等溫擴增技術(shù)在水產(chǎn)品寄生蟲檢測中的應(yīng)用研究進展

孫曉紅,張妮,趙嘉怡,李達容,趙勇,藍蔚青,3*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院,上海,201306)2(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室,上海,201306)3(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海,210306)

寄生蟲病是指人們生食寄生蟲污染的生鮮食品,或食用未進行徹底熱加工的食品,導(dǎo)致人們身體出現(xiàn)多種不適的疾病總稱[1]。近年來,我國飲食習(xí)慣發(fā)生明顯變化,生魚或半生海鮮類產(chǎn)品以其肉質(zhì)清鮮甘甜、營養(yǎng)價值豐富,受到廣大消費者喜愛,市場需求量逐年增加,現(xiàn)已成為人們餐桌上必不可少的美食[2]。然而,生食海鮮類產(chǎn)品易增加感染和過敏風(fēng)險[3],隨之而來的寄生蟲導(dǎo)致水產(chǎn)品質(zhì)量安全問題頻頻發(fā)生,引發(fā)的寄生蟲疾病更成為世界范圍內(nèi)影響人們健康的關(guān)鍵[4-5]。據(jù)估計,全球人類寄生蟲病的每年患病人數(shù)約為4.07億例,其中9 110萬例由于生食生鮮類食品導(dǎo)致患病的患者中,有5.2萬死亡病例[6]。

水產(chǎn)品中寄生蟲的檢測技術(shù)主要有傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測、免疫學(xué)與分子生物學(xué)等技術(shù),但前述方法往往存在耗時、專業(yè)性強、操作繁瑣、易出現(xiàn)錯漏檢等問題,已不能滿足人們對水產(chǎn)品中寄生蟲快速檢測的要求。因此,開發(fā)簡便快速、準確靈敏的寄生蟲檢測技術(shù)已成為保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全的需求。為促進寄生蟲檢測技術(shù)在水產(chǎn)品中的發(fā)展和應(yīng)用,同時減少或消除誤檢和漏檢的發(fā)生,實現(xiàn)快速檢測,現(xiàn)已有環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)與重組酶聚合酶擴增(recombinase polymerase amplification, RPA)等多種等溫擴增技術(shù)被應(yīng)用于食品安全檢測。其突出優(yōu)勢是操作簡單,可實現(xiàn)快速高效檢測。基于此,本文介紹了部分等溫擴增技術(shù)原理、優(yōu)缺點及在吸蟲、線蟲等水產(chǎn)品寄生蟲檢測領(lǐng)域的應(yīng)用研究進展,提出其存在的問題,如引物設(shè)計繁瑣、擴增產(chǎn)物純化與假陽性等。同時,介紹了可通過研發(fā)新型等溫擴增技術(shù)引物設(shè)計軟件來簡化引物設(shè)計步驟、擴增產(chǎn)物純化等辦法予以解決,并對其在水產(chǎn)品寄生蟲檢測中的未來發(fā)展前景進行分析總結(jié),以期為早期寄生蟲疾病的預(yù)防和診斷提供保障。

1 等溫擴增技術(shù)的作用原理及特點

等溫擴增技術(shù)的作用原理主要是使用便攜設(shè)備,在恒溫下用更短的時間,實現(xiàn)目標核酸的放大。該技術(shù)與傳統(tǒng)檢測技術(shù)相比的主要特點如表1所示。

表1 水產(chǎn)品主要寄生蟲檢測方法Table 1 Detection technology of parasites in aquatic products

1.1 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)最初由Eiken Chemical Company于2000年開發(fā)的,其可在60～65 ℃的恒溫條件下實現(xiàn)核酸擴增,對熱循環(huán)儀器無依賴性,且與傳統(tǒng)PCR檢測技術(shù)相比較,該技術(shù)具有擴增快速高效、實用性強等優(yōu)點[37]。該技術(shù)已應(yīng)用于線蟲、血吸蟲、病原微生物、轉(zhuǎn)基因以及食源性致病菌的檢測。其中,CAI等[27]使用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法快速檢測魚肉中的華支睪吸蟲囊蚴,比PCR法的檢測靈敏度高100倍,為快速、靈敏檢測魚中華支睪吸蟲提供了有效工具;張森等[28]實現(xiàn)了對棘顎口線蟲的快速檢測,檢測限為2 fg棘顎口線蟲質(zhì)粒DNA,靈敏度較傳統(tǒng)PCR低100倍;TONG等[29]以28S rDNA為靶點的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試驗,能快速有效地檢測感染和早期感染釘螺中的日本血吸蟲DNA,檢測限為100 fg,日本血吸蟲基因組DNA;CAMMILLERI等[30]建立的LAMP方法實現(xiàn)了對人工污染異尖線蟲的加工魚樣品的陽性擴增,檢測限比實時熒光定量PCR方法低100倍;喬艷等[31]建立的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)結(jié)合試紙條檢測,能在50 min內(nèi)準確鑒定出異尖線蟲/派氏異尖線蟲,且操作簡便;CHEN等[32]報告的LAMP法可以在60 ℃的等溫條件下在45 min內(nèi)完成并殖吸蟲檢測,為淡水蟹、小龍蝦等樣本中并殖吸蟲DNA的檢測提供了快速靈敏工具,這對有效控制人類寄生蟲疾病具有重要意義。

1.2 重組酶聚合酶等溫擴增技術(shù)

2006年,有學(xué)者利用參與細胞DNA合成、重組和修復(fù)的蛋白質(zhì)開發(fā)了RPA技術(shù)。該反應(yīng)中,T4 噬菌體的重組酶在 ATP存在下與引物結(jié)合,形成重組酶-引物復(fù)合物,該復(fù)合物會尋找雙鏈DNA同源序列,并促進同源位點與引物的結(jié)合,就會發(fā)生鏈交換反應(yīng)啟動DNA合成,單鏈結(jié)合蛋白將與另一條鏈結(jié)合防止被進一步替換。最后,重組酶分解, DNA聚合酶結(jié)合到引物的3′端,在dNTP存在下啟動DNA合成,實現(xiàn)核酸擴增[38-40],如圖1所示。

圖1 重組酶聚合酶擴增原理Fig.1 Amplification principle of recombinase polymerase

重組酶聚合酶等溫擴增技術(shù)具有簡單、高靈敏度、與多重檢測的兼容性、快速擴增,以及在低溫和恒定溫度下操作,無需初始變性步驟與使用多個引物等優(yōu)勢,已成功應(yīng)用于細菌、真菌、寄生蟲等早期診斷[41]。其中,SUN等[33]通過RPA技術(shù)結(jié)合側(cè)流層析試紙條(lateral flow dipstick, LFD)可從糞便樣品中快速檢測日本血吸蟲,且RPA-LFD技術(shù)擁有較高靈敏度和特異性,在現(xiàn)場應(yīng)用中具有良好潛力。XING等[34]以RPA擴增日本血吸蟲SjR 2基因,該法檢測限為0.9 fg的日本血吸蟲DNA,結(jié)果表明,基于RPA的檢測方法可用作血吸蟲病診斷的有前景的即時檢測。POULTON等[35]開發(fā)了一種針對曼式血吸蟲28S rDNA區(qū)域的RPA側(cè)流層析測定,檢測限為10 pg DNA,該法對曼式血吸蟲診斷檢測有很高的潛力,幾乎不需要設(shè)備和技術(shù)支持,結(jié)果可快速獲得且易于判讀。WU等[36]建立了針對B1基因檢測弓形蟲的LF-RPA方法,檢測限為0.1個卵囊/反應(yīng)。該技術(shù)在37～42 ℃(人體體溫)下即可進行,靈敏度和特異性均高,結(jié)果讀取多樣化。

2 存在問題和解決辦法

LAMP與RPA新型等溫擴增技術(shù),通過提供等溫環(huán)境合成目的基因DNA,避免傳統(tǒng)PCR的部分弊端,并結(jié)合免疫學(xué)檢測技術(shù)、生物傳感器等,使用多樣化的判讀方式,如通過LFD代替瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis, AGE)等,縮短檢測時間。等溫擴增技術(shù)雖然擁有較好特異性、選擇性、靈敏度和效率,但仍有假陽性、引物設(shè)計繁瑣與擴增產(chǎn)物需要純化等問題,針對于此,有必要采取相應(yīng)措施予以解決[42]。

2.1 引物設(shè)計繁瑣

LAMP、RPA 已逐步應(yīng)用于多重擴增,這不僅需要設(shè)計適宜的引物,也需對引物濃度進行優(yōu)化。迄今為止,還未對這些新型等溫擴增技術(shù)引物設(shè)計開發(fā)專屬的軟件[43],只有聚合酶鏈式反應(yīng)軟件可用于引物設(shè)計和篩選。但LAMP需設(shè)計多條引物,RPA的引物理想長度為30～35 bp,不論是引物數(shù)還是引物長度均不同于聚合酶鏈式反應(yīng)軟件所設(shè)計的引物。有時雖可用PCR引物擴增相應(yīng)的片段,但可能無法達到最佳的擴增效果[43]。因此大多數(shù)情況下,需人工設(shè)計合成引物,這可能導(dǎo)致引物設(shè)計以及濃度優(yōu)化時間過長、引物合成成本消耗很大的問題。引物濃度優(yōu)化是由于引物競爭重組酶蛋白,一個靶標引物可抑制另一個靶標擴增,因此需要優(yōu)化每種引物的比例。此外,不同的DNA靶標,即使有相同的GC含量、引物熔解溫度和擴增子長度,也會以不同的效率進行擴增。若引物設(shè)計不夠好,會導(dǎo)致RPA在瓊脂糖凝膠電泳和側(cè)向流動分析試紙的情況下出現(xiàn)拖尾[44]。在擴增過程中沒有熱循環(huán)會增加形成引物二聚體的風(fēng)險,這也是許多目前等溫檢測中最具挑戰(zhàn)性的問題,研發(fā)新型等溫擴增技術(shù)專屬的引物設(shè)計軟件,該軟件若在達到這些等溫擴增技術(shù)引物本身要求的同時,又可自動規(guī)避引物二聚體形成,這將在一定程度上有效解決引物設(shè)計所帶來的一系列技術(shù)問題。

2.2 擴增產(chǎn)物需純化

重組酶等溫擴增技術(shù)擴增時需與重組酶、DNA聚合酶與單鏈DNA結(jié)合蛋白等多種酶充分接觸,共同作用,達到短時成倍擴大目的基因的效果。檢測結(jié)果判斷方式多樣,常見的有瓊脂糖凝膠電泳[45]、實時熒光定量[46]、側(cè)流層析試紙條[47]與CRISPR/Cas聯(lián)動系統(tǒng)[48]等。但反應(yīng)結(jié)束后,大量酶殘留在反應(yīng)體系中,在對RPA產(chǎn)物采用AGE檢測時,會導(dǎo)致電泳條帶出現(xiàn)抹帶現(xiàn)象,影響結(jié)果判別,因此需要進行產(chǎn)物純化[44],同時,通過加入酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1,體積比)進行純化處理,以除去蛋白雜質(zhì),吸取上清液進行后續(xù)檢測[49],同時還需要注意操作過程中氣溶膠的產(chǎn)生與擴散,防止交叉污染。

2.3 假陽性

近年來,分子生物學(xué)發(fā)展迅速,有著不需要控溫設(shè)備、檢測時間短等優(yōu)勢的等溫擴增技術(shù)現(xiàn)已開始逐步應(yīng)用于寄生蟲蟲體鑒定或病原檢測,并顯示出非常廣闊的應(yīng)用前景。需要注意的是,新型的等溫擴增技術(shù)克服了傳統(tǒng)檢測技術(shù)的缺點,但任何一項新興技術(shù)總有其相應(yīng)的不足之處。LAMP反應(yīng)受自身原理所限,需使用多個引物進行擴增,而這會增加引物與引物的非特異性擴增的風(fēng)險,導(dǎo)致假陽性結(jié)果[50]。多年來,其已與各種分子方法(如實時和多重檢測方法)相結(jié)合,并結(jié)合各種比色和視覺檢測方法,輕松識別陽性樣品[51]。目前較新穎的RPA亦不例外,如引物長度需控制在30 bp左右,若長度過短則會導(dǎo)致引物之間的非特異性結(jié)合,使結(jié)果出現(xiàn)假陽性結(jié)果。因此,在以后發(fā)展中需不斷優(yōu)化技術(shù)反應(yīng)條件,避免假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。

3 結(jié)論和展望

寄生蟲疾病仍是當(dāng)今社會關(guān)注的重點感染性疾病之一,傳統(tǒng)檢測技術(shù)的不成熟是導(dǎo)致寄生蟲病原從魚體到水源性食品,再到餐桌的重要原因。由于寄生蟲本身復(fù)雜的生物學(xué)特性限制,傳統(tǒng)病原學(xué)檢測技術(shù)目前仍是檢測寄生蟲的金標準,其不僅依賴檢測人員豐富的經(jīng)驗積累,有關(guān)的便攜式儀器也少之又少,無法實現(xiàn)真正意義上的快速檢測?；诜肿由飳W(xué)的新型等溫擴增技術(shù)是對寄生蟲疾病的早期預(yù)防與診斷重要保障,不僅可限制食源性寄生蟲類疾病的傳播,更能促進相關(guān)食品工業(yè)的發(fā)展。

隨著經(jīng)濟快速發(fā)展,人們健康意識不斷提高,對寄生蟲病診斷要求也不斷提高,研發(fā)快速新型檢測技術(shù)的重要性也愈加突顯。高靈敏度、準確、簡便及快速、高通量、低成本等溫擴增技術(shù)是水產(chǎn)品中寄生蟲檢測技術(shù)研發(fā)的趨勢。因此,可通過多種技術(shù)組合,優(yōu)勢互補,如將等溫擴增技術(shù)與生物傳感器、側(cè)流分析和微流體設(shè)備聯(lián)合使用將有望成為檢測寄生蟲的新方法,這有助于實現(xiàn)更加快速的分子診斷,但核酸提取等前處理步驟仍難以在實驗室外實施,仍需一個包含現(xiàn)場檢測所有必要工具的便攜式手提包,里面可裝有迷你離心機、移液管、手套、操作說明書等。這將為寄生蟲檢測領(lǐng)域的發(fā)展開辟一個新的局面,為我國寄生蟲檢測方法和技術(shù)的創(chuàng)新以及寄生蟲檢測能力的提高提供參考。