性。王婷等[41]從海參精中提取的多糖(SCSCPA2)對Hela細胞和HepG2細胞表現(xiàn)出顯著的體外抗腫瘤活性,當SCSPA2質量濃度為10 mg/mL時,對2種細胞抑制率分別為80.28%和83.11%。盧戰(zhàn)輝等[42]研究表明,海參多糖可抑制人肝癌細胞的增殖,促進其凋亡,推測其機制可能是通過調控JAK2/STAT3/survivin通路中JAK2、STAT3、survivin蛋白磷酸化表達而實現(xiàn)的。李天等[43]研究表明,海參多糖能夠顯著抑制人腎癌細胞A498的增殖活力、黏附能力、遷移能力和侵襲能力,推測其機制可能是通過抑制NF-κB信號通路下調MMP-9和VEGF的表達。張曉媛[44]通過海參多糖聯(lián)合放療的方法處理A549肺癌細胞后發(fā)現(xiàn),HGAG與放療合作用呈現(xiàn)為互相協(xié)同性,HGAG可有效抑制癌細胞的增殖,促進其凋亡,推測其機制可能是通過Caspase蛋白和Bax蛋白表達上調,以及Survivin蛋白、Bcl-2蛋白的表達下調實現(xiàn)的。

4.3 抗凝血

海參多糖含有豐富的硫酸基團,其作用類似于肝素,具有較強的抗凝血作用。研究表明,海參多糖通過激活血漿中抗凝血酶或肝素輔助因子Ⅱ的表達,從而抑制內源性和外源性凝血途徑中的凝血因子(Ⅱa和Xase)活性,發(fā)揮其抗凝血作用[45]。GAO等[46]從象牙參(Holothuriafuscopunctata)體壁分離出的糖胺聚糖和硫酸氨基聚糖表現(xiàn)出較強的抗凝血活性和內因Xase抑制活性。NING等[47]從佛羅里達海參(Holothuriafloridana)中分離得到一種HF具有較強的抗凝血活性,且其活性隨分子質量的降低而降低,Mw<11.5 kDa的HF片段表現(xiàn)出無明顯抗凝作用。張哲嫻[48]對玉足海參(Holothurialeucospilota)多糖及其解聚產物的抗凝血活性進行比較,發(fā)現(xiàn)玉足海參天然多糖具有顯著的誘導人血小板聚集的活性,而解聚產物則對血小板聚集無顯著影響。

4.4 抗炎

炎癥是機體或細胞受到環(huán)境中不良因素的影響后,多種炎癥因子過度表達的結果。炎癥反應過程由大量的介質共同協(xié)調,形成的復雜調節(jié)網(wǎng)絡。研究發(fā)現(xiàn)不同種類和分子質量海參多糖均具有一定抗炎作用,ZHU等[49]通過將不同分子質量和鏈構象的土耳其刺參(Holothuriatubulosa)多糖(Ht-FUC)作用于脂肪細胞和巨噬細胞組成的共培養(yǎng)體外炎癥模型,發(fā)現(xiàn)所有Ht-FUC均通過激活PPARγ來減弱共培養(yǎng)巨噬細胞炎癥因子的產生,促進M2表型極化。此外,Ht-FUC還通過抑制TLR4/NF-κB依賴通路來促進共培養(yǎng)脂肪細胞的脂解作用。體內高脂高蔗糖飼料喂養(yǎng)的肥胖小鼠模型實驗表明,Ht-FUC可以降低血清炎癥水平,減弱肝臟Kupffer細胞M1/M2極化,減弱附睪脂肪組織炎癥浸潤。張帥[50]通過構建以脂多糖誘導的RAW264.7小鼠巨噬細胞體外炎癥模型,發(fā)現(xiàn)海參多糖可通過促進自噬對脂多糖所致細胞炎癥反應有一定的抑制作用。

4.5 降血糖,降血脂

研究表明海參多糖對高血糖、高血脂、糖尿病具有較好的預防和控制作用。GONG等[6]通過酶解的方法從刺參(Stichopusjaponicus)中分離出一種中性多糖(NPsj),通過建立體外胰島素抵抗HepG2細胞模型和3T3-L1細胞模型,發(fā)現(xiàn)NPsj在10～100 μg/mL范圍內對增加葡萄糖消耗有顯著作用,且無毒性。此外,NPsj上調Akt1磷酸化,下調GSK3β磷酸化,進而下調GS磷酸化,提示其通過Akt/GSK3β/GS信號通路改善胰島素抵抗的機制。袁義瓊[51]研究了玉足海參(Holothurialeucospilota)多糖(HLP)對大鼠高脂血癥的緩解作用機制,發(fā)現(xiàn)HLP具有改善大鼠的脂代謝紊亂、緩解肝損傷、調節(jié)炎癥因子水平異常和脂質過氧化等高脂血癥癥狀的功效,其作用機制為HLP通過調控NF-κB通路和減少ACC和CD36的表達來抑制肝臟脂質積累和胰島素過量分泌,從而改善大鼠高脂血癥。

4.6 抗氧化

一般認為自由基的活動與機體衰老密切相關,有研究表明海參多糖對多種自由基具有清除作用。李啟冬[52]從刺參(Stichopusjaponicus)腸壁中提取了硫酸軟骨素(FCSiw)并對其清除自由基能力進行評價,發(fā)現(xiàn)FCSiw對DPPH自由基和ABTS陽離子自由基具有一定清除能力,且清除能力隨著多糖濃度升高而增大。GAO等[53]從象牙參(Holothuriafuscopunctata)中制備巖藻聚糖硫酸酯(FSI)并通過酸處理對其進行解聚,對FSI及其解聚產物的抗氧化活性進行評價,發(fā)現(xiàn)FSI和解聚產物具有較強的超氧自由基清除活性,IC50分別為65.71、83.72 μg/mL,而對DPPH自由基、羥自由基和ABTS陽離子自由基無清除作用。

4.7 其他生物學活性

近幾年研究發(fā)現(xiàn),海參多糖還具有促進神經(jīng)細胞生長[54]、恢復腸道菌群紊亂[20]、保肝[55]、預防老年癡呆[56]和預防肥胖[57]的作用,這些發(fā)現(xiàn)有助于海參多糖作為食品中功能性成分的應用,也為海參多糖在醫(yī)藥領域的開發(fā)提供了科學依據(jù)。

5 構效關系

近幾年關于海參多糖的研究集中于其初級結構特征和生物活性,關于其高級結構的研究較少,復雜的海參多糖結構與其對應的生物學功能的構效關系至今還無法闡明,海參多糖構效關系的探索仍處于初級階段。目前關于海參多糖構效關系的研究主要集中在其結構與抗凝血活性的關系,而其他活性的構效關系尚不清楚。

目前,海參多糖分子質量大小與抗凝血活性之間的關系已被廣泛研究,經(jīng)過解聚后的低聚糖仍具有抗凝血活性,且抗凝血活性與低聚糖分子質量呈正相關。LI等[58]通過芬頓解聚反應對糖胺聚糖進行化學解聚,發(fā)現(xiàn)糖胺聚糖低聚糖顯示出與其分子質量呈正相關的抗凝血活性。WU等[59]通過鈷-60照射的方法對糖胺聚糖進行解聚,評估了低分子質量片段的抗凝血活性,發(fā)現(xiàn)抗凝血活性隨著分子質量的降低而降低。NING等[47]對一種HF進行解聚,發(fā)現(xiàn)抗凝血活性隨分子質量的降低而降低,分子質量小于11.5 kDa的HF片段則無明顯抗凝作用。

一般認為,硫酸巖藻糖分支結構是海參多糖發(fā)揮抗凝血和抗血栓作用的基礎,沒有硫酸巖藻糖分支的海參中性聚糖不具備抗凝作用。ZHENG等[38]從秘魯烏參(Pattalusmollis)分離出海參糖胺聚糖(PmFG)、巖藻聚糖(PmFS)和中性聚糖(PmNG-1 &-2),對他們的體外抗凝血活性進行了比較,發(fā)現(xiàn)含有硫酸巖藻糖分支的PmFG和PmFS均具有較強的活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplatin time,APTT)延長活性和內源性凝血途徑末端復合物(FXase)抑制活性,而不含硫酸巖藻糖分支的PmNG-1和PmNG-2則沒有抗凝血活性。硫酸巖藻糖分支結構的硫酸化模式是影響海參多糖生物活性的主要因素,不同的硫酸化模式會導致海參多糖抗凝血活性的不同,CHEN等[60]分別從 墨西哥刺參(Isostichopusbadionotus)和革皮氏海參(Pearsonothuriagraeffei)分離出2種具有相同的硫酸軟骨素主鏈和相似的巖藻糖分支的硫酸軟骨素 fCS-Ib和fCS-Pg,兩者的區(qū)別在于巖藻糖分支的硫酸化模式不同,體外抗凝血實驗表明,在延長APTT、凝血酶時間和抑制凝血酶方面,具有Fucp2S4S分支的fCS-Ib較具有Fucp3S4S分支的fCS-Pg顯示出更強的抗凝作用。

6 總結

海參作為一種珍貴的保健食品,除本身具有較高的營養(yǎng)價值,其獨特的藥理作用也備受關注。近年來隨著海參多糖的制備與純化工藝不斷優(yōu)化,海參多糖的產率和純度得以不斷提高,通過對不同海參品種海參多糖的化學結構和藥理學活性研究的不斷探索,其結構與生物學活性也逐漸清晰,使得海參多糖在功能性食品和醫(yī)藥領域有著巨大開發(fā)前景。目前海參多糖的開發(fā)研究仍然面臨一些問題:一是目前的海參多糖的分離純化方法過于繁瑣,使其工廠化的批量生產不易實現(xiàn),其分離純化技術仍待突破。二是基于目前分析方法的局限性,對海參多糖復雜的高級結構與其對應的生物活性之間的關系沒有深入進行探究,深入其構效關系和活性機制意義重大。海參多糖的研究是海參精深加工的重要內容,也是海洋功能食品和藥物研發(fā)的前進方向,在未來有著廣闊的應用前景。